Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕФЕРЕНС-ПАНЕЛИ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ТЕСТ-СИСТЕМ И ВАКЦИН ПРОТИВ ГЕПАТИТА В

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления панелей сывороток, содержащих антигены наиболее опасных вирусных инфекций, и в производстве тест-систем для определения антигенов в качестве контрольных положительных сывороток. Аттестованные содержания HBsAg в образцах референс-панели позволяют использовать эти стандартные материалы для контроля качества вакцины против гепатита В, в которых должно быть строго нормировано содержание HBsAg.

Известные приемы приготовления и аттестации сывороток, содержащих определенные количества специфических белков, должны быть использованы в совокупности при изготовлении сывороток с аттестованным уровнем концентрации HBsAg и требуют разработки:
- надежного способа приготовления неинфекционного препарата ВГВ;
- физико-химического способа определения концентрации HBsAg в сыворотке крови человека;
- подбора состава стабилизатора и режима лиофильного высушивания образцов референс-панели для получения препаратов с нормированной концентрацией HBsAg, остающейся неизменной в течение длительного времени в соответствии с требованиями Комитета экспертов ВОЗ к референс-материалам.

Сохранение постоянной концентрации специфического белка представляет сложную проблему. Дополнительная проблема, с которой приходится сталкиваться при аттестации количества HBsAg в сыворотке крови, заключается в том, что величина оптической плотности (ОП) одного и того же раствора меняется при использовании разных тест-систем и даже для одной тест-системы при использовании разных режимов анализа.

Например, стандартный образец (СО) института Р. Erlich субтипа ау, содержащий 0,9 МЕ/мл HBsAg, имеет в тест-системе "HBsAg, Labsystems" ОП=1,3 о. е. для режима инкубации А и ОП=0,9 о.е. для режима С. Тест "Wellcozyme HBsAg" фирмы "Murex" имеет пороговую чувствительность 0,08 нг/мл при инкубации образцов в течение ночи и чувствительность 0,17 нг/мл при инкубации 30 мин при 50^oС [3]. Кроме этого, в общем случае величина ОП раствора СО различна для разных разводящих растворов. Решение проблемы аттестации сывороток панели на содержание HBsAg предлагается осуществить следующим способом:
- использовать для создания референс-панели плазменный очищенный и рекомбинантный антиген, принадлежащий к различным субтипам с известным массовым содержанием HBsAg и не имеющий инфекционной опасности;
- в качестве разводящего раствора использовать пул сывороток здоровых доноров, которые не содержат маркеров основных инфекций и не подавляют существенно ОП HBsAg в ИФА относительно ОП забуференного физраствора, содержащего инертный белок для предотвращения "hook"-эффекта (например, ЗФР + 0,2% казеина);
- в качестве компонентов стабилизатора использовать вещества, не оказывающие влияние на уровень аналитического сигнала.

Основным критерием чувствительности диагностикумов для серологических анализов служит значение аналитического сигнала контрольной положительной сыворотки. При этом обязательным условием работоспособности тест-систем является уровень этого аналитического сигнала, который не должен быть ниже аттестованной величины.

Известны способы получения контрольных сывороток с нормированным уровнем IgG антител, используемых в серологических анализах [патент РФ 2094807 - панель анти-ВИЧ]. Однако неизвестны способы изготовления сывороток, в которых нормируется количественное содержание вирусных маркеров.

Известны панели сывороток Boston Biomedical Inc. (США): Hepatitis В Surface Antigen Sensitivity Panel (PHA 806) [1]. Панель включает сыворотки с концентрацией HBsAg от 2,5 нг/мл до 0,1 нг/мл и отрицательные сыворотки. Однако эти панели не используются в качестве стандартных референс-материалов США и предназначены для использования только в научных целях. Кроме того, сыворотки, входящие в состав этих панелей, представлены в жидкой форме и поэтому должны храниться при отрицательных температурах. Вследствие этого очень строгие (температурные) требования к их хранению и рассылке создают серьезные проблемы для использования в других странах, не имеющих надежной холодовой цепи [Инструкция по использованию PHA 806. W. Bridgewater, MA 02379, 1996].

