Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ СУММЫ КИСЛОТ В КОМПЛЕКСНОЙ ЭКСТРАКЦИОННОЙ ПЕРЕРАБОТКЕ ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ ПИХТЫ СИБИРСКОЙ (Abies Sibirica)

Изобретение относится к способам получения биологически активных веществ (БАВ) экстракцией возобновляемого растительного сырья и последующей химической модификацией экстрактивных. Конкретно, к переработке древесной зелени (ДЗ) пихты сибирской (Abies Sibirica) - многотоннажного отхода при заготовке древесины - комплексной экстракционной технологией с получением нового биологически активного продукта (суммы высших алифатических, арилкарбоновых и фенолкарбоновых кислот) наряду с известными ранее: пихтовым маслом, суммой тритерпеновых кислот (действующим веществом росто- и иммуностимулятора с/х растений «Новосил» [RU 2108803]), исчерпывающе гидролизованной липидной фракцией (действующим веществом провитаминной добавки к корму с/х птицы [RU 2006138542]), фракцией биоактивных моно- и олигосахаров, полисахаридовов и флавоноидов (действующим веществом провитаминной добавки к корму с/х птицы [RU 2007123376]).

Задачей изобретения является получение новых биологически активных веществ из древесной зелени пихты при ее комплексной переработке.

Поставленная задача решается тем, что целевой продукт - сумму биологически активных веществ - получают из остатка гидролизата, образующегося в качестве отхода после выделения исчерпывающе гидролизованной липидной фракции из суммы продуктов омыления фракции нейтральных липидов водно-спиртовой щелочью по [RU 2006138542]. Установлено, что получаемая сумма кислот является росто- и иммуностимулятором с/х растений с фунгицидной активностью.

Прототип заявляемому - способ получения биологически активных веществ из древесной зелени пихты сибирской [RU 2006138542]. Прототип предусматривает измельчение воздушно-сухой ДЗ пихты, обработку ее несмешивающимся с водой экстрагентом - метил-трет-бутиловым эфиром, отделение органического экстракта от ДЗ пихты, промывку его водным раствором щелочного агента, разделение водно-щелочного и органического слоев, выделение из органического слоя фракции нейтральных липидов последовательно отгонкой экстрагента и летучих компонентов (пихтового масла) в вакууме при остаточном давлении 0,1-0,3 ата и температуре 50-90°С, а из водно-щелочного слоя - суммы тритерпеновых кислот подкислением с последующими экстракцией метил-трет-бутиловым эфиром и упариваем экстракта. Далее по способу-прототипу проводят частичный или исчерпывающий гидролиз фракции нейтральных липидов кипячением с водно-спиртовой щелочью и выделение нейтральных компонентов гидролизата - исчерпывающе гидролизованной липидной фракции - двукратной экстракцией метил-трет-бутиловым эфиром с последующей 2-3-кратной отмывкой полученного органического слоя водой до нейтральной реакции и упариванием.

Кипячение фракции нейтральных липидов с водно-спиртовой щелочью приводит к исчерпывающему гидролизу сложных эфиров алифатических, арилкарбоновых и фенолкарбоновых кислот и высвобождение из них в свободном состоянии алифатических, ди- и тритерпеновых спиртов, стеринов, а также собственно кислот и фенолов. Продукт, получаемый по способу-прототипу, содержит лишь ту часть из этих соединений, которые при взаимодействии со щелочью не образуют водорастворимые продукты солевой или иной природы. Действительно, выход исчерпывающе гидролизованной липидной фракции составляет 59% от первоначального веса подвергнутой омылению фракции нейтральных липидов. Таким образом, недостатком способа-прототипа является неполное извлечение из гидролизата омыленных экстрактивных веществ ДЗ пихты - потеря в отходах веществ кислого характера.

Целевой продукт настоящего изобретения - биологически активные соединения (сумму кислот) - получают из остатка гидролизата фракции нейтральных липидов после извлечения из него исчерпывающе гидролизованной липидной фракции по прототипу [RU 2006138542]. Для этого остаток (щелочной водно-спиртовый раствор кислот и фенолов) подкисляют до значения pH 2, двукратно экстрагируют метил-трет-бутиловым эфиром, объединенный органический экстракт промывают водой до нейтральной реакции и отгоняют экстрагент в вакууме при остаточном давлении 0,1-0,3 ата и температуре 50-90°С. Таким образом, основное отличие от прототипа заключается в получении дополнительно суммы кислот в количестве 35% от веса фракции подвергнутых гидролизу нейтральных липидов. В совокупности, в заявляемом способе с использованием простого приема и задействованного в экстракционной технологии оборудования получен дополнительно к известным новый продукт и установлена его биоактивность, чем достигнута полезная утилизация всего количества экстрактивных веществ, извлекаемых из ДЗ пихты экстрагентом органической природы.

Целевой продукт, получаемый по примеру 1, представляет собой нелетучую зелено-коричневую мазеобразную массу, содержащую, по данным ХМС, смесь алифатических высших кислот с примесью ди- и тритерпеновых соединений и других природных веществ.

Целевой продукт образует эмульсии различных концентраций в воде с эмульгаторами, разрешенными к применению в сельском хозяйстве. Эмульсии легко дозируются и удобны для предпосевной обработки посадочного материала замачиванием, а также опрыскиванием растений в любой фазе периода вегетации. Лабораторные и расширенные испытания (см. примеры 2-7) показали, что целевой продукт обладает полезной биоактивностью и может использоваться в качестве действующего вещества ростостимулирующих и иммуномодулирующих препаратов с фунгицидными свойствами в растениеводстве, обеспечивая по отношению к контролю увеличение всхожести семян сельскохозяйственных культур на 15-35%, общую и товарную урожайность на 15-50%, снижение зараженности фитопатогенной микрофлорой, т.е. по полезной биологической активности сопоставим с используемым в практике препаратом «Новосил», действующим веществом которого являются природные тритерпеновые кислоты из ДЗ пихты.

Таким образом, предлагаемое изобретение способствует:

- совершенствованию комплексности, повышению рентабельности и экологической целесообразности экстракционной технологии переработки ДЗ пихты путем выделения нового БАВ из отходов производства исчерпывающе гидролизованной липидной фракции (остатка гидролизата фракции нейтральных липидов);

- диверсификации направлений использования в сельском хозяйстве БАВ, получаемых в комплексной экстракционной технологии переработки ДЗ пихты, путем установления специфической биоактивности новых продуктов, образующихся при технологически простой обработке (гидролизе) экстрактивных природных веществ.

Способ получения суммы кислот и эффективность ее применения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Воздушно-сухую измельченную зелень пихты (80 кг) в мешках из бязи помещают в экстрактор, приливают трет-бутилметиловый эфир (350 л) из мерника и настаивают при комнатной температуре в течение 8 час. Экстракт сливают (220 л), приливают свежий трет-бутилметиловый эфир (260 л) и вновь настаивают в течение 8 час. Сливают вторую порцию экстракта (260 л). Экстракты объединяют и обрабатывают 2%-ным водным раствором едкого натра (150 л) при перемешивании в аппарате с мешалкой. Смесь перемещают в делительную воронку-отстойник, дожидаются полного расслоения и разделяют слои.

Органический экстракт порциями загружают в перегонный аппарат и отгоняют трет-бутилметиловый эфир при разрежении 0,1-0,3 ата (вакуум водокольцевого насоса) и температуре в кубе не выше 50°С. Получают липидную фракцию экстракта (4,8 кг), освобожденную от экстрагента и содержащую летучие компоненты (пихтовое масло).

Водно-щелочной слой в делительной воронке подкисляют 5%-ной соляной кислотой до pH 2, отделяют формирующуюся органическую фазу, концентрированием (сушкой) которой в техническом вакууме получают сумму тритерпеновых кислот (4,9 кг) в виде серо-зеленой стекловидной массы после охлаждения.

Накапливают липидную фракцию экстракта (48 кг), помещают в емкостной аппарат для гидродистилляции, добавляют воду (48 л), при перемешивании нагревают до 50-80°С и в течение 1-3 часов отгоняют летучие компоненты с водяным паром при разрежении 0,1-0,3 ата (вакуум водокольцевого насоса). Гидродистиллят разделяют на водный и органический (пихтовое масло, 12 кг) слои, а из куба сливают горячей частично гидролизованную липидную фракцию зелено-коричневого цвета (31 кг).

Частично гидролизованную липидную фракцию (31 кг) растворяют в этиловом спирте (39 л), добавляют водный раствор КОН (10 кг в 11 л воды) или NaOH (7.8 кг на 11 л воды), нагревают при перемешивании в аппарате с обратным холодильником и кипятят (т.кип. ~78°С) в течение 2 час, затем массу концентрируют отгонкой водно-спиртовой смеси на роторном испарителе в вакууме водокольцевого насоса при температуре не выше 80°С, остаток экстрагируют дважды трет-бутилметиловым эфиром (по 150 л), объединенный экстракт промывают водой до pH 7-8 и концентрируют полной отгонкой азеотропа воды и эфира в вакууме водоструйного насоса. Получают 18,3 кг (выход 59%) исчерпывающе гидролизованной фракции консистенции густого меда желто-коричневого или темно-оранжевого цвета.

Объединенный остаток (водно-спиртовый слой после экстракции и промывные воды) подкисляют 5÷10%-ным раствором соляной кислоты до pH 2 и экстрагируют дважды трет-бутилметиловым эфиром (по 75 л), объединенный экстракт промывают водой (2×50 л), расслаивают и органическую фазу концентрируют полной отгонкой азеотропа воды и эфира в вакууме водокольцевого насоса при температуре не выше 80°С. Получают 10.9 кг (выход 35%) целевого продукта мазеобразной консистенции зелено-коричневого цвета.

ХМС-анализ полученного продукта показал наличие в нем следующих кислот: тетрадекановой, пентадекановой, гексадекановой, 14-метилгексадекановой, гептадекановой, олеиновой, линолевой (включая изомеры), линоленовой (включая изомеры), 14-октадеценовой, стеариновой, нонадекановой, эйкозатриеновой, 5, 11, 14, 17-эйкозатетраеновой, 11,14-эйкозадиеновой, 11-эйкозеновой, эйкозановой, левопимаровой, абиетиновой, дегидроабиетиновой, генэйкозановой, докозановой, трикозановой, тетракозановой, гексакозановой, октакозановой, триаконтановой, дотриаконтановой, тетратриаконтановой. Основными являются олеиновая (до 25%) и линолевая (до 20%, включая изомеры). Продукт содержит относительно высокое (в сумме до 10%) количество кислот с 20 атомами углерода и от 0 до 4 двойных связей, а также предельных кислот с числом атомов углерода от 23 до 34 (до 15%). Кроме того, обнаружены небольшие количества (до 3%) нейтральных компонентов: β-ситостерина, токоферола и фитола, а также неидентифицированные компоненты (до 5%), спектры которых отсутствуют в базах данных.

Испытания эффективности применения целевого продукта, полученного по примеру 1, в качестве росто- и иммуностимулятора с фунгицидными свойствами проведены совместно с ГНУ СибНИИРС СО РАСХН в сравнении с контролем, а также эталоном - препаратом «Новосил», действующим веществом которого является выделенная из ДЗ пихты сибирской сумма тритерпеновых кислот [RU 2108803]. Целевой продукт испытывали в препаративной форме (в примерах 2-7 условное наименование препарата КЛИПС - кислые липиды пихты сибирской), включающей эмульгатор и воду, при этом концентрация действующего вещества испытуемого препарата и «Новосила» были равны. Исследовано влияние применения испытуемого препарата на лабораторную всхожесть семян (пример 2), показатели урожайности сельскохозяйственных культур (примеры 3, 4, 7) и подавление грибковых заболеваний (примеры 5, 6, 7).

Пример 2.

Объекты исследования: горох сорта Новосибирец зернового направления, листочкового морфотипа с индетерминантным типом роста стебля и пшеница сорта Скала.

Вариант обработки: замачивание семян в растворах препаратов (5 мл 5%-ного раствора препарата на литр воды), время экспозиции - 15 мин.

Контроль - вода.

Пример 3.

Объект исследования: чеснок яровой (богар).

Вариант обработки: замачивание посадочного материала в растворах препаратов (5 мл 5%-ного раствора препарата на литр воды), время экспозиции - 15 мин, посадка - 6 мая) и опрыскивание растений в фазу массового образования и нарастания листьев.

Контроль - вода.

Пример 4.

Объект исследования: картофель сорта Эскорт.

Варианты обработки: предпосевное замачивание посадочного материала и опрыскивание. Контроль - вода.

Пример 5.

Объект исследования: картофель сорта Эскорт, инфицированный патогенным грибом Phytoftora Infestans.

Вариант обработки: замачивание.

Контроль (К-1) - зараженные клубни без обработки.

Примечание: значение 0-1 - высокая устойчивость, 1-1.7 - средняя устойчивость, выше 2.0 - низкая устойчивость.

Пример 6.

Объект исследования: пшеница яровая сорта Новосибирская 20.

Листовые болезни оценивали в фазу колошения растений (период проявления пятнистостей).

Вариант обработки: опрыскивание растений в фазу кущения (вторая декада июня). Норма расхода 5%-ных растворов препаратов составляет 100 мл/300 л воды/га. Результаты усреднены по трем параллельным опытам.

Контроль - вода.

Пример 7.

Объекты исследования: картофель сортов Адретта (среднеустойчивый к фитофторе) и Алена (неустойчивый к фитофторе).

Инфекционный фон для проведения исследований создавали с помощью местной популяции Phytoftora Infestans. Учет развития болезни производили на 3, 12, 24 и 42 день после обработки. В конце вегетации учтен урожай с делянки и с одного куста.

Вариант обработки: опрыскивание растений в фазу активного цветения (первая декада июля). Норма расхода 5%-ного растворов препаратов - 2 л/1000 л воды/га. Результаты усреднены по трем параллельным опытам.

Контроль - вода.