Результат интеллектуальной деятельности: ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ НЕЙРОТРОПНЫМИ СВОЙСТВАМИ

Изобретение относится к биотехнологии и энзимологии. Представлен новый пептид HFRWPGP, обладающий нейротропными свойствами.

Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов являются АКТГ/МСГ-подобные пептиды, объединяемые в настоящее время термином меланокортины (МК). Исследования эффектов этих пептидов, проводившиеся на протяжении последних 40 лет, показали, что спектр физиологической активности этих пептидов очень широк. МК вовлечены в регуляцию памяти и внимания, эмоционального статуса, полового и пищевого поведения, болевой чувствительности и ряда других физиологических функций [1]. К семейству МК относятся адренокортикотропный гормон (АКТГ) и меланоцитстимулирующие гормоны (α-, β- и γ-МСГ), а также фрагменты этих гормонов и их синтетические аналоги. Общей последовательностью для всех МК является АКТГ_6-9 - FRWG. Эта последовательность может быть расположена в различных участках пептидной молекулы гормонов. Она необходима для связывания со всеми известными типами рецепторов МК [2]. Особый интерес представляет способность АКТГ и МСГ, а также их фрагментов, лишенных гормональной активности, ускорять обучение животных и улучшать сохранение выработанных навыков. Наиболее активным из исследованных пептидов является АКТГ_4-10. Наименьшим фрагментом АКТГ, сохраняющим ноотропную активность, является АКТГ_4-7. Однако также было показано, что фрагмент АКТГ_7-10 обладает незначительной ноотропной активностью. Удлинение молекулы до АКТГ_7-16 приводит к увеличению активности до уровня, сопоставимого с АКТГ_4-7 и АКТГ_4-10 [3, 4].

Исследования показали, что МК играют важную роль в регуляции эмоционального состояния животных. Однократное введение AKTF_1-24, α-МСГ и АКТГ_4-10 приводит к повышению тревожности животных [5, 6]. Было высказано предположение, что анксиогенные свойства природных МК определяет наличие в структуре пептида последовательности АКТГ_7-10 [7]. Однако эти же пептиды при хроническом введении снижали у крыс агрессивность, вызванную изолированным размещением [8]. Для оценки роли фрагментов АКТГ в регуляции тревожности необходимы дальнейшие исследования.

Накопленные в настоящее время данные позволяют заключить, что последовательность АКТГ включает в себя несколько сайтов, которые могут активировать различные рецепторы, вызывая при этом широкий спектр физиологических эффектов.

Недостатком большинства природных пептидных регуляторов, в том числе фрагментов АКТГ, является кратковременность их эффектов. Так, длительность действия наиболее эффективного природного фрагмента - АКТГ_4-10 составляет 30-60 мин [9]. Существует препарат Семакс, который сохраняет ноотропное действие природного прототипа, при этом длительность его эффектов составляет 20-24 час [10]. В настоящее время Семакс используется в медицине в качестве ноотропного и нейропротекторного препарата. Эксперименты на животных показали, что однократное введение Семакса оказывает нормализующее воздействие на эмоциональное состояние, а при хроническом введении препарат проявляет анксиолитическую активность [11, 12]. Однако на сегодняшний день по-прежнему существует необходимость в пептидах, обладающих ноотропным действием природного прототипа с пролонгированным временем действия и специализированных для различных стрессовых ситуаций, так как возможны разные поведенческие эффекты новых аналогов фрагментов АКТГ, содержащих в своей структуре природную последовательность и обогащенных пролином PGP.

Изобретение проиллюстрировано следующими рисунками и примерами.

Рис.1. Влияние Семакса и HFRWPGP на выработку пищедобывательного рефлекса в Т-образном лабиринте. Пептиды вводили ежедневно и/н в дозе 0,05 мг/кг за 15 мин до обучения. 1 - контрольные животные, 2 - группа животных, получавших Семакс, 3 - группа животных, получавших HFRWPGP. В каждой группе по 30 крыс. Отличия опыта от контроля отмечены * (р<0.05) и & (р<0.10).

Рис.2. Влияние Семакса и HFRWPGP на выработку условного рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя. Пептиды вводили и/н в дозе 0,05 мг/кг за 15 мин до обучения. В каждой группе по 20 крыс. Обозначения такие же, как на рис.1.

Рис.3. Влияние Семакса и HFRWPGP на поведение крыс в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" в условиях низкой стрессорной нагрузки. Пептиды вводили и/н в дозе 0,05 мг/кг за 15 мин до тестирования. В каждой группе по 20 крыс. Отличия опыта от контроля отмечены * (р<0.05) и & (р<0.10), от группы с введением Семакса # (р<0.05). Обозначения такие же, как на рис.1.

