Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ - АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С ПЛАЗМЫ КРОВИ

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения протеолитических ферментов - активаторов протеина С плазмы крови человека.

Активаторы протеина С используются в медицине для диагностики содержания протеина С в плазме крови человека. При недостатке протеина С в крови снижается активность его активированной формы, что обусловливает возникновение тромбоэмболических осложнений с возможным летальным исходом [1]. В связи с этим актуальным является диагностика содержания протеина С в крови [2], которую осуществляют с использованием в диагностических препаратах (Protac^® фирмы PENTHAPHARM (Швейцария)) специфических протеиназ - активаторов протеина C [3].

Известен способ получения активатора протеина С из яда щитомордника Agkistrodon contortrix contortrix [4]. Его недостатком является крайняя сложность добывания и ограниченность яда щитомордника как источника активатора протеина C.

Известен способ получения активатора протеина C с использованием штаммов микроскопических грибов Aspergillus ochraceus 1, Penicillium claviforme 2, P. granulatum 7, Alternaria sp.10, культуральная жидкость которых обладает антикоагулянтными свойствами [5].

Известен способ получения активатора протеина С с использованием штамма Aspergillus ochraceus 513 [6].

Наиболее близким к предлагаемому способу, который следует принять за ближайший аналог, является способ получения активатора протеина С путем культивирования в течение 7 суток штамма Aspergillus ochraceus 1 - наиболее активного продуцента активатора протеина С на посевной среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон, и ферментационной среде, содержащей (в %): глюкозу - 3,5, крахмал - 1,0, соевую муку - 2,0, мясной экстракт - 0,5, пептон - 0,5, NaCl - 0,2, КН₂РO₄ - 0,05, MgSO₄·7H₂O - 0,05, начальный рН 5,5, позволяющий получить культуральную жидкость, содержащею протеиназу - активатор протеина C с антикоагулянтной активностью 854% [5], определенной по удлинению активированного частичного тромбопластинового времени плазмы крови человека [7].

Недостатками ближайшего аналога являются низкий выход фермента и продолжительное время ферментации (7 суток).

Задачей настоящего изобретения является повышение выхода активатора протеина С, сокращение времени ферментации и разработка стандартных условий для его получения.

Задача решается:

1) с помощью использования штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D - продуцента активатора протеина С;

2) с помощью использования штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4105D - продуцента активатора протеина С;

3) с помощью использования штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4106D - продуцента активатора протеина С;

4) с помощью использования штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4107D - продуцента активатора протеина С;

5) разработкой нового способа получения внеклеточных протеиназ - активаторов протеина С, предусматривающего двухстадийное культивирование продуцирующих его штаммов микроскопического гриба Aspergillus ochraceus - на посевной среде, содержащей сусло глюкозу и пептон, и ферментационной среде, содержащей глюкозу, крахмал, пептон, хлорид натрия, дигидрофосфат калия и сульфат магния, отличающуюся тем, что в ферментационной среде соевую муку и мясной экстракт заменяют на гидролизат рыбной муки, и устанавливают более высокое значение начального рН среды, при следующем соотношении компонентов (%):

Начальный рН 6,5.

Выделение внеклеточных ферментов с активаторным к протеину С действием из культуральной жидкости проводят известными методами с помощью осаждения белков сульфатом аммония до степени насыщения 80%, растворением в минимальном объеме дистиллированной воды. Сформированные осадки центрифугируют, растворяют в 0,005 М Трис-НСl буфере (рН 8,2) или дистилированной воде, удаляют нерастворимую часть осадков, а для удаления солей аммония раствор диализуют при 4°C против того же буфера или проводят гель-фильтрацию на колонках с сефадексом G-25 [5]. Полученный раствор протеиназы - активатора протеина С хранят в холодильнике при 4°С или лиофилизируют для длительного хранения.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4104D выделен Кураковым А.В. на среду Чапек-агар, из образцов погребенной почвы, отобранной в Краснодарском крае (п.Сенной, раскоп древнегреческого города Фанагории).

Штамм Aspergillus ochraceus депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов под номером BKM F-4104D.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4104D относится к митоспоровым грибам -анаморфам аскомицетного аффинитета: рода Emericella, семейства Trichocomaceae, порядка Eurotiales, класса Eurotiomycetes, отдела Ascomycota.

Культурально-морфологические признаки

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4104D имеет типичные для этого вида культурально-морфологические признаки [8, 9]. Колонии на средах Чапека и сусло-агаре достигают среднем 3,5 см в диаметре на 10 сут, плоские, бархатистые, ярко-охристого цвета, с мелкими каплями эксудата. Обратная сторона красновато-коричневых тонов. Конидиальные головки шаровидные, при старении распадаются на 2-4 компактные колонки светло-охристо-коричневого цвета. Конидиеносец двуярусный с плотнорасположенными по всей везикуле метулами (15-20×5-6 мкм) и фиалидами размером (7-13×2-3) мкм. Конидиеносцы диаметром 7-9 мкм, гладкие, неокрашенные до желтоватых тонов, расширение конидиеносца округлое, конидии округлые, гладкие, 3,0-3,5 мкм.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм хорошо растет на стандартных средах: сусло-агаре, среде Чапека, среде Гетчинсона, глюкозо-пептонной среде при температуре 25°С. Спороношение штамм начинает на 4-5 сут, обильноспороносящие колонии формирует к 10 суткам. Штамм термотолерантный, способен расти в интервале температур 8°С-42°С. Споры сохраняют жизнеспособность при прогревании в почве в течение нескольких часов при температуре 60°С. На питательных средах растет в широком диапазоне рН, включая кислую (до рН 2,5-3,0) и слабощелочную область (рН 7-9). Штамм обладает протеолитической (казеинолитической), целлюлозолитической и ксиланазной (гидролизует целлюлозу, гемицеллюлозу) и липолитической активностью.

Штамм поддерживают на косяках с сусло-агаром 4-5°Б с начальным рН 6,0-6,2 или стандартной среде Чапек-агар при комнатной температуре с пересевом через 1-3 месяца, а при хранении при 5°C с пересевом через 6-12 месяцев.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4104D является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом. При внутривенном заражении кроликов не проявляет зоопатогенных свойств. При нанесении экстракта культуры штамма на кожу кролика не вызывает токсической реакции.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4105D выделен А.В.Кураковым выделен из образцов растительных остатков на сусло-агар.

Штамм Aspergillus ochraceus депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов под номером BKM F-4105D.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4105D относится к митоспоровым грибам -анаморфам аскомицетного аффинитета: рода Emericella, семейства Trichocomaceae, порядка Eurotiales, класса Ewotiomycetes, отдела Ascomycota.

Культурально-морфологические признаки

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4105D имеет типичные для этого вида культурально-морфологические признаки [8, 9]. Колонии на средах Чапека и сусло-агаре достигают 2,5-3,5 см в диаметре на 10 сут, плоские, бархатистые, охристого цвета с мелкими каплями эксудата. Обратная сторона коричнево-красноватых тонов. Образует шаровидные склероции красноватого цвета. Конидиальные головки шаровидные, при старении распадаются на 2 компактные колонки светло-охристо-коричневого цвета. