×
04.04.2019
219.016.fca6

Результат интеллектуальной деятельности: ГЕН PARK2 И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЕГО МУТАЦИЙ

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ диагностики делеций и дупликаций экзонов гена PARK2, включающий одновременную амплификацию одного из экзонов гена паркина и гена-свидетеля в исследуемых образцах геномной ДНК человека при помощи полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием фланкирующих экзон внешних праймеров и расположенного между праймерами флуоресцентно меченого гибридизационного зонда, где полимеразную цепную реакцию проводят в четыре этапа в следующем режиме: прогрев реакционной смеси при температуре 50°С в течение 2 минут, денатурация реакционной смеси при 95°С в течение 15 минут, денатурация реакционной смеси при 95°С в течение 15 секунд, инкубация реакционной смеси при 61°С в течение 45 секунд, два последних этапа повторяются последовательно в течение 35 циклов, при этом отсутствие делеций, наличие гетерозиготной или гомозиготной делеций или наличие дупликаций экзона констатируется по величине коэффициента R, который рассчитывается по формуле R=2, где ΔCt=[Ct гена-свидетеля (контрольный образец ДНК) - Ct паркина (контрольный образец ДНК)] - [Ct гена-свидетеля (образец ДНК больного) - Ct паркина PARK2 (образец ДНК больного)]. Изобретение позволяет определять мутации в гене PARK2. 13 з.п. ф-лы, 5 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается мутаций гена PARK2 и подбора к нему праймеров, а также использования полимеразной цепной реакции. Основным типом мутаций в этом гене являются делеции или дупликации отдельных экзонов гена или групп экзонов.

Ген PARK2 связан с развитием болезни Паркинсона. В настоящее время считается, что гомозиготность или компаундная гетерозиготность по мутациям в гене паркина является причиной развития заболевания у почти 50% больных ювенильным аутосомно-рецессивным паркинсонизмом и 5-10% больных со спорадической болезнью Паркинсона с ранним (до 50 лет) началом развития заболевания.

Среди нейродегенеративных заболеваний болезнь Паркинсона занимает второе место по частоте встречаемости после болезни Альцгеймера. В большинстве популяций мира идиопатическим паркинсонизмом болеет не менее 2-4% всех лиц старше 65 лет и не менее 1% всех лиц старше 50 лет. В последнее время наблюдается рост числа больных идиопатическим паркинсонизмом и снижение возраста дебюта заболевания. Заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение и характеризуется классической тетрадой клинических симптомов - низкочастотным тремором в состоянии покоя, ригидностью скелетных мышц рук и лица (пластический гипертонус), пониженной двигательной активностью (брадикинезией) и нарушением координации движений после сна (постуральной неустойчивостью). Нейродегенеративные изменения наблюдаются в первую очередь в дофаминэргических нейронах компактной части черной субстанции, базальных ядрах, покрышке среднего мозга. На более поздних стадиях развития заболевания процессы дегенерации распространяются на кору больших полушарий.

Прямое определение мутаций гена PARK2 может быть основой для диагностики болезни Паркинсона, в том числе на доклинической стадии.

Задачей настоящего изобретения является определение мутаций в гене PARK2, вызывающих болезнь Паркинсона.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении изобретения, является определение вызывающих болезнь Паркинсона делеций и дупликаций отдельных экзонов или групп экзонов гена паркина (PARK2) с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени в варианте TaqMan.

Указанный технический результат достигается тем, что проводится одновременная амплификация в одной пробирке одного из экзонов гена паркина и гена-свидетеля, в качестве которого выбран, например, ген бета-глобина человека. Для проведения амплификации экзонов гена паркина (PARK2) используют праймеры и любой флуоресцентно меченый зонд, например, 5′-AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG-3′ или тот же зонд с гасителем флуоресценции, например, с RTQ1 и последовательности экзонов со второго по двенадцатый с фланкирующими фрагментами интронов. Для визуализации продуктов амплификации зонды к экзонам гена паркина (PARK2) метили с 5′ конца зонда флуоресцентным красителем ROX. Для тушения флуоресценции красителя в составе зонда использовался RTQ1, пришиваемый на 3′ конец зонда. Последовательности праймеров и зондов приведены в таблице 1 (последовательности 1-33).

В качестве гена-свидетеля используется ген бета-глобина человека, последовательности праймеров и зонда, для которого приведены ниже (последовательности 34-36). Зонд на ген бета-глобина метили пришитым к 5' олигонуклеотида красителем FAM, а для тушения флуоресценции использовали пришитый на 3' конец зонда RTQ1.

Последовательность 34 5'-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3'

Последовательность 35 5'-CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3'

Последовательность 36 5' FAM - AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG-RTQ1-3'

Полимеразную цепную реакцию проводят в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 2,5 мМ MgCl2, по 8 пкМоль каждого из праймеров и по 4 пкМоль каждого из зондов, 8 нг геномной ДНК человека, 1,25 единицы ДНК полимеразы Taq для горячего старта. Одновременная полимеразная цепная реакция на один из экзонов гена паркина и ген-свидетель проводится в четыре этапа. При этом первый этап состоит из прогрева реакционной смеси при температуре 50°С в течение 2 минут. Второй этап состоит из денатурации реакционной смеси при 95°С в течении 15 минут. Третий этап состоит из денатурации реакционной смеси при 95°С в течение 15 секунд. Четвертый этап состоит из инкубации реакционной смеси при 61°С в течение 45 секунд. Этапы три и четыре повторяются последовательно в течение 35 циклов.

Технический результат также достигается за счет того, что для определения величины порогового цикла (Ct) амплификации для одновременно амплифицируемых экзона гена паркина и гена-свидетеля используется метод двойной производной. Далее для определения числа копий исследуемого экзона гена паркина проводят сопоставление величин порогового цикла для экзонов гена паркина и одновременно амплифицируемого с ним гена-свидетеля при помощи определяемого по уравнению 1 коэффициента R:

Rпаркин/бета-глобин=2-(ΔCt),

где (ΔCt)=[Ct бета-глобина (контрольный образец ДНК) - Ct паркина (контрольный образец ДНК)] - [Ct бета-глобина (образец ДНК больного) - Ct паркина PARK2 (образец ДНК больного)].

Величина этого коэффициента у лиц с отсутствием делеций экзонов гена паркина варьирует по каждому экзону от 0,7 до 1,2. У лиц с гетерозиготной делецией определенного экзона гена паркина величина коэффициента R для данного экзона может варьировать от 0,6 до 0,4. При гомозиготной делеции определенного экзона величина коэффициента снижается до 0-0,2. При дупликации определенного экзона величина коэффициента R для данного экзона может варьировать от 1,3 до 1,8.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1

Для создания новой диагностической системы для выявления делеций и дупликации отдельных экзонов гена паркина PARK2 была создана панель праймеров и зондов (табл.1).

Она была тестирована на контрольной выборке лиц без клинических признаков болезни Паркинсона в возрасте более 60 лет и на группе больных с болезнью Паркинсона, ранее типированных на наличие делеций и дупликаций в гене паркина с использованием других методов. При этом были отработаны оптимальные условия ПНР в реальном времени:

- прогрев реакционной смеси при температуре 50°С в течение 2 минут;

- денатурация реакционной смеси при 95°С в течение 15 минут;

- денатурация реакционной смеси при 95°С в течение 15 секунд;

- инкубация реакционной смеси при 61°С в течение 45 секунд.

Два последних этапа повторяются последовательно в течение 35 циклов.

Результаты этого анализа приведены в таблице 2. Из полученных данных видно, что у здоровых лиц без признаков Паркинсонизма для всех проанализированных экзонов величина коэффициента R, отражающего соотношение числа копий экзонов гена пакрина и гена бета-глобина, варьирует по каждому экзону от 0,7 до 1,2. Такая же вариабельность коэффициента R наблюдается по всем проанализированным экзонам гена паркина у трех больных с болезнью Паркинсона, у которых ранее не было выявлено делеций или дупликаций экзонов гена паркина PARK2.

У лиц с гетерозиготной делецией определенного экзона гена паркина величина коэффициента R для данного экзона может варьировать от 0,6 до 0,4. Такие больные с делениями экзонов 2, 3, 4. 5, 6, 7 приведены в таблице 2.

Пример 2

С использованием разработанного метода анализа делеций и дупликаций экзонов гена паркина PARK2 был проведен анализ группы из 64 больных болезнью Паркинсона с ранним (до 50 лет) началом развития патологического процесса. При этом у 55 больных не было выявлено каких-либо делеций или дупликаций. Для всех проанализированных экзонов величина коэффициента R, отражающего соотношение числа копий экзонов гена пакрина и гена бета-глобина, у этих больных варьировала по каждому экзону от 0,7 до 1,2.

У 9 больных были выявлены различные мутации с изменением числа копий экзонов гена паркина PARK2. Данные по этим больным приведены в таблице 3 к примеру 2.

При этом обнаружены:

двое больных с гомозиготными делециями экзона 3 (больной №5) и экзона 4 (больной №2);

двое больных с гетерозиготностью по дупликации экзона 5 (больные №8 и №9);

один больной с гетерозиготной делецией экзона 3 (больной №6);

четверо больных с протяженными делециями, захватывающими от двух до пяти экзонов гена паркина PARK2 (больные №1, №3, №4, №7).

Полученные результаты указывают на то, что разработанный новый способ определения делеций и дупликаций экзонов гена паркина PARK2 позволяет детектировать вызывающие болезнь Паркинсона делеции и дупликации гена паркина и отличается высокой чувствительностью, простотой и быстротой проведения анализа.

Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-4 из 4.
20.02.2019
№219.016.c251

Способ получения эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, модифицированных геном фактора роста нервов человека

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, исключая человеческие, модифицированных геном фактора роста нервов человека, включающий культивирование эмбриональных стволовых клеток в среде аМЕМ с добавками, посев клеток на чашку,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002458984
Дата охранного документа: 20.08.2012
29.05.2019
№219.017.6849

Способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов пациентов с болезнью хангингтона

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПС клеток) из фибробластов кожи пациента больного хореей Гентингтона, включающий получение и размножение фибробластов, посев указанных фибробластов на лунки плотностью 30% монослоя в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002458983
Дата охранного документа: 20.08.2012
29.05.2019
№219.017.6981

Пептид, обладающий нейротропными свойствами

Изобретение относится к биотехнологии. Описан пептид HFRWPGP, обладающий нейротропными свойствами. Изобретение расширяет спектр нейротропных средств, пептид HFRWPGP улучшает обучение животных. 4 ил., 2 пр.
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002443711
Дата охранного документа: 27.02.2012
29.06.2019
№219.017.9d96

Применение тетрапептида pro-gly-pro-leu в качестве средства профилактики и лечения диабета, способ профилактики и лечения диабета и фармацевтическая композиция для профилактики и лечения диабета

Использование в медицине и фармакологии и касается лекарственного средства пептидной природы для лечения сахарного диабета. Сущность изобретения: применение тетрапептида Pro-Gly-Pro-Leu в качестве средства профилактики и лечения инсулинзависимого диабета, способ профилактики и лечения диабета и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002378005
Дата охранного документа: 10.01.2010
Показаны записи 1-10 из 25.
27.05.2013
№216.012.438a

Применение l-карнозина для приготовления нанопрепарата, обладающего антигипоксической и антиоксидантной активностью

Предложено применение L-карнозина для приготовления нанопрепарата, обладающего антигипоксической и антиоксидантной активностью в сочетании с комбинацией веществ, выбранных из группы фосфолипидов, неполярных липидов при следующем соотношении компонентов, в мас.%: L-карнозин - 1,1-1,2, неполярные...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002482867
Дата охранного документа: 27.05.2013
20.06.2013
№216.012.4af8

