Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для разработки средств и методов биологической защиты.

Истории вирусологии известен не один эпизод инфицирования людей вирусами гриппа А(H1N1), антигенно родственными штамму вируса гриппа свиней. Вирус гриппа человека, подобный вирусу гриппа свиней, вызвавший самую крупную пандемию 20 века "Испанку" (1918-1919 гг.), нанес огромные материальные и моральные потери, унеся более 50 млн человеческих жизней [1]. В январе 1976 года в военном лагере Форд-Дикс (штат Нью-Джерси, США) была зарегистрирована вспышка заболеваний более 500 человек, вызванная штаммом, близким по антигенной структуре вирусу гриппа свиньи A/Swine/Taiwan/1/75 (H1N1). Однако как эта вспышка, так и последующие после 1976 г. периодически регистрируемые единичные случаи заражения людей от свиней не привели к широкому распространению этого вируса [2, 3].

15 и 17 апреля 2009 г. специалистами Центров по контролю за заболеваемостью и профилактике (CDC&P, Атланта, США) в Мексике была расшифрована вспышка свиного гриппа A(H1N1)swl, которая привела к быстрому распространению вируса в разных странах и континентах [4-6]. На 03.06.2009 г. общее число 21267 из них 125 с летальным исходом [7, 8]. Наибольшее число заболевших было зарегистрировано в США и Мексике.

По данным Минздравсоцразвития Российской Федерации в нашей стране впервые лабораторно подтвержденный случай заболевания вирусом гриппа A(HlNl)swl был зафиксирован 21.05.2009 г. у россиянина, вернувшегося из США с признаками ОРВИ и госпитализированного в 1-ую инфекционную больницу г.Москвы. Специалисты НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН выявили РНК вируса, а затем выделили вирус из носоглоточного смыва. Вирус был идентифицирован как вирус гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl, антигенно родственный вирусу гриппа свиней.

Объявление ВОЗ 11.06.2009 г. о начале новой пандемии, вызванной этой разновидностью вируса гриппа А, определило необходимость разработки средств индикации и идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиск эффективных средств и методов биологической защиты с использованием выделенного штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl.

При диагностике гриппозной инфекции наиболее часто используют серологические и молекулярно-биологические методы. Их чувствительность зависит как от особенностей самих методов, так и от выбранного антигенсодержащего субстрата. В настоящее время для выявления эпидемических штаммов вирусов гриппа широко применяются методы изоляции вируса в культуре клеток MDCK и реже - куриных эмбрионах (КЭ) с последующей идентификацией вируса в РТГА [9]. Кроме того, разработаны тест-системы для определения РНК вирусов гриппа А и В в носоглоточных смывах методом ОТ-ПЦР (с детекцией методом электрофореза или в режиме реального времени).

Необходимым элементом при создании диагностических тест-систем для идентификации возбудителя и диагностики вызванного им заболевания, создания эффективных средств защиты - противогриппозных вакцин, химиопрофилактических и лечебных препаратов, является наличие штамма вируса гриппа с выраженными патогенными и иммуногенными свойствами, а также обладающего высокой репродуктивностью в выбранных культурах.

Выделенный штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl не имеет аналогов в Российской Федерации. Его антигенная структура отлична от структуры эпидемических штаммов вирусов гриппа A(Н1N1) и наиболее близка антигенной структуре вирусов гриппа свиней (фиг.1).

Целью настоящего изобретения является получение штамма вируса гриппа A(H1N1)swl, антигенно родственного свиному вирусу гриппа и предназначенного для приготовления антигенсодержащего субстрата в РТГА, ИФА для идентификации данного возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, определения РНК вируса A(H1N1)swl в ОТ-ПЦР, приготовления вакцинных штаммов, а также оценки эффективности терапии и химиопрофилактики.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Российской Федерации в результате вирусологических исследований в мае 2009 г. выделен вирус гриппа A(H1N1)swl, антигенно родственный свиному, из носоглоточного смыва пациента, прибывшего из США и госпитализированного в г.Москве. Штамм A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl обладает биологическими характеристиками, позволяющими использовать этот вирус для специфического выявления РНК вируса гриппа человека A(H1N1)swl, подобного вирусу гриппа свиней с помощью ОТ-ПЦР, в конструировании иммунобиологических препаратов (диагностических тест-систем, иммуноглобулина, вакцин), а также для оценки противовирусной активности различных лекарственных препаратов и новых соединений.

