Результат интеллектуальной деятельности: ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЁЗА

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии именно к разработке питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования возбудителя бруцеллеза.

Известна питательная среда мясопептонный агар для выращивания бруцеллезного микроба, основой которой является г/л: мясная вода 1000,0 мл, 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого натрия хлористого и 25 г агар-агара, промытого водопроводной водой и хорошо отжатого, рН среды устанавливают 7,8. Затем среду варят до полного расплавления агара и разливают в необходимую посуду (по 1-2 л). В дальнейшем среду автоклавируют при 115°С в течение 20 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, предварительно смоченный теплой водой и вновь устанавливают рН 7,1-7,2. Среду разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 115°С в течение 20 минут (Профилактика инфекционных болезней инфекции, общие для человека и животных. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей. Методические указания МУ 3.1.7.1189-03. С. 53).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность, ввиду позднего роста возбудителя.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда для культивирования бруцелл содержащая г/л: к 500,0 мл пептона Мартена, добавляют 500,0 мл мясной воды, и 5 г химически чистого хлористого натрия, 5,0 г натрия уксуснокислого и агар-агар 15,0-20,0. Смесь кипятят, устанавливают рН - 7,3±0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют 20 мин при 120°С (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СП6. - 2008. - С. 65-66).

Недостатком данной среды является низкая питательная ценность для бруцеллезного микроба.

Целью изобретения является разработка рецептуры питательной среды плотной для культивирования возбудителя бруцеллеза, обеспечивающей достаточное количество колоний максимально в ранние сроки через 48 ч, а через 72 ч отмечается увеличение колоний.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что в качестве основного источника азотистого питания в предлагаемой среде используется мясная вода, пептон ферментативный и сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая, для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала натрий хлористый, в качестве стимулирующих добавок - глюкоза, глицерин, натрия метабисульфит, а также агар микробиологический, при следующем соотношении ингредиентов г/л:

В качестве исходного сырья используют мясную воду, являющуюся основой для многих питательных сред, обычно для приготовления мясной воды служит говядина или конина. Конина отличается большим содержанием углеводов (гликоген). Из мяса молодых хорошо упитанных животных (телят) обычно получают мясную воду лучшего качества (питательные свойства, прозрачность). Азотистые вещества от 12,7 до 21,71%, жиры от 1,4 до 15,5%. Минеральные вещества мяса состоят из солей натрия, калия, кальция, фосфора и железа, общее количество их достигает 1%. Мясо свежее содержит также витамины, экстрактивные вещества в большем количестве чем в замороженном (Ю.А. Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз - 1950 г. С. 46-48).

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - ГОСТ 13805-76. Производитель «НПО Порт-Петровск».

Сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая. Дата выпуска 27.05.2016. Серия Л-16-04. Срок годности 2 года. Производитель ООО БиолоТ. С-Петербург.

Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 партия 24. Производитель г. Барнаул. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Глюкоза кристаллическая, чда, партия 20140327 0 00«МСД Торговая компания». Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глюкозы в концентрации 1% - улучшается ее ростовые свойства.

Глицерин ГОСТ 6259-75, партия 21/2015. Дата выпуска 04.2015. Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глицерина в концентрации 2% - улучшается ее ростовые свойства. Производитель Польша.

Натрия метабисульфит ГОСТ 11683-76 в средах переходит в гидросульфит натрия, при нагревании происходит термическое разложение с выделением двуокиси серы (SO₂), что способствует нейтрализации продуктов жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов.

Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 10.2017 г. Дата изготовления: октябрь 2013 г. Порошок светло-кремового цвета сероватого оттенка, запах без постороннего, свойственный студню с массовой долей сухого агара 0,85%. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0.85% не ниже 80°С, температура застудневания - 30-37°С, прочность студня не менее - 350±40 г. Главная особенность агара - его желирующая способность.

Приготовление мясной воды двойной концентрации

Способ приготовления питательной основы для культивирования возбудителя бруцеллеза: 1 кг мясного фарша заливают 1 л дистиллированной воды и ставят на один сутки при температуре 6-8°С. Через сутки смесь фарша с водой кипятят в течение часа. Небольшие количества - до 5 литров можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания частичек мяса. После кипячения мясную воду отжимают от фарша, доливают до первоначального объема дистиллированную воду, фильтруют и стерилизуют 30 минут при температуре 120°С. Хранят мясную воду двойной концентрации в стерильном виде.

Приготовление питательной среды плотной

Питательную среду на основе мясной воды двойной концентрации для культивирования возбудителя бруцеллеза готовят следующим способом: соединяют мясную воду - 1000,0; пептон ферментативный - 10,0; натрий хлористый - 5,0; агар микробиологический - 18,0. Среду кипятят до полого растворения ингредиентов, устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси добавляют глюкозу - 10,0; глицерина - 20,0; натрий метабисульфит - 0, 3; тщательно перемешивают разливают по 330 мл питательной среды в градуированные флаконы объемом 450 мл, перекрывают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт, фиксируют резиновым кольцом, стерилизуют при 1 атм. в течение 20 мин. После стерилизации, охлаждают до 56°С, стерильно над факелом добавляют в каждый флакон по 40,0 мл сыворотки крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкой (т.е 120,0 мл на 880,0 мл среды), затем разливают на чашки Петри по 35-40 мл приготовленной питательной среды. Подсушенные чашки помещают в термостат на 48 ч при 37°С, проверяют на стерильность.

Сочетанное применение выше описанных ингредиентов, обеспечивает существенное усиление ростовых качеств при культивирования возбудителя бруцеллезного микроба в значительно ранние сроки на 2-3 сутки на пластинках питательного агара. Готовую питательную среду плотную используют для культивирования возбудителя бруцеллеза Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M.

Эффективность полученной среды оценивают в соответствии с методическими указаниями (МУ 3.3.2.2124-06) «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2007 г., с использованием вирулентных культур: Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M.

Испытуемые культуры выращивают в бактериологических пробирках на поверхности скошенного агара рН 7,2±0,1 при температуре 37°С в течение 48 ч. Из двухсуточных культур тест-штаммов бруцелл смывают с поверхности скошенного агара 0,9% раствором натрия хлорида, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ НЦЭСМП МЗ России, эквивалентную 1,7×10⁹ бруцелл 1 мл. Полученную микробную взвесь культуры разводят сначала до концентрации 1×10^-9 м.к./мл затем серийными десятикратными разведениями до 1×10⁶ и 1×10⁷ м.к./мл. В процессе разведения перенос взвеси в следующую пробирку производят стерильной пипеткой объемом 1 мл, меняя пипетку для каждого разведения. По 0,1 мл каждой культуры: Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M из разведений 10^-6 (100 м.к.) и 10^-7 (10 м.к.) высевают на 3 чашки Петри с испытуемыми средами и равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С.

Оценку ростовых свойств питательной среды плотной для культивирования возбудителя бруцеллеза Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M проводят путем подсчета количества выросших колоний бруцелл посуточно на пластинках агара с плотной питательной средой через каждые 24-48-72-120 ч. В качестве контроля использовали бруцеллагар.

Пример 1. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду - 800,0 мл; пептон сухой ферментативный - 8,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую - 90,0; натрий хлористый - 4,0; глюкозу - 5,0; глицерин - 15,0; натрия метабисульфит - 0, 1; агар микробиологический - 14,0.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M начинали формироваться через 52 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10^-6 разведения вырастает 132; 36; 51; 99 колоний диаметром 1,5 мм соответственно, из 10^-7 разведения вырастает 12; 8; 3; 11 колонии соответственно типичных по морфологии бруцеллезному микробу, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10^-6 и 10^-7 разведений вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний соответственно диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар - питательная среда темно- коричневого цвета в микроскоп не просматривается морфология колоний.

Пример 2. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду - 1000,0; пептон сухой ферментативный - 10,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую - 120,0; натрий хлористый - 5,0; глюкозу - 10,0; глицерин - 20,0; натрия метабисульфит - 0, 3; агар микробиологический - 18,0.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M начинали формироваться через 48 ч отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10^-6 разведения вырастает 184; 50; 86; 134 колоний диаметром 1,5 мм соответственно, из 10^-7 разведения вырастает 22; 12; 4; 18 колонии соответственно типичных по морфологии бруцеллезному микробу, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10^-6 и 10^-7 разведений вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний соответственно диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар - питательная среда темно- коричневого цвета в микроскоп не просматривается морфология колоний.

Пример 3. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду - 1200,0; пептон сухой ферментативный - 12,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую - 150,0; натрий хлористый - 6,0; глюкозу -

При таком соотношении ингредиентов колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M на испытуемой среде начинали формироваться через 67 ч, через 76 ч (на 3 сутки - 4 сутки) отмечался интенсивный рост колоний, при посеве 0,1 мл из разведения 10^-6 вырастало 102; 25; 39; 72 колоний указанных штаммов, соответственно, диаметром 1,5 мм. Из разведения 10^-7 вырастало 8; 7; 4; 8 типичных по морфологии колоний вышеуказанных штаммов, соответственно, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, через 72 ч (на 3 сутки) отмечался интенсивный рост колоний, при посеве по 0,1 мл из разведений 10^-6 и 10^-7 вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний указанных штаммов, соответственно, диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар - питательная среда темно-коричневого цвета, морфология колоний в микроскоп не просматривается.

Таким образом, заявленная питательная среда плотная для культивирования возбудителя бруцеллеза (пример №2) является оптимальной по количеству подобранных ингредиентов, что позволяет получить достаточное количество колоний в максимально ранние сроки -через 48 ч, а через 72 ч отмечается увеличение колоний до 1,5 мм в диаметре.