Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus - 4F11, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ИММУНОРЕАКТИВНОЕ С БЕЛКОМ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ШТАММА virus A/duck/Novosibirsk/56/05 Н5N1

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии и касается получения нового штамма гибридных клеток Mus. Musculus (4F11) - продуцента моноклональных антител к белку гемагглютинина вируса гриппа птиц A(H5N1), которые можно использовать для дифференциальной диагностики вирусов гриппа птиц серотипа А/Н5.

В последние годы вирус гриппа птиц A(H5N1) вызвал эпизоотии среди птиц в юго-восточной Азии, а также вспышки болезни домашних птиц в других регионах мира. При этом некоторые варианты вирусов H5N1 обладали способностью инфицировать людей, вызывая тяжелейшие заболевания, часто со смертельным исходом. По данным ВОЗ, в мире зарегистрировано 373 случая заражения человека вирусом H5N1, 236 человек умерло [1]. На территории Российской Федерации (РФ) вирусы гриппа птиц серотипов H5N2 и H5N3 были выделены как от диких, так и от домашних птиц [2]. Большинство вирусов характеризовались слабой патогенностью. В 2005 году впервые на территории РФ были изолированы высокопатогенные варианты вируса гриппа A(H5N1). Все штаммы, выделенные в Новосибирской области, детально изучены в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте вирусологии им. Д.И. Ивановского Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН), два из них были депонированы в Государственную коллекцию вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, а высокопродуктивный штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1 запатентован (RU 2309983, приоритет 25.11.2005) [3, 4]. В 2006-2007 гг. были депонированы в ГКВ еще 16 штаммов вируса гриппа H5N1, выделенных как в азиатской, так и в европейской частях РФ [5, 6]. Филогенетический анализ генома этих штаммов установил их принадлежность к высокопатогенным вирусам гриппа птиц Цинхай-Сибирского генотипа [7].

Штаммы вирусов гриппа птиц, циркулирующих в Юго-Восточной Азии, хорошо изучены [8-10]. Анализ РНК-генома, антигенной и трехмерной структуры гемагглютинина Н5 выявил значительные различия между слабопатогенным штаммом A/duck/Singapore/3/97 и выделенным позже от человека высокопатогенным штаммом A/Vietnam/1203/04 [11]. Это свидетельствует о необходимости постоянного контроля за эволюционными изменениями вируса гриппа птиц Н5 для усовершенствования диагностических тестов и разработки адекватных вакцин. Одним из экспериментальных инструментов для анализа антигенной структуры и свойств вирусных белков являются моноклональные антитела (МКА). Новым перспективным направлением в биотехнологии является создание гуманизированных антител. На основе мышиных МКА методом генной инженерии конструируются антитела «мышь-человек», Fab-фрагменты которых содержат гипервариабельные участки специфических иммуноглобулинов мышиных МКА, обладающих вируснейтрализующей активностью, константная часть (Fc-фрагменты) происходят из иммуноглобулинов человека. Так как гуманизированные антитела содержат минимальное количество фрагментов мышиных антител, их можно использовать для профилактики и лечения человека. Так, в работе B.J.Hanson et al. на основе двух МКА к вирусу гриппа A/H5N1 (штаммы A/Vietnam/1203/04 и А/HK/213/03) были сконструированы гуманизированные антитела, при этом их вируснейтрализующая активность сохранялась [9]. Профилактический и терапевтический эффект гуманизированных антител исследовали в опытах на мышах: разные количества МКА вводили до или после заражения летальной дозой вируса A/H5N1. Оказалось, что оба МКА были эффективны в профилактической схеме; в лечебной схеме одно из антител было более активно и показало полную протекцию от заболевания в концентрации 1 мг/кг веса [9]. Таким образом, пассивная иммунизация может представлять собой альтернативную стратегию как для профилактики, так и для лечения пандемических вариантов вируса гриппа A/H5N1 человека.

Известны зарубежные коллекции мышиных МКА к вирусу гриппа птиц A/H5N1, продуцируемые штаммами гибридных клеток животных. С этой целью мышей иммунизировали рекомбинантным белком гемагглютинина или ДНК-плазмидой, кодирующей белок гемагглютинина [12, 13].

Аналоги штаммов гибридных клеток животного Mus. Musculus - продуцентов МКА к высокопатогенному вирусу гриппа птиц A/H5N1, циркулирующему на территории Российской Федерации, неизвестны.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в получении гибридомы, продуцирующей МКА к высокопатогенному вирусу гриппа птиц штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1. Полученные МКА могут быть использованы для диагностики, профилактики и лечения.

Наиболее близким аналогом может служить штамм гибридных клеток Mus. Musculus, полученный к рекомбинатному белку гемагглютинина вируса A/goose/Guangdong/97 (H5N1) [12]. К существенным признакам изобретения, совпадающим с признаками прототипа, относятся следующие:

1. Штамм гибридных клеток 4F11, продуцирующий моноклональные антитела к гемагглютинину вируса гриппа птиц А/Н5, получен методом гибридомной технологии при иммунизации мышей BALB/c.

2. МКА 4F11 взаимодействуют с гомологичным вирусом в биологических и иммунохимических реакциях.

3. Штамм гибридных клеток 4F11 продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса G (IgG).

К существенным признакам изобретения, отличающихся от признаков прототипа, можно отнести следующие.

1. Иммунизацию животных проводили препаратом вируса гриппа птиц A/H5N1 (штамм A/duck/Novosibirsk/56/05), выделенным на территории РФ, который относится к высокопатогенным вирусам гриппа птиц A/H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа, отличающихся от вирусов гриппа птиц A/H5N1, использованных в прототипах.

2. Для иммунизации животных использовали очищенный и инактивированный препарат вируса гриппа птиц, тогда как в прототипе мышей иммунизировали рекомбинантным белком гемагглютинина.

3. Штамм гибридных клеток 4F11 продуцирует МКА, относящиеся к субклассу IgG2a в отличие от штамма прототипа, продуцирующего МКА субкласса IgG1.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма гибридных клеток 4F11, продуцирующих МКА к вирусу гриппа птиц A/H5N1 (штамм A/duck/Novosibirsk/56/05), выделенного в Новосибирской области в 2005 году (RU 2 309 983, приоритет 25.11.2005) [4].

Указанный технический результат достигается путем гибридизации культивируемых клеток миеломы мыши Sp2/0 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных очищенным и инактивированным препаратом вируса гриппа птиц A/H5N1 (штамм A/duck/Novosibirsk/56/05), который был получен в результате культивирования и очистки вируса.

Заявляемый штамм гибридных клеток Mus. Musculus 4F11 получен в Государственном учреждении научно-исследовательском институте вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН) и депонирован в Коллекции перевиваемых клеточных линий

ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 8/2/2. Авторское название гибридомной клеточной линии - 4F11.

Штамм Mus. Musculus 4F11 характеризуется следующими признаками:

Родословная штамма. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus. Musculus L. (4F11) был получен в результате слияния мышиной миеломы Sp2/0 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных очищенным и инактивированным препаратом вируса гриппа птиц A/H5N1 (штамм A/duck/Novosibirsk/56/05). В качестве сливающего агента использовали реагент ПЭГ-ДМСО фирмы (Hibri-Max, Sigma США). Гибридные клетки культивировали на селективной среде ГАТ, затем дважды клонировали методом предельных разведений, используя в качестве клеток-кормилок перитонеальные макрофаги мышей BALB/c.

Число пассажей к моменту депонирования составило 8-12.

Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.

Морфологические признаки. Культура клеток состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с крупными ядрами.

Культуральные свойства. В качестве ростовой среды для культивирования использовали среду RPMI-1640, содержащую 20% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), 4,5 г/л глюкозы, 3 мМ глутамина, 0,2 ЕД/мл инсулина, 50 мкг/мл гентамицина. Характер роста - стационарная суспензия, метод снятия - встряхивание. Частота пассирования - 2-3 суток. Посевная доза - 200 тыс. клеток в 1 мл. Кратность рассева - 1:2-1:3.

Культивирование гибридомы в организм животного. Самкам мышей BALB/c (виварий ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН) предварительно вводят внутрибрюшинно 0,5 мл пристана (Sigma). Через 14-21 день животным прививают 10⁷ /мл гибридных клеток в брюшную полость мышей. Через 7-14 суток формируется асцитная опухоль. От одного животного можно получить 3-5 мл асцитной жидкости, содержащей МКА. Гибридома прививается в 100% случаев.