В настоящем изобретении представлены антигенные, биологические и молекулярно-генетические свойства этого вируса. Принадлежность выделенного штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl, антигенно родственного свиному вирусу гриппа, доказана методом ОТ-ПЦР в реальном времени, разработанной в CDC&P для типирования и субтипирования вирусов гриппа свиней типа А. Идентификация вируса проведена также в РТГА с диагностической сывороткой к референс-штамму A(HswlN1) (1976 г.), приготовленной к вирусу гриппа свиней (ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов", г.Санкт-Петербург). Данные были подтверждены частичным секвенированием генов, кодирующих гемагглютинин и М-белки 22.05.2009. После заражения материалом от больного культуры клеток MDCK развитие цитопатического действия с полным разрушением монослоя отмечено через 72 часа. Инфекционная активность составила 6,51g ТЦИД₅₀ (тканевая цитопатическая инфекционная доза).

Пример выполнения

Отбор пациентов и взятие материала (носоглоточные смывы, кровь) от пациентов с отягощенным эпиданамнезом.

Изоляцию вирусов гриппа проводили из носоглоточных смывов от заболевших традиционными методами: на культуре клеток MDCK с добавлением 2 мкг/мл ТРСК-трипсина ("Sigma -Aldrich", США) и в полостях (амнион и аллантоис) 9-11 дневных КЭ. Для индикации вируса использовали 0,75% взвесь эритроцитов человека 0(1) группы крови и 0,5% эритроциты кур.

Выявление РНК вируса гриппа проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени, разработанным CDC&P для типирования и субтипирования вирусов гриппа свиней типа A.

Вирусы: A/California/04/2009 (H1N1)swl, выделенный на культуре клеток MDCK и A/California/07/2009 (H1N1)swl, выделенный на КЭ, любезно предоставлены сотрудниками CDC&P, Атланта, США; эталонный штамм гриппа свиней из Государственной коллекции вирусов - А/свинья/Висконсин/67(H1N1).

Сыворотки. Использованы специфические сыворотки к эпидемическим эталонным штаммам вирусов гриппа - A(H1N1), A(H3N2), В/Флорида/4/2006 (линии В/Ямагата-подобных), В/Малайзия/2506/2004 (В/Виктория-подобных) из диагностического набора ВОЗ, а также к вирусу гриппа свиней (1976 г.) - A(HswlN1) (ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов", г.Санкт-Петербург). Перед постановкой РТГА для удаления неспецифических ингибиторов сыворотки обработаны ферментом - нейраминидазой нехолерных вибрионов (RDE, Япония) и прогреты при 37°C в течение 30 минут.

Типирование изолятов проводили в РТГА по общепринятой методике с диагностическими сыворотками к сезонным вирусам гриппа A и B и сывороткой к вирусу гриппа A(HswlN1), а также постановкой ОТ-ПЦР в реальном времени, что позволило субтипировать вирусы гриппа А и дифференцировать новый вирус гриппа свиней A(H1N1).

Секвенирование генома. Выделение РНК проводили стандартным методом с применением фенола и изотиоционата натрия. Определение первичной нуклеотидной последовательности фрагментов ПЦР проводили методом Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3130 («Applied Biosystems», США) согласно рекомендациям производителя. Анализ нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей проводили с использованием пакета прикладных программ Lasergene(«DNASTAR Inc.», США).

Определение инфекционных титров вируса проводили заражение культуры клеток MDCK и 9-дневных куриных эмбрионов 10-кратными разведениями вируса, с последующим инкубированием при 37°C в течение 48-72 часов. После постановки реакции гемагглютинации проводили расчет инфекционных титров по методу Рида и Менча, определяя эмбриональную инфекционную дозу (ЭИД₅₀) и ТЦИД₅₀.