Эти панели сывороток можно использовать в качестве аналога для предлагаемых референс-панелей.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ приготовления панелей сывороток, разработанный в Центральной лаборатории стандартов голландского Красного Креста для приготовления контрольных панелей марки Pelichek [2].

Эти панели представляют собой 8-10 разведенных образцов стандартного препарата HBsAg в пуле донорских сывороток, не содержащих маркеров опасных вирусных инфекций.

Способ-прототип включает приготовление стандартных сывороток, содержащих HBsAg и имеющих разную концентрацию этого белка. Основными этапами изготовления стандартных сывороток являются:
- сбор реактивных сывороток для приготовления стандарта HBsAg;
- сбор донорских сывороток, не содержащих анти-HBs антитела и маркеры вирусных инфекций;
- изготовление разводящей сыворотки, не содержащей фибриногена и липидов, из пула отобранных донорских сывороток;
- разведение стандарта HBsAg в разводящей сыворотке в 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 1024, 2048 и 8192 раз;
- проведение теста термодеградации для установления сроков годности панели.

К достоинствам способа-прототипа следует отнести разработку общей схемы приготовления стандарта HBsAg и приготовления разводящей сыворотки, которая реализована при изготовлении контрольных сывороток для панелей сывороток с другими маркерами.

Основные недостатки прототипа:
- разводящая сыворотка является идеализированной (т.е. из сыворотки удален фибрин, фибриноген и липиды) моделью нативной сыворотки крови человека;
- в панели "Pelicheck" не определена и не аттестована количественно концентрация HBsAg, а использован только метод кратного разведения. Для другого пула сывороток этим же разведениям будут отвечать другие концентрации HBsAg;
- сыворотки панели-прототипа не стабилизированы и не лиофилизированы.

Как следует из приведенного описания, доставка и хранение панелей-прототипов требуют строгого соблюдения низкотемпературных режимов.

Задачей настоящего изобретения является создание такого способа, который обеспечивает изготовление референс-панели сывороток с нормированными концентрациями HBsAg в диапазоне от 6 нг/мл до 0,25 нг/мл, для оценки качества тест-систем и позволяет сохранить специфические характеристики этих сывороток в течение длительного времени (не менее 2 лет).

Поставленная задача решается тем, что в способе получения панелей сывороток для контроля качества тест-систем и вакцин против гепатита В, включающем отбор донорских сывороток, не содержащих специфические антитела к основным маркерам вирусных инфекций, приготовление разводящего раствора на основе отобранных, разведение стандарта HBsAg в разводящем растворе, проведение теста термодеградации для установления сроков годности референс-панели, согласно изобретению отбор разводящих сывороток для панелей проводится по схеме, включающей их аттестацию методами ИФА и ПЦР на наличие ДНК ВГВ (вирус гепатита В) и титрование образцов HBsAg, причем отрицательные сыворотки панели формируют из нативных сывороток с нулевым титром, которые имеют отрицательный результат в ПЦР ДНК ВГВ, а в ИФА - величину ОП меньше критической (в диапазоне 0,5-0,8 ОП крит). В качестве HBsAg используется плазменный очищенный и рекомбинантный антиген, принадлежащий к различным субтипам HBsAg, содержащий не менее 95% основного белка, разведение плазменного и рекомбинантного HBsAg производят пулом донорских сывороток, содержащего следующий стабилизирующий состав: 15-20 г BSA, 45-55 г сахарозы, 7-15 г KCl, 5-10 г казеина на 1 л смешанной сыворотки; панель формируется из 10 сывороток с концентрацией HBsAg от 6 до 0,25 нг/мл и 6 нативных сывороток доноров; приготовленные сыворотки высушивают до остаточной влажности не более 1,5 мас.% лиофилизацией.

Отбор донорских сывороток проводят в 2 этапа:
а) отбор сывороток, не содержащих антитела к ВИЧ, вирусам гепатита В и С, сифилису;
б) отбор сывороток, имеющих коэффициент подавления меньше 1,3.