Способ выявления уровня поражения периферической нервной системы при сенсомоторной нейропатии

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии. Проводят ультразвуковое исследование структуры нервов верхних и нижних конечности на всем их протяжении. При нарушении кабельности строения нервов на всем протяжении и снижении их эхогенности характер поражения оценивают как...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002484774
Дата охранного документа: 20.06.2013
20.12.2013
№216.012.8d4a

Способ оценки морфофункционального состояния диференцированных в дофаминергические нейроны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток больных паркинсонизмом

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ оценки морфофункционального состояния индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) больных паркинсонизмом путем проведения их дифференцировки в дофаминергические нейроны, для чего воздействуют на ИПСК факторами,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002501853
Дата охранного документа: 20.12.2013
27.07.2015
№216.013.67ff

Способ дифференциальной диагностики болезни паркинсона и эссенциального тремора

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии. Исследуют количество гармонических частотных пиков в спектре акселерометра, отношение спектральной мощности электромиограммы (ЭМГ) сгибателя в диапазоне 1-30 Гц в пробе с когнитивной нагрузкой к этому же показателю без...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002558176
Дата охранного документа: 27.07.2015
10.11.2015
№216.013.8b49

Способ диагностики преклинической стадии болезни гентингтона

Изобретение относится к неврологии, в частности к нейродегенеративному заболеванию болезни Гентингтона. Регистрируют электроэнцефалограмму (ЭЭГ) в состоянии спокойного бодрствования при закрытых глазах. Определяют абсолютную спектральную мощность стандартных тета-диапазонов и узких частотных...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002567264
Дата охранного документа: 10.11.2015
20.03.2016
№216.014.ca40

Способ лечения глаукомной оптической нейропатии

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам лечения глаукомной оптической нейропатии. Проводят местную гипотензивную терапию. Осуществляют трансорбитальную низкочастотную магнитную стимуляцию. При этом амплитудное значение магнитной индукции на рабочей поверхности индуктора -...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002577763
Дата охранного документа: 20.03.2016
20.04.2016
№216.015.348c

Способ диагностики нейродегенеративного процесса при болезни паркинсона

Изобретение относится к медицине, неврологии, оценке когнитивных процессов и зрительно-пространственного восприятия в головном мозге у пациентов с болезнью Паркинсона (БП). Может быть использовано в качестве биомаркера текущего нейродегенеративного процесса, а также оценки эффективности...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002581252
Дата охранного документа: 20.04.2016
13.01.2017
№217.015.7f69

Применение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека для оценки цито- и эмбриотоксических свойств фармакологических соединений

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии и фармакологии, и может быть использовано для оценки цито- и эмбриотоксических свойств фармакологических соединений. Для этого применяют индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные репрограммированием фибробластов кожи...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002599847
Дата охранного документа: 20.10.2016
25.08.2017
№217.015.ae64

Способ определения массы миокарда левого желудочка сердца у больных неосложненной артериальной гипертензией при помощи усредненной электрокардиографии

Изобретение относится к медицине, а именно кардиологии и функциональной диагностике. Собирают данные пациента: пол, возраст, индекс массы тела. Производят регистрацию электрокардиограммы в 12 общепринятых отведениях в течение 5 минут. Осуществляют усреднение электрокардиосигнала и разметку...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002612822
Дата охранного документа: 13.03.2017
25.08.2017
№217.015.d02b

Способ выявления экспансии тринуклеотидных cgg-повторов в 5'-нетранслируемой, промоторной области гена fmr1 при заболевании синдрома атаксии/тремора, ассоциированного с ломкой х-хромосомы (fxtas)

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ выявления экспансии тринуклеотидных CGG-повторов в 5'- нетранслируемой, промоторной области гена FMR1 при заболевании синдрома атаксии/тремора, ассоциированного с ломкой Х-хромосомой (FXTAS), который проводят путем исследования образца ДНК...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002620944
Дата охранного документа: 30.05.2017
+ добавить свой РИД