Изучение чувствительности вируса к химиопрепаратам проводили инфицированием монослоя культуры клеток MDCK 96-луночных панелей в присутствии/отсутствии таких препаратов, как ремантадин, арбидол, рибавирин (в концентрациях - 1,25-20 мкг/мл) и ингавирин (50,0-500,0 мкг/мл) в течение 24 часов, с последующим учетом результатов постановкой ИФА (1). Чувствительность к озельтамивиру определяли при анализе нуклеотидной последовательности гена нейраминидазы вируса (NA) в положении 274.

Родословная штамма представлена на схеме (фиг.2).

Число пассажей к моменту паспортизации - 1.

Характеристика штамма A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl

A. Особенностями выделенного штамма являются:

i) различия в антигенных свойствах поверхностных белков от других эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H1N1);

ii) изоляция вирусов через 72 часа против стандартных 48 часов для вирусов гриппа этого подтипа;

iii) одинаковое взаимодействие с эритроцитами человека и кур в реакции гемагглютинации(РГА), в отличие от большинства современных эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) [10];

iiii) возможность перехода вируса, первично изолированного на культуре клеток MDCK, на куриные эмбрионы, инфекционный титр через 72 часа после инфицирования составил 5,5 lg ЭИД₅₀. Большинство современных штаммов вируса гриппа А не обладают такой способностью [10].

Б. Для полученного штамма характерно:

1. высокая способность продуцироваться как в культуре клеток MDCK, так и в КЭ: выделен в культуре клеток MDCK и/или из амниотической полости 9-10-дневных куриных эмбрионах (КЭ) через 72 часа при 37°C после заражения. Изолированные вирусы характеризовались титром 1:8-1:16 AE. Инфекционный титр в КЭ через 72 часа составил 7,0 lg ЭИД₅₀, а в MDCK - через 48 часов составлял 6,5 lg ТЦИД₅₀;

2. термолабильность гемагглютинина при нагревании в течение 1 часа при 56°C;

3. при типировании гемагглютинирующего изолята в РТГА установлено, что диагностическая сыворотка A(HswlN1), приготовленная к вирусу гриппа свиней (1976 г.) - A(HswlN1) ингибировала гемагглютинирующую активность изолята до титра 1:80 при отсутствии взаимодействия со специфическими сыворотками к сезонным вирусам гриппа A и B. При этом гомологичные титры составляли 1:320-1:10240 (фиг.1);

4. отсутствие патогенности в модельных опытах: не вызывает гибели белых крыс при подкожном, внутримышечном, внутрибрюшинном способе введения;

5. контроль контаминации: штамм не контаминирован микрофлорой, грибами, посторонними вирусами;

6. способ лиофилизации, стандартный для вирусов гриппа. Культуральную или эмбриональную вируссодержащую жидкость в условия вакуума (1-5 мкм) замораживают при -70°C в течении 4-6 часов, затем температуру повышают до 20°C, далее следует досушивание в течении 10-16 часов, закупорка флаконов и облицовка алюминиевыми колпачками. После лиофилизации вирус сохранял свою антигенную и инфекционную активность.

В. Иммуногенные свойства штамма: гомологичный титр иммунной сыворотки, полученной на крысах, составляет 1:160 (фиг 3). Антитела сыворотки взаимодействовали с пандемическими вариантами A(H1N1)swl, изолированными ранее в США, а также позднее в России. Взаимодействие антител со штаммом А/свинья/Висконсин/1/79 составило 1/16 гомологичного титра сыворотки, что свидетельствует о значительных различиях в гемагглютининах вируса гриппа свиней и вирусов гриппа человека A(H1N1)swl.

