НЕИНВАЗИВНЫЙ СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к созданию неинвазивного способа повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и может быть использовано для доставки лекарственных препаратов в мозг и лечения болезней центральной нервной системы.

Известен способ повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера (см. патент РФ № 2391107, МПК А61К33/14, опуб.10.06.2010), заключающийся во введении озонированного физиологического раствор, при этом введение осуществляют интракаротидно однократно с концентрацией озона 0,7 мг/л и дозой озона 0,0035 мг/кг. Способ позволяет обеспечить увеличение времени проницаемости гематоэнцефалического барьера.

Однако, способ является инвазивным. Кроме того, он трудоёмок и сложен в исполнении, так как предусматривает интракаротидное введение озона.

Известен способ раскрытия гематоэнцефалического барьера в головном мозге субъекта неинвазивным методом (см. WO 2007 035721, МПК А61N 1/00, опуб. 29.03.2007), заключающийся в воздействии на мозг ультразвукового излучения, при этом применяют фокусированный ультразвуковой луч с частотой 1,525 МГц, скоростью распространения около 10 Гц и длительностью импульса 20 мс.

Однако, применение ультразвукового воздействия для открытия ГЭБ мало эффективно, поскольку для доставки лекарственных препаратов в ткани мозга наряду с таким воздействием необходимо дополнительное применение микрокапсул, что усложняет способ и приводит к значительным затратам для его реализации. Кроме этого, воздействие мощной ультразвуковой волны приводит к нагреву до 40^оС циркулирующих в крови микрокапсул, что приводит наряду с повышением проницаемости ГЭБ и к таким негативным последствиям, как мозговые геморрагии и отек тканей головного мозга.

Наиболее близким к заявляемому является неинвазивный способ повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера (см. статью «Новый неинвазивный метод повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера с помощью звука» авторов Гекалюк А.С., Уланова М.В., Бодрова А.А., Сагатова М.М., Федорова В.А. Семячкина-Глушковская О.В. https://medconfer.com ID: 2017-03-4353-T-14953), заключающийся в воздействии на мозг звука (110 дБ, 370 Гц). Способ позволяет повысить проницаемость ГЭБ в течение 4-х часов, что подтверждается проникновением в ткани мозга некоторых высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ, а также воды.

Однако, звук оказывает воздействие на все отделы мозга и не обеспечивает избирательного эффекта. Метод может быть применен для доставки лекарственных препаратов при общем лечении тканей мозга, когда не требуется воздействие на определенные центры, например, при болезни Альцгеймера и депрессиях. Использование данного метода для лечения многих других заболеваний мозга, таких как инсульт, онкология, аневризмы, травмы невозможно.

Техническая проблема способа заключается в повышении эффективности проницаемости гематоэнцефалического барьера за счёт глубокой проникающей способности лазерного излучения, воздействующего неинвазивно, при расширении возможностей лечения широкого спектра заболеваний мозга, безопасности и экономичности метода.

Технический результат заключается в осуществлении целенаправленного и дозированного лазерного воздействия на ткани мозга с заданной глубиной (250 мкм), осуществляемого стереотаксически, без повреждений кожи и черепа.

Техническая проблема изобретения решается тем, что в неинвазивном способе повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера путём воздействия излучения, согласно изобретению, воздействуют лазерным излучением длиной волны 1268 нм с мощностью 10-300 мВ в течение 3-17 минут.

Для достижения максимально высоких результатов воздействие осуществляют с мощностью 70 мВ в течение 7 минут.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способа повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера путём неинвазивного целенаправленного и дозированного воздействия на череп и кожу лазерного излучения длиной волны 1268 нм с мощностью 10-300 мВ в течение 3-17 минут, приводящее к открытию ГЭБ.

С помощью лазера 1268 нм ГЭБ открывается обратимо (на 1 час), после чего отмечается быстрое восстановление барьерной функции мозга, что важно для подтверждения безопасности применения предлагаемого способа. Интенсивность лазерного воздействия контролируются временем и мощностью лазерного излучения.

Путем случайного экспериментального подбора выходной мощности лазера в опытах на мышах по тестированию проницаемости ГЭБ к высокомолекулярным веществам, таким как белковый комплекс краски Evans Blue (68 кДа), установлено, что наиболее эффективная выходная мощность лазера для открытия ГЭБ – 70 мВ, когда концентрация указанной краски увеличивается в 36 раз по сравнению с контролем (p<0.001). Применение меньших мощностей и даже сверх мощного лазерного воздействия (в 10 раз превышающего минимальную мощность) приводит к менее эффективному открытию ГЭБ: 10 мВ – в 20 раз (p<0.001), 30 мВ в – в 31 раз (p<0.001), 300 мВ – в 23 раза (p<0.001). Сверхмощное воздействие приводит к длительному восстановлению ГЭБ, что лимитирует применение высоких мощностей лазера.

Эффективное время воздействия лазера на ГЭБ также устанавливается путем случайного подбора наиболее значимых изменений в проницаемости ГЭБ для высоко- и низкомолекулярных соединений. Выявлено, что время, достаточное для развития эффективного воздействия лазера на всех мощностях – 7 мин, применение меньшего времени не оказывает эффектов на ГЭБ. Увеличение времени до 25 мин приводит к одинаковым изменениям со стороны ГЭБ, что и 7 мин лазерного воздействия. Дальнейшее увеличение лазерного излучения не приводит к более выраженному повышению проницаемости ГЭБ, однако, оказывает негативные воздействия на стенки сосудов в виде мелких диапедезных кровоизлияний.

Применение лазера 1268 нм не требует дополнительного использования фотосенсибилизаторов, т.к. лазер сам генерирует образование синглетного кислорода, который стимулирует открытие ГЭБ за счет временного раздражения мембран сосудов мозга (см. статью O.V.Semyachkina-Glushkovskaya, S.G. Sokolovski, A. Goltsov, A.S. Gekaluyk, O.A. Bragina, E.I. Saranceva, V.V. Tuchin, E.U. Rafailov. Laser-induced generation of singlet oxygen and its role in the cerebrovascular physiology / Progress in Quantum Electronics. 2017, Vol. 55, P.112-128).

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».

Способ поясняется иллюстрациями, где представлены:

на фиг. 1 - результаты конфокальной микроскопии проницаемости ГЭБ для декстрана с молекулярной массой 70 кДа до воздействия лазерного излучения и после;

на фиг. 2 - данные гистологического исследования проницаемости ГЭБ для воды до и после воздействия лазерного излучения;

на фиг. 3 - результаты конфокальной микроскопии проницаемости ГЭБ для липосом (100 нм) до и после воздействия лазерного излучения.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут лазер с длиной волны 1268 нм.

Объект исследования (в нашем случае это беспородная белая мышь) фиксируют в стереотаксической установке на расстоянии от источника излучения, исходя из выбранной дозы.

Воздействуют излучением лазера мощностью 10-300 мВ в течение 3-17 минут, при этом воздействие осуществляют целенаправленно на выбранную область мозга, не травмируя кожу черепа, на максимальную глубину (250 мкм), обусловленную проникающей способностью лазера.

Эксперименты проводились на беспородных белых мышах, которых разделяли на группы для подбора эффективности мощности и времени лазерного воздействия. Выбирают низкие мощности от 10 до 70 мВ и одну сверхмощную – 300 мВ, т.е. в 10 раз превышающую самую низкую возможную мощность лазера.

На каждую тестируемую мощность лазера также методом подбора выявляют эффективное время лазерного излучения. Время выбирают произвольно от 3 до 25 мин на каждую выходную мощность лазера.

В качестве примера, для достижения предлагаемого способа было сформировано 16 групп мышей по 8 особей в каждой: 10 мВ – 3 мин, 10 мВ – 7 мин, 10 мВ – 17 мин, 10 мВ – 25 мин; 30 мВ – 3 мин, 30 мВ – 7 мин, 30 мВ – 17 мин, 30 мВ – 25 мин; 70 мВ – 3 мин, 70 мВ – 7 мин, 70 мВ – 17 мин, 70 мВ – 25 мин; 300 мВ – 3 мин, 300 мВ – 7 мин, 300 мВ – 17 мин, 300 мВ – 25 мин.