Криоконсервирование гибридомы. За 24 часа до замораживания гибридомы пересевают 1:2. Осажденные центрифугированием (1000 об/мин, 10 мин) клетки суспендируют в криозащитной среде (90% ЭТС, 10% ДМСО) и разливают по ампулам в концентрации 3-5 млн/мл по 1-1,8 мл. Хранят 24 часа при -70С°, затем переносят в жидкий азот.

Характеристика иммуноглобулинов. Продуцируемые гибридомой 4F11 МКА относятся к классу IgG, субкласс - IgG2a. Определение класса иммуноглобулинов, продуцируемых МКА 4F11, проводили методом ИФА с помощью набора "Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit" (Boehringer Mannheim, Германия). В лунки панели сорбировали очищенный препарат вируса гриппа птиц A/duck/Novosibirsk/56/05 в концентрации 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и инкубировали с МКА в серийных разведениях. После отмывки добавляли конъюгаты - антимышиные антитела к различным классам (IgG, IgA, IgM) и субклассам (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3), иммуноглобулинов, меченные пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин. Показано, что продуцируемые гибридомой 4F11 МКА взаимодействовали только с конъюгатами против IgG и IgG2a (оптическая плотность более 1,0 для всех использованных разведений МКА), что позволило отнести их к классу IgG, субклассу IgG2a.

Методика получения заявляемого штамма

Иммунизация. Самок мышей линии BALB/c, полученных из питомника «Пущине» (Московская обл.), иммунизировали внутрибрюшинно 4-кратно с интервалом 2 недели в дозе 100 мкг антигена/мышь. Для первой иммунизации антиген вводили в смеси с полным адъювантом Фрейнда, для трех следующих - в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. Бустерную дозу (100 мкг антигена в физиологическом растворе, 0,1 мл) вводили внутривенно за 3 дня до выделения селезенки.

Слияние. Для слияния используют клетки селезенки мыши и клетки мышиной миеломы Sp2/0 в соотношении 1:5. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 1 мл раствора ПЭГ-ДМСО, состоящего из 45% ПЭГа с молекулярной массой 1450 и 10% ДМСО, (Hybri-Max, Sigma, США). После 3 мин паузы смесь центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. Осадок дважды отмывают средой без сыворотки и осадок растворяют в ростовой среде. Клетки распределяют в 96-луночные планшеты (Costar, США) по 100 мкл в лунку. Селекцию гибридных клеток проводят в среде ГАТ (Sigma, США), состоящей из питательной среды RPMI-1640, в которую добавлены 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США), 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ аминоптерина.

Отбор специфических гибридов осуществляли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

В качестве АГ в обеих реакциях использовали гомологичный вирус A/duck/Novosibirsk/56/05.

Пример 1. Определение активности МКА 4F11 при помощи твердофазного иммуноферментного анализа. 96-луночные панели (NUNC, Дания) сенсибилизировали очищенным препаратом вируса гриппа A/duck/Novosibirsk/56/05 в концентрации 2 мкг/мл, инкубировали с МКА в серийных разведениях. После отмывки добавляли конъюгат - антимышиные антитела, меченные пероксидазой хрена (DAKO, Дания). В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин (Sigma, США). Было показано, что титр МКА составил 1/10⁷.

Пример 2. Определение активности МКА 4F11 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). РТГА проводили с использованием человеческих эритроцитов I (0) группы по стандартной методике [14]. Доза вирусов гриппа человека и животных составляла 8 агглютинирующих единиц. Было установлено, что МКА 4F11 подавляют гемагглютинацию вируса гриппа птиц, штамм A/duck/Novosibirsk/56/05, в разведении 1/20480. Полученные данные приведены в Таблице.

Пример 3. Специфичность МКА 4F11 в отношении белков вируса гриппа птиц A/H5N1, штамм A/duck/Novosibirsk/56/05, определяли методом иммуноблота. Белки разделяли в 10% полиакриламидном геле и переносили методом электроэлюции на нитроцеллюлозу с диаметром пор 0,45 мкм ("Bio-Rad", США). Инкубацию с МКА проводили в течение 1 часа или 18 час на качалке при комнатной температуре. Результат реакции проявляли, обрабатывая полоски нитроцеллюлозы AT к Ig мыши, меченными пероксидазой (Sigma, США). В качестве отрицательного контроля использовали Sp2/0-асцитную жидкость в разведении 1/500, в качестве положительного контроля - сыворотку мышей, используемых для получения гибридом в разведении 1/500. Данные опытов показали, что МКА 4F11 взаимодействуют с тяжелой цепью гемагглютинина НА1 (М.м. 57 кДa).