Донорские сыворотки, отобранные после проведения двух этапов, объединяются в пул. В пул вносят стабилизатор в сухой форме, компоненты которого также не оказывают подавляющего эффекта на аналитический сигнал HBsAg. Для предотвращения бактериального пророста в пул вносят бактерицидные компоненты.

Подготовленный таким способом пул донорских сывороток используют в качестве разводящего раствора для приготовления образцов референс-панели, содержащих HBsAg в требуемой концентрации от 6 нг/мл до 0,25 нг/мл (дальнейшее увеличение значения HBsAg не отражается на значении ОП, что видно на чертеже).

Сыворотки, реактивные на HBsAg, отбирают по результатам скриннинга нативных сывороток крови в серологических лабораториях с использованием тест-систем, аттестованных в приказе МЗ РФ по 1-му списку. Реактивные сыворотки перерабатывают с целью очистки от частиц Дейна для инактивации раствора HBsAg. В процессах разделения и концентрирования белков выделяют фракции с содержанием HBsAg выше 95% в соответствии с данными электрофореза. В процессе концентрирования HBsAg проводят обработку сывороток трипсином, фильтрование через 0,45 мкм и 0,22 мкм фильтры, скоростное центрифугирование и концентрирование. Полученный продукт под названием "очищенный плазменный HBs-антиген" аттестуют на содержание белка. Для установления связи между аналитическим сигналом ИФА и количеством HBsAg в растворе разводящей сыворотки необходимо использовать ИФА тест-системы, которые в диапазоне от 6 до 0,25 нг/мл показывают прямолинейную связь между оптической плотностью и количеством HBsAg в растворе.

Образцы приготовленных стабилизованных сывороток референс-панели с нормированным содержанием HBsAg анализируют в разных тест-системах различного формата (одно- и двустадийные, ускоренные и с ночной инкубацией) отечественного производства. При отличии полученных концентраций HBsAg от заданных содержание их корректируют в сторону увеличения путем введения плазменного и рекомбинантного антигена или в сторону уменьшения с помощью разводящего раствора. Жидкие образцы лиофилизируют по режиму, специально разработанному для данного вида препаратов и состава стабилизатора по способу, изложенному в [5].

Известен способ стабилизации специфических свойств положительных сывороток [4], а в предлагаемом изобретении для стабилизации уровня HBsAg предлагается дополнительно использовать стабилизатор, включающий 5-10 г казеина.

α-Казеин имеет М.м., близкую к массе HBsAg, и поэтому введение инертной молекулы аналогичного размера не будет создавать стерических затруднений для протекания специфического взаимодействия: Аг+Ат. Введение казеина эквивалентно созданию вокруг искомой молекулы дополнительной защитной оболочки для гидрофобных областей молекулы. Одновременно введение нового компонента в состав защитной среды вызывает изменение температур фазовых превращений разводящего раствора, что влечет за собой изменение режима лиофилизации.

Применимость созданных по настоящему изобретению референс-препаратов - сывороток с нормированным уровнем HBsAg проверяется рассылкой панелей в различные лаборатории и контрольные службы предприятий-производителей тест-систем в соответствии с программой их аттестации, разработанной национальным органом контроля РФ-ГИСК им. Л.А.Тарасевича. По результатам, представленным аналитическими лабораториями-участниками, окончательно устанавливают аттестованные значения концентраций HBsAg в образцах референс-панели.

Таким образом, процедура аттестации сывороток референс-панели включает три этапа, результаты которых независимы и позволяют надежно идентифицировать количество HBsAg.

Установленная при этой аттестации концентрация HBsAg вносится в паспорт на референс-панель. Срок службы, созданных по настоящему изобретению референс-препаратов, устанавливают по результатам теста термодеградации при температурах 4^oС и 37^oС в соответствии с [6].