В каждой группе через 1 час после применения лазерного воздействия мозг каждой особи забирали для оценки эффективности повышения проницаемости ГЭБ к высоко- и низкомолекулярным соединениям. Время 1 час выбрано в соответствии с предыдущими исследованиями, где было показано, что вне зависимости от типа воздействия, ГЭБ открывается через 1-1.5 часа после воздействия (см, например, прототип к данной заявке - статью Гекалюк А.С., Уланова М.В., Бодрова А.А., Сагатова М.М., Федорова В.А., Семячкина-Глушковская О.В. https://medconfer.com ID: 2017-03-4353-T-14953).

Для оценки проницаемости ГЭБ для высокомолекулярных соединений были выбраны тесты с краской Evans Blue и декстран, которые рекомендованы для анализа эффективного открытия ГЭБ (A. Hoffmann, J. Bredno, M. Wendland, N. Derugin, P. Ohara, and M. Wintermark, “High and low molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran to assess blood-brain barrier disruption: technical consideration,” Transl. Stroke Res. 2(1), 106–111 (2011)). Все описанные выше группы были использованы для введения краски. Дополнительно (по 5 особей в каждой выше указанной группе) были сформированы такие же группы для введения декстрана.

Подробное описание протоколов введения представлено в статье (Semyachkina-Glushkovskaya O., Kurths J., Borisova E., Sokolovsky S., Mantareva N., Angelov I., Shirokov A., Navolokin N., Shushunova N., Khorovodov A., Ulanova M., Sagatova M., Ahranovich I., Sindeeva O., Gekalyuk A., Bordova A., Rafailov E. Photodunamic opening of blood-brain barrier / Biomedical Optics Express. 2017. 8(11): https://doi.org/10.1364/BOE.8.005040).

Исследования проводили следующим образом. Каждой мыши через 1 час после лазерного воздействия внутривенно через хвостовую вену вводили краску Evans Blue (Sigma Chemical Co., St. Louis, MI, USA, 2 мг/25 г мыши, 1% раствор), которая циркулировала в крови 30 мин в соответствии со стандартным протоколом, далее проводили перфузию тканей мозга путем введения 20 мл физиологического раствора через левое предсердие. Далее животное декапитировали, мозг извлекали и проводили протокол спектрофлуориметрического определения содержания краски в тканях мозга, описанного в данной публикации (H. L. Wang and T. W. Lai, “Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples,” Sci. Rep. 4,6588 (2014)).

Краткое содержание протокола: готовят 1% раствор Evans Blue, растворяя в 0.9% физиологическом растворе; фильтруют; вводят краску внутривенно, медленно; осуществляют циркуляцию Evans Blue в течение 30 минут; осуществляют декапитацию, затем гомогенизацию мозга; добавляют к гомогенату1 мл физиологического раствора и оставляют на 1 час при комнатной температуре; центрифугируют в течение 10 минут на 10000 оборотах, фильтруют; в профильтрованную часть добавляют трихлоруксусную кислоту 50% в соотношении 1:3; центрифугируют в течение 10 минут на 10000 оборотах; фильтруют; в профильтрованную часть добавляют спирт 96% в соотношении 1:3; оценивают результат спектрофлуориметрически 620/680 нм.

Наиболее яркие результаты экспериментов представлены в таблице.

Декстран (Sigma Chemical Co., St. Louis, MI, USA, 4 мг/25 г мыши, 0.5 % раствор) вводили внутривенно через хвостовую вену через 1 час после лазерного воздействия с последующей циркуляцией в крови 5 мин. После чего животное декапитировали, мозг извлекали, помещали в буферный формалин 4% и на следующий сутки делали срезы на вибротоме (Leica VT 1000S Microsystem, Germany) толщиной 50 мкм.

Таблица

Показатели повышения проницаемости ГЭБ в зависимости от интенсивности лазерного воздействия

*p<0.05 относительно контроля

Оценивали на конфокальном микроскопе (Olympus FV10i-W, Olympus, Japan) выход декстрана из сосудов мозга по следующим визуальным показателям:

Слабый эффект – просачивание декстрана в виде слабого флуоресцентного свечения (облако) вокруг одного сосуда;

Средний эффект - просачивание декстрана в виде сильного флуоресцентного свечения (облако) вокруг одного сосуда;

Сильный эффект - просачивание декстрана в виде сильного флуоресцентного свечения (облако) вокруг группы сосудов;

Диффузный эффект - просачивание декстрана в виде сильного флуоресцентного свечения (облако) вокруг нескольких групп сосудов.

Результаты представлены на фигуре 1.

В группах с введением декстрана мозг также исследовали гистологически для оценки проницаемости ГЭБ для низкомолекулярных соединений, таких как вода. Для этого мозг после формалина помещали в парафин и делали срезы толщиной 4 мкм. Эффект оценивали по появлению пустот вокруг сосудов на гистологических срезах. Результаты представлены на фигуре 2.

В качестве примера, доказывающего эффективность заявляемого способа, изучали доставку в ткани мозга флуоресцентных дипосом 100 нм (25 мМоль в 1 мл физиологического раствора), которые были предоставлены для экспериментов федеральным государственным бюджетным учреждением науки, институтом биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Описание синтеза липосом представлено в данной публикации (Boldyrev, I.A. et al. New BODIPY lipid probes for fluorescence studies of membranes. J. Lipid Res. 48, 1518-1532 (2007)). Липосомы являются нанотранспортными системами, которые разработаны для преодоления ГЭБ путем их прохождения через зазоры в эндотелиацитах за счет их фосфолипидной природы, т.е. такой же как в мембранах всех клеток (Alyautdin R., Khalin I., Nafeeza M.I., Haron M.H., Kuznetsov D. Nanoscale drug delivery systems and the blood–brain barrier / International Journal of Nanomedicine 2014:9 795–811).

Эксперименты выполняли в двух группах животных. Контрольная группа составила 5 мышей, которым вводили внутривенно через хвостовую вену липосомы в объемной единице 0.1 мл (2.5 мМоль липосом), давали циркулировать в крови 5 мин и далее животных декапитировали, забирали мозг и помещали в забуференный формалин 4% на сутки. На следующий день делали среды на вибротоме (Leica VT 1000S Microsystem, Germany) толщиной 50 мкм и оценивали на конфокальном микроскопе (Nikon TE 2000 Eclipse, Tokyo, Japan) просачивание липосом через ГЭБ с использованием специального маркера эндолиацитов церебральных сосудов (SMI-1). Для этого на срезы мозга за сутки до эксперимента добавляли первичные антитела SMI-1 (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Через сутки перед проведением конфокальной микроскопии добавляли вторичные антитела (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, Alexa Four 555; Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) для достоверной оценки эффекта прохождения липосом за пределы сосудистой стенки. Положительным эффектом считалось наличие флуоресцентного сигнала от липосом (497/504 нм) за пределами сосудистой стенки.

Результаты исследований показали, что в контроле липосомы не способны проходит через ГЭБ (фигура 3, слева).

Вторая группа мышей в количестве 8 имела тот же протокол, что и контроль, но с использованием лазерного воздействия 1268 нм (70 мВ в течение 7 мин). Данные параметры были выбраны исходя из наиболее значимых результатов, полученных при тестировании лазерного воздействия на проницаемость ГЭБ по показаниям концентрации Evans Blue в тканях мозга (см. таблицу).

Результаты исследования выявили прохождение липосомами ГЭБ под воздействием лазерного излучения (Фигура 3, справа).

Во всех исследованиях, приведенных выше, проводили измерения температуры на поверхности кожи с применением бесконтактного термометра (Pico USB TC-08 thermocouple data logger (USA)). Результаты показали, что применение указанных характеристик лазера не сопровождалось повышением температуры тканей кожи головы и черепа, что исключает вклад температурных воздействий на ГЭБ и подтверждает прямое влияние лазера на барьерную функцию мозга.

Разработанный метод обладает большими преимуществами перед существующими способами открытия ГЭБ.

Во-первых, лазер 1268 нм обладает высокой проникающей способностью, в силу чего не требуется применения инвазивных процедур, которые присутствуют в других методах. Не надо проводить трепанацию черепа и снимать часть скальпа.

Во-вторых, лазер 1268 нм сам продуцирует синглетный кислород, что делает возможным его применение без дополнительного введения фотосенисибилизаторов, которые обладают рядом ограничений их применения в медицине.

В-третьих, открытие ГЭБ обратимо и происходит без повреждения тканей мозга, что делает разработанный метод безопасным в применении и дает преимущества для широкого внедрения в повседневную клинику.

Разработанная технология предназначена как для доставки лекарственных препаратов в мозг, включая наноматериалы, так и для лечения заболеваний центральной нервной системы с помощью прямой генерации синглетного кислорода.