Пример 4. Вируснейтрализующую активность МКА 4F11 изучали в реакции биологической нейтрализации. МКА прогревали при 56°С в течение 30 мин на водяной бане. Серийные разведения МКА инкубировали с вирусами гриппа А (инфекционная множественность 100 ТЦД₅₀) в течение 2 ч при 37°С и вносили в клеточную культуру СПЭВ или почки собаки (MDCK). Результаты учитывали через 72-96 часов, когда в инфицированной культуре, не обработанной МКА, развилось максимальное цитопатичское действие (ЦПД) [15]. Установлено, что МКА 4F11 нейтрализовали инфекционную активность вируса гриппа птиц, штамм A/duck/Novosibirsk/56/05, в разведении 1/20480. Полученные данные приведены в Таблице.

Пример 5. Изучение способности МКА 4F11 выявлять инфицированные клетки в реакции непрямой иммуннофлюоресценции (нИФ). Клетки СПЭВ заражали вирусом A/duck/Novosibirsk/56/05 с инфекционной множественностью 10-100 ТЦД₅₀. Через 24 часа после заражения клетки фиксировали охлажденным ацетоном в течение 30 мин. На фиксированные препараты наносили МКА 4F11 и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем промывали проточной водой и наслаивали антимышиную сыворотку, меченную ФИТЦ (DAKO, Дания). Показано, что МКА 4F11 были способны окрашивать клетки СПЭВ, инфицированные гомологичным вирусом гриппа птиц A/duck/Novosibirsk/56/05. Окраска вирусного АГ была выявлена в цитоплазме инфицированных клеток.

Пример 6. Изучение способности МКА 4F11 подавлять гемагглютинацию и нейтрализовать инфекционную активность различных вирусов гриппа птиц и человека. Для анализа свойств МКА использовали 5 штаммов вируса гриппа птиц серотипа А/Н5: патогенные штаммы вируса гриппа птиц A(H5N1), изолированные на территории России: A/duck/Novosibirsk/56/05, A/duck/Tuva/01/06, A/chicken/Moscow/2/07; А/Н5 антиген из диагностического набора ВОЗ 2003-2004 гг. (Н5 influenza kit, Атланта, США, VA 2710); эталонный штамм вируса гриппа птиц A/tern/South Africa/61 (H5N3). Кроме того, использовали вирусы гриппа птиц других серотипов: A/duck/Czechoslovakia/56 (H4N6), A/turkey/Massachusetts/65 (H6N2), A/turkey/Wisconsin/66 (H9N2), а также вирус гриппа человека A/Aichi/1/68 (H3N2). Результаты РТГА и реакции биологической нейтрализации (РБН) представлены в Таблице.

Вышеперечисленные свойства штамма гибридных клеток 4F11 позволяет заключить, что впервые на основе мышиной миеломы получена гибридома Mus. Musculus 4F11 - продуцент МКА к белку гемагглютинина высокопатогенного вируса гриппа птиц A/H5N1, штамм A/duck/Novosibirsk/56/05. Указанный вирус был выделен на территории РФ, в Новосибирской области в 2005 году и относится к «цинхайской» ветви. Штамм гибридных клеток позволяет получить мышиные иммуноглобулины класса IgG2a в количестве 2-5 мг очищенных антител из миллилитра асцитной жидкости. МКА специфично реагируют с вирусом гриппа птиц A/H5N1, штамм A/duck/Novosibirsk/56/05, в ИФА (титр составлял не менее 1/10⁷). МКА с высокой активностью тормозят гемагглютинацию всех изученных вирусов гриппа птиц серотипа А/Н5, циркулирующих как на территории РФ, так и эталонных штаммов, полученных из ВОЗ. Это позволяет использовать их для исследования тонкой антигенной структуры и эпитопной специфичности новых изолятов вируса гриппа птиц А/Н5, а также для дифференциальной диагностики вируса гриппа А/Н5. Активность МКА 4F11 в реакции нИФ дает возможность применять их для выявления вируса в мазках и отпечатках тканей больных и инфицированных птиц, животных и человека. Конструирование на основе МКА 4F11 гуманизированных антител дает возможность использования их для профилактики и лечения птичьего гриппа у людей, т.к. МКА обладают высокой вируснейтрализующей активностью.