Новым по сравнению с прототипом является:
- применение в качестве HBsAg плазменного очищенного и рекомбинантного антигена, принадлежащего к различным субтипам HBsAg, содержащего не менее 95% основного белка;
- применение в качестве разводящего раствора пул донорских сывороток, не содержащих маркеров основных вирусных инфекций и не снижающий аналитический сигнал от HBsAg относительно забуференного физраствора;
- изготовление сывороток с нормированной концентрацией HBsAg в диапазоне от 6 до 0,25 нг/мл;
- создание референс-панелей в сухой устойчивой форме;
- использование казеина в составе стабилизирующей среды.

Предложенный способ получения референс-панели сывороток для контроля качестве тест-систем и вакцин против гепатита B в литературе не описан, следовательно, можно сделать вывод о соответствии технического решения критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

На чертеже изображена кривая титрования рабочего эталона в разводящем растворе.

Примеры выполнения способа
Пример 1. Приготовление референс-панели.

Донорские K-сыворотки получают с СПК, аттестованными на отсутствие анти-ВИЧ, анти-ВГС, HBsAg и антител к сифилису. В лаборатории сыворотки дополнительно контролируют на наличие анти-HBs и анти-НВс антител. Отобранные на 1-м этапе K-сыворотки (плазму) фильтруют и центрифугируют. Для отделения сывороток (плазмы) от хлопьев и сгустков собирают фильтрационную установку из колбы и воронки. В качестве фильтрующего элемента используют 3 слоя марли, между которыми проложен слой ваты. Затем донорские K-сыворотки (плазма) центрифугируют со скоростью 1200 об/мин в течение 10 мин. Осадок отбрасывают. На 2-м этапе готовят рабочие растворы плазменного очищенного HBsAg ayw2 субтипа (производство ЗАО "Имбио", Нижний Новгород) и рекомбинантного HBsAg ayw4 субтипа (производство АО "Комбиотех") в донорских сыворотках и в ЗФР-казеине для получения двух рабочих эталонов с расчетной концентрацией 10 нг/мл каждого.

Приготовленные растворы титруют одновременно на одной микроплате в тест-системе "Вектогеп 2" с шагом 3. По направлению кривых титрования и соотношению ОП (ЗФР)/ОП (тестируемой сыворотки) делают заключение о пригодности использования тестируемой сыворотки в качестве компонента разводящего раствора. В частности, при ОП(ЗФР)/ОП (т. р-ра) < 1,3 при параллельности кривых титрования обоих антигенов с их растворами в ЗФР-казеин сыворотку включают в пул донорских сывороток для приготовления разводящего раствора.

Одновременно готовят стабилизатор на 1 л смешанной сыворотки, последовательно растворяя BSA, сахарозу, KCl и ЭДТА в пуле донорских сывороток в следующих количествах, г:
BSA - 15-20
Сахароза - 45-55
KCl - 7-15
Казеин - 5-10
Разводящий раствор доводят до pH 6,8-7,1 с помощью 0,1 М NaCl. В качестве бактерицидной добавки вводят мертиолят в количестве 0,01% от массы раствора. Пул сывороток с внесенными компонентами стабилизатора фильтруют последовательно через фильтры 0,8 мкм и 0,45 мкм.

На приготовленном разводящем растворе готовят растворы плазменного Аг и рекомбинантного Аг для получения эталонных растворов с концентрацией 10 нг/мл. Полученные рабочие эталоны титруют в разводящей сыворотке в трех повторах и тест-системах: "Вектогеп 1", "Вектогеп 2" (ЗАО "ВекторБест") и в тесте " HBsAg ИФА" (ЗАО "Вектор Майстар"). Одновременно на планшетах титруют раствор СО HBsAg (ГИСК или другого) с концентрацией 10 нг/мл в ЗФР-казеине.

Кривые титрования обрабатывают и определяют среднестатистическую кривую титрования для каждого рабочего эталона и точную исходную концентрацию HBsAg в рабочих эталонах (см. чертеж). По усредненной кривой титрования определяют коэффициенты разведения рабочих эталонов для получения образцов референс-панели HBsAg с концентрациями: 6 нг/мл, 2,0 нг/мл, 1,0 нг/мл, 0,5 нг/мл и 0,25 нг/мл.

Сыворотку референс-панели каждого номера получают в процессе смешения эталонного раствора HBsAg с разводящим раствором в соотношении, заданном коэффициентом разведения. Смешивание для каждого номера осуществляют в емкости объемом 500 см³, установленной на магнитной мешалке в течение 5-7 мин. Определение ОП образцов референс-панели всех номеров проводят в ИФА тест-системах того же типа, которые использовали при титровании эталонных растворов.

При оценке правильности разведения сравнивают величины ОП, полученные при анализе приготовленных образцов с ОП сывороток, приведенных на чертеже. Разведенные образцы, пригодные по результатам тестирования для приготовления референс-панели, передают на операцию лиофилизации. Для сывороток, оптическая плотность которых не соответствует усредненной кривой титрования, проводят корректировку концентрации с использованием исходного эталонного раствора HBsAg или разводящего раствора. Таким образом готовят 10 образцов панели, имеющих различное содержание HBsAg: 5 образцов на основе плазменного очищенного Аг и 5 образцов на основе рекомбинантного Аг с равными концентрациями 6 нг/мл, 2,5 нг/мл, 1 нг/мл, 0,5 нг/мл и 0,25 нг/мл.

Отрицательные сыворотки референс-панели готовят из донорских сывороток, не содержащих анти-ВИЧ, анти-ВГС и антитела к сифилису, а также HBsAg. Всего готовят 6 образцов, не содержащих HBsAg, но имеющих повышенные значения ОП в ИФА - от 0,5 до 0,8 ОП крит.

Все образцы сывороток панели контролируют на отсутствие ДНК ВГВ методом ПЦР в системе (ЗАО "Вектор Бест").

Сыворотки панели разливают в ламинарном шкафу по 0,7 мл во флаконы объемом 5 мл, закрывают резиновыми пробками и размещают в металлические кассеты для замораживания. Замораживание сывороток проводят при температуре минус (60+/-5)^oС, выдерживая при этой температуре не менее 20 часов. Температура в процессе замораживания поддерживается автоматически и контролируется аппаратчиком.

Замороженный препарат во флаконах переносят в сублимационную камеру лиофильной установки TG-50, полки которой охлаждены до минус 35^oС. Температуру материала на стадии сублимационного обезвоживания поддерживают ниже температуры его стеклования (-35^oС). Средняя скорость нагревания материала на этапе досушивания составляет 4^oС/мин, время выдерживания при 27^oС составляет 10 часов.

Лиофильно высушенные образцы референс-панели имеет остаточное содержание воды около 1,0-1,5 мас.%. Определение проводят по методике [7]. Флаконы с препаратом укупоривают под вакуумом. Вакуум в камере контролируется по вакуумметру. Общее среднее время сушки составляет 36 часов. Контроль специфической активности лиофилизованных сывороток с нормированным уровнем HBsAg проводят в тест-системах отечественного производства. Результаты анализа приведены в таблице 1.

Пример 2. Приготовление референс-панели HBsAg
Отбор донорских сывороток, их фильтрацию и пулирование осуществляют такими же способами, что и в примере 1. При стабилизации пула в разводящий раствор вносят такое же количество веществ, за исключением того, что казеина вносят 3 г на 1 л раствора. Остальные операции проводят, как в примере 1.

Пример 3.Приготовление референс-панели HBsAg
Отбор донорских сывороток, их фильтрацию и пулирование осуществляют такими же способами, что и в примере 1. При стабилизации пула в разводящий раствор вносят такое же количество веществ, за исключением того, что казеина вносят 10 г на 1 л раствора. Остальные операции проводят, как в примере 1.

Пример 4. Приготовление референс-панели HBsAg
Отбор донорских сывороток, их фильтрацию и пулирование осуществляют такими же способами, что и в примере 1. При стабилизации пула в разводящий раствор вносят такое же количество вещество, за исключением того, что казеина вносят 15 г на 1 л раствора. Остальные операции проводят, как в примере 1.

Приготовленные в примерах 1-4 разводящие растворы были использованы для приготовления положительных образцов панели HBsAg. Термостабильность образцов, приготовленных с разным количеством казеина, оценивается по результатам теста термодеградации, проведенного при 37^oС в течение 2-х недель. Результаты представлены в таблице 2 в сравнении с сыворотками панелей, хранившихся в холодильнике при 4^oС.

Сыворотки панели после выдержки в термостате были поставлены в тест-системе "Вектогеп-2" и в системе "HBsAg ИФА". Как следует из результатов табл. 2, оптимальное количество казеина составляет от 5 г до 10 г на 1 л разводящего раствора. При меньшей концентрации казеина ОП положительных образцов панели в ИФА снижается через 2 недели. Для образцов, приготовленных с добавкой казеина более 10 г/л, не отмечено улучшения показателей по сравнению с образцами 5 г/л и 10 г/л. Увеличенное содержание казеина приводит к увеличению вязкости разводящего раствора, что затрудняет проведение ИФА.

Из результатов испытаний следует, что концентрация HBsAg в тестированных сыворотках уменьшилась значимо при содержании казеина менее 5 г/л и практически не изменилась при содержании от 5 до 15 г/л после хранения в течение 4-х недель при температуре 37^oС. Однако увеличение концентрации казеина в образце сопровождается снижением ОП в ИФА, что нежелательно. Поэтому рекомендуемое содержание казеина на литр стабилизируемого раствора составляет от 5 до 10 г/л.

На основании полученных результатов можно оценить срок годности препаратов с нормированным уровнем HBsAg по стандартной методике [7]. Для хранения препаратов при температуре 4^oС срок годности:
t=4 нед. * 24 = 96 нед.

Таким образом, полученная оценка срока годности сывороток HBsAg панели соответствует требованиям экспертов ВОЗ по стандартным биопрепаратам.

Экономическая эффективность применения предлагаемого способа изготовления сывороток с аттестованной концентрацией HBsAg заключается в том, что искомый белок диагностируется в крови больных гепатитом В на всех этапах развития инфекции. Он появляется в крови инфицированных через 2-3 недели после инфицирования. Именно сокращение сроков установления диагнозов для инфицированных пациентов и более ранняя медицинская помощь и лечение составляют социально-значимую и экономическую эффективность, связанные с сокращением сроков лечения и срока трудовой неспособности людей.

Кроме того, введение в практику серологии сывороток-калибраторов с известной концентрацией HBsAg создают основу для контроля правильности анализов на содержание этого маркера в крови и тем самым юридическую основу для разрешения конфликтов между производителями и пользователями HBsAg тест-систем и между производителями и пользователями вакцин на гепатит В, в которых должно содержаться определенное количество HBsAg.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в биотехнологии, медицине и ветеринарии при оценке качества тест-систем для выявления маркеров различных вирусных или бактерийных инфекций.

Источники информации
1. Информационный бюллетень фирмы Boston Biomedica, Inc., 1996, Hepatitis B surface antigen sensitivity panel (РНА806).

2. Pelicheck sensitivity HBsAg panel. Central Laboratory of the Netherlands Red Cross. Amsterdam, 1996.

3. Janot С., Courouce A.-M., Maniez-Montreuil M. et al. Reevaluation of the sensivity of 19 HBs antigen screening kits. La Revue francaise des Laboratories, fevrier/mars 1996, 282 (translation).

4. E. A.Гутова, А.Н.Канев, Е.Ю.Шалаев. Стабилизирующий состав для контрольных сывороток положительных на антитела к вирусным и микробным антигенам. Патент РФ 2011202, 1993.

5. А.Н.Канев, А.П.Садовский, Е.Ю.Шалаев, М.Ю.Рукавишников. Способ определения технологических параметров лиофилизации биопрепаратов. Патент РФ 2010220, 1993.

6. ОСТ 42-2-72 "Лекарственные средства. Порядок установления сроков годности". Минздрав СССР, Москва, 1972.

7. "Определение остаточной влажности малых количеств биопрепаратов", МИ 123.39.002.89, ГНЦ ВБ "Вектор", 1990.