Рис.4. Влияние Семакса и HFRWPGP на поведение крыс в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" в условиях повышенной стрессорной нагрузки. Пептиды вводили и/н в дозе 0,05 мг/кг за 15 мин до обучения. В каждой группе по 20 крыс, Обозначения такие же, как на рис.1.

Пример 1

Исследования проводились на самцах нелинейных белых крыс массой 200-250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде и соблюдением 12-часового светового режима дня. Изучалось влияние пептида АКТГ_6-9-PGP (HFRWPGP) на способность к обучению и уровень тревожности крыс. В качестве вещества сравнения использовали препарат Семакс. Пептид вводили интраназально в дозе 0.05 мг/кг в водном растворе из расчета 0.1 мл/кг массы тела за 15 мин до эксперимента. Контрольным животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды. Все использованные пептиды синтезированы в Секторе регуляторных пептидов ИМГ РАН.

Выработку условного пищедобывательного рефлекса проводили в Т-образном лабиринте (размер рукавов лабиринта - 30×10 см; размер стартовой камеры - 20×10 см). За сутки до начала эксперимента животных подвергали пищевой депривации. В последующие 4 дня животное помещали в лабиринт по 5 раз подряд ежедневно, причем длительность каждой посадки не превышала 3-х мин. В дни опыта животных кормили один раз в сутки через час после обучения. Вещества вводили перед каждым сеансом обучения. Ежедневно регистрировали: количество выполненных реакций (КВР, число заходов в подкрепляемый отсек и съедания подкрепления), латентный период (ЛП, время выхода из стартового отсека); количество ошибок (число заходов в неподкрепляемый отсек лабиринта).

Оценку способности животных к обучению проводили также в тесте выработки условного рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя. Обучение проводилось в экспериментальной камере (30×22×35 см), разделенной перегородкой, с отверстием на два отсека: один - ярко освещенный, другой - затемненный. Камера устанавливалась на решетчатый металлический пол, подсоединенный к источнику тока. В первый день эксперимента животное помещали в освещенный отсек камеры и регистрировали ЛП перехода в темный отсек, в котором крысу подвергали неизбегаемому удару электрическим током длительностью 3 сек. Напряжение подбиралось индивидуально для каждого животного по вокализации (в диапазоне 60-90 В), частота составляла 50 Гц, длительность - 10 мсек. После отключения тока крысу оставляли в затемненном отсеке на 20 сек. Через 72 часа проводили проверку выработки навыка пассивного избегания болевого раздражителя. Животное на 3 мин помещали в светлый отсек камеры и регистрировали суммарное время, проведенное в светлом отсеке, и число заходов в темный отсек. Препараты вводили в первый день до сеанса обучения.

Уровень тревожности животных оценивали в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" (ПКЛ). Экспериментальная камера лабиринта состоит из четырех расходящихся из центра рукавов (длина 35 см, высота стенок 20 см). Два противоположных рукава закрыты с торцов стенками; два других открыты. Лабиринт устанавливали на высоте 50 сантиметров от пола. Эксперимент проводился в двух модификациях: (1) - при однородном слабом освещении (низкая стрессорная нагрузка); (2) - закрытые рукава затемнены, открытые - ярко освещены (высокая стрессорная нагрузка). Крысу помещали в центр лабиринта и в течение 3 мин регистрировали следующие показатели: общее время нахождения на свету; количество заходов в открытые и закрытые рукава; количество свешиваний с открытых рукавов лабиринта; число стоек (подъемов на задние лапы).

Обработка результатов производилась с помощью пакета статистических программ "Statistica". Определялись внутригрупповые средние и разбросы. Отличия между группами оценивались с помощью однофакторного ANOVA метода и непараметрического критерия χ². Данные на рисунках представлены в виде среднего±стандартная ошибка среднего. Отличия считали достоверными при р<0.05.

Исследование влияния аналогов фрагментов АКТГ на выработку условного пищедобывательного рефлекса на место в Т-образном лабиринте показало, что введение Семакса приводит к достоверному увеличению количества выполненных реакций в 3-4-й дни обучения по сравнению с контролем (рис.1). В группе крыс, получавших HFRWPGP, наблюдалось значимое увеличение КВР в 1 и 3-й дни обучения. Кроме того, у животных, которым вводили Семакс или HFRWPGP, отмечалось достоверное уменьшение ЛП выхода из стартового отсека в 3-й день опыта.