Г. Чувствительность штамма к этиотропным лечебным препаратам:

выявлена его резистентность к ремантадину, высокая чувствительность к озельтамивиру, арбидолу и рибавирину, при средней активности - к ингавирину (фиг.4). Аналогичные данные получены в отношении референс-штаммов A(H1N1)swl, выделенных от людей - A/California/04/2009 и A/California/07/2009 и изолированного от свиньи - А/свинья/Висконсин/67.

Д. Секвенирование полного генома вируса A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl выявило аминокислотные замены в вирионных белках, отличающие штаммы A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl, A/New York/3205/2009 и A/California/04/2009 (H1N1) (фиг.5). В белках Ml, М2 и РВ2 аминокислотных замен при сравнении со штаммом A/California/04/2009(H1N1) не обнаружено. Из анализа первичной последовательности генов московского штамма однозначно следует его большее родство со штаммом, изолированным в Нью-Йорке, по сравнению с Калифорнийским штаммом вируса. Уникальной заменой только для штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl и не обнаруженной ни у одного другого опубликованного в GenBank к настоящему времени штамма, можно считать значащую замену в NA-гене кодона GAC на GGC, что привело к замене Asp на Gly в позиции 451.

Штамм A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl депонирован 24 мая 2009 г. в Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им Д.И.Ивановского РАМН, номер депонента ГКВ-2452. Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl (ГКВ №2452), впервые изолированный на территории РФ, получен заражением культуры клеток MDCK биологическим материалом от больного с признаками гриппозной инфекции, не типичной для сезонного гриппа, его антигенная структура отлична от структуры эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H1N1) и наиболее близка антигенной структуре вирусов гриппа свиней, характеризуется высокой способностью репродуцироваться в культуре клеток MDCK и куриных эмбрионах, пригоден для получения диагностических и вакцинных препаратов, оценки противовирусной активности различных препаратов и новых соединений. Штамм может быть использован в вирусологических, серологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах для специфического выявления: РНК вируса гриппа человека, подобного вирусу гриппа свиней A(H1N1) - с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), антител к нему - в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и иммуноферментном анализе (ИФА), а также для разработки и создания средств защиты и лечения населения.

Литература

1. Taubenberger J.K., Reid А.Н., Kraft А.Е. et al. Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish influenza virus". // Science. - 1997. - V.275. - P.1793-1796.

2. Patriarca P.A., Kendal A.P., Zakowsky P.C. et al. Lack of significant person-to-person spread of swine influenza-like virus following fatal infection in an immunocompromised chold. // Am. J.Epidem. - 1984. V.119. - N.2. - P.152-158.

3. Schulze I.T., Fitch W.M., Ludwig S. et al. Evolution of pig influenza viruses. // Virology. - 1991. - V.183. - P.61-73.

4. Shinde V., Bridges C.B., Uyeki T.M. et al. Triple reassortants swine influenza A(H1) in humans in the United States, 2005-2009. // N.Engl.J.Med. - 2009. - 361. - DOI:10.1056/NE J.Moa093812.

5. Update: Swine A(H1N1) infection in two children - southern California. March-April 2009. // CDC. Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR). - 2009. - Vol.58. - N.17. - P.400-402.

6. Update: Novel influenza A(H1N1) virus infections - worldwide, May 6, 2009. // CDC. Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR). - 2009. - Vol.58. - N.17. - P.453-457.

7. http://www.who.int/csr/disease/swinefluenza/index.html

8. Jordan H., Mosquera M., Nair H., France A. Swine origin influenza A(H1N1) virus infection in a school - New York City, April 2009. // http://www.cdc.gov.mmwr.preview/mmwrhtml/mm58d0430al.htm

9. Бурцева Е.И., Шевченко Е.С., Ленева И.А. и др. Чувствительность к ремантадину и арбидолу вирусов гриппа, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в России в сезоне 2004-2005 гг. // Вопр. вирусол. - 2007. - N.2. - С.24-29.

10. Иванова В.Т., Матюшина P.O., Слепушкин А.Н. и др. Эпидемические штаммы вирусов гриппа A и B в сезоне 2005-2006 гг. в России. // Вопр. вирусол. - 2008. - №4. - С.13-18.