Вышеуказанные свойства штамма Mus. Museums 4F11 отличают его от всех описанных ранее гибридом, продуцирующих МКА к белку гемагглютинина вируса гриппа птиц A/H5N1.

Источники информации:

1. Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO. 18 March 2008. (http://www.who.int/en).

2. Львов Д.К., Ямникова С.С., Федякина И.Т. и др. Экология и эволюция вирусов гриппа в России (1979-2002 гг.) // Вопр. Вирусол. - 2004. - Т.49, №3. - С.17-24.

3. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. и др. Изоляция штаммов вируса гриппа A/H5N1 от домашних и диких птиц в период эпизоотии в Западной Сибири (июль 2005 г.) и их депонирование в государственную коллекцию вирусов (08 августа 2005 г.) // Вопр. Вирусол. - 2006. - Т.51, №1. - С.11-14.

4. Метод первичной изоляции штаммов вируса гриппа А, штамм virus A/Duck/Novosibirsk/56/05 H5N1 для приготовления диагностических, профилактических и лечебных препаратов, для оценки противовирусной активности различных соединений. // Патент RU 2309983, приоритет 25.11.2005.

5. Львов Д.К., Прилипов А.Г., Щелканов М.Ю. и др. Молекулярно-генетический анализ биологических свойств высокопатогенных штаммов вируса гриппа A/H5N1, изолированных от диких и домашних птиц в период эпизоотии в Западной Сибири (июль 2005 г.) // Вопр. Вирусол. - 2006. - Т.51, №2. - С.15-19.

6. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. и др. Изоляция высокопатогенных (HPAI) штаммов вируса гриппа A/H5N1 от диких птиц в очаге эпизоотии на озере Убсу-Нур (июнь 2006 г.) и их депонирование в Государственную коллекцию вирусов РФ (3 июля 2006 г.) // Вопр. Вирусол. - 2006. - Т.51, №6. - С.14-16.

7. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г. и др. Молекулярно-диагностическая характеристика штамма A/chicken/Moscow/2/2007 (H5N1) из очага эпизоотии высокопатогенного гриппа А среди сельскохозяйственных птиц в Подмосковье (февраль 2007 г.) // Вопр. Вирусол. - 2007. - Т.52, №6. - С.40-47.

8. Chen H., Smith G.J.D., Li K. S. et al. Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: Implications for pandemic control. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2006. - 103 - P.2845-2850.

9. Hanson B.J., Boon A.C.M., Lim A.P.C. et al. Passive immunoprophylaxis and therapy with humanized monoclonal antibody specific for influenza A H5 hemagglutinin in mice. // Respiratory Research. - 2006. - V.7. - N1. - P.126-136.

10. Peiris J.S.M., de Jong M.D., Guan Y. Avian Influenza Virus (H5N1): a Threat to Human Health. // Clin. Microbiol. Rev. - 2007. - V.20. - N2. - P.243-267.

11. Webster, R.G., Govorkova E.A. H5N1 influenza-continuing evolution and spread. // N. Engl. J. Med. - 2006. - V.355. - N21. - P.2174-2177.

12. He Q., Velumani S., Du Q., Lim C.W., Ng F.K., Donis R., Kwang J. Detection of H5 Avian Influenza Virusesby Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using H5-Specific Monoclonal Antibody. Clin and vaccine immunology, 2007.p.617-623.

13. Horimoto Т., FukudaN., Iwatsuki-Horimito K., Guan Y., Lim W., Peiris M., Sugii S., Odagiri Т., Tashiro Т., Kawaoka Y. Antigenic Differences between H5N1 Human Influenza Viruses Isolated in 1997 and 2003. J. Vet. Med. Sci., 2004, 66(3), p.303-305.

14. Дерябин П.Г., Бутенко A.M., Бурцева Е.И. Реакция гемагглютинации и реакция торможения гемагглютинации. // В руководстве «Медицинская вирусология»./ Под ред. Академика РАМН Д.К.Львова. Москва. МИФ - 2008. - С.312-318.

15. Дерябин П.Г., Бутенко A.M. Реакция биологической нейтрализации. // В руководстве «Медицинская вирусология»./ Под ред. Академика РАМН Д.К.Львова. Москва. МИФ - 2008. - С.307-310.