В качестве модели обучения с отрицательным подкреплением использовали тест выработки условного рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя. Было показано, что введение Семакса или HFRWPGP приводит к увеличению общего времени, проведенного в светлом отсеке камеры (рис.2), а также к снижению числа заходов в темный отсек при проверке воспроизведения навыка. Следовательно, все исследованные пептиды улучшают обучение в данном тесте.

Пример 2

Исследовались влияние аналогов фрагментов АКТГ на уровень тревожности животных в различных экспериментальных условиях. В тесте ПКЛ при однородном неярком освещении (т.е. в ситуации пониженной стрессорной нагрузки) введение Семакса и HFRWPGP не приводило к значимому изменению регистрируемых показателей (рис.3).

Увеличение стрессорной нагрузки в тесте ПКЛ (яркое освещение открытых рукавов лабиринта) приводит к возрастанию у животных реакции тревоги и страха (рис.3 и 4). Сравнение параметров поведения крыс контрольных групп в тесте ПКЛ в различных экспериментальных условиях показало, что увеличение стрессорной нагрузки приводит к достоверному снижению времени, проведенного на освещенной части лабиринта, числа свешиваний и заходов в открытые рукава (р<0.0001). При этом параметры, отражающие уровень исследовательской активности, - число стоек и заходов в закрытые рукава значимо не изменяются (р>0.15).

При изучении влияния аналогов фрагментов АКТГ на поведение крыс в тесте ПКЛ в условиях повышенной стрессорной нагрузки было показано, что введение Семакса и HFRWPGP приводит к увеличению времени, проведенного на свету, числа свешиваний и заходов в открытые рукава лабиринта (рис.4). При этом изменения числа стоек и заходов в закрытые рукава отмечено не было. Следовательно, в условиях повышенной стрессорной нагрузки все исследуемые пептиды вызывают снижение уровня тревожности животных.

Проведенные эксперименты показали, что аналог фрагментов АКТГ HFRWPGP улучшает воспроизведение рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя. Т.е. этот пептид улучшает обучение животных в тесте с отрицательным подкреплением.

Способность животных к выработке как пищедобывательных, так и оборонительных рефлексов зависит от баланса оборонительной и исследовательской мотиваций. Поэтому при анализе механизмов ноотропных эффектов различных препаратов необходимо учитывать их влияние на исследовательское поведение и уровень тревожности животных. Оценка влияния исследуемых препаратов на эмоциональное состояние животных показала, что аналог HFRWPGP не влияет на уровень тревожности в условиях незначительной стрессорной нагрузки, однако в случае повышенного уровня тревожности оказывает анксиолитическое действие.

Таким образом, пептид HFRWPGP, в структуре которого присутствуют природные последовательности АКТГ_6-9, обладает ноотропной и анксиолитической активностью.

На основании проведенных экспериментов можно заключить, что аналог фрагментов АКТГ - HFRWPGP улучшает обучение животных.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Starowicz К., Przewlocka В. // Life Sci. 2003. v.73(7). P.823-847.

2. Cain J.P., Mayorov A.V., Cat M. et al. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006. V.16(20). P.5462-5467.

3. De Wied D. // Behavioural Brain Res. 1997. V.83. p.83-90.

4. De Wied D., De Kloet E.R. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1987. V.512. P.328-337.

5. Kokare D.M., Chopde C.T., Subhedar N.K. // Neuropharmacology. 2006. V.51 (3). P.536-545.

6. File S.E., Seth P. // Eur. J. Pharmacol. 2003. V.463. P.35-53.

7. Wolterink G., van Ree J.M., van Nispen J.W. // Life Sci. 1991. V.48. P.155-161.

8. De Wied D. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1993, V.680. P.20-28.

9. Ashmarin I.P., Nezavibatko V.N., Levitskaya N.G. et al. // Neurosci. Res. Comm. 1995. V.16. P.105-112.

10. Ашмарин И.П., Незавибатько В.Н., Мясоедов Н.Ф. и др. // Ж. ВНД. 1997. Т.47, с.426-436.

11. Левицкая Н.Г., Виленский Д.А., Себенцова Е.А. и др. // Известия Академии наук 2010(2), с.231-237.

12. Виленский Д.А., Левицкая Н.Г., Андреева Л.А. и др. // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2007, т.93(6), с.661-669.

13. Левицкая Н.Г., Себенцова Е.А., Глазова Н.Ю. и др. // ДАН. 2000 т.372(2). С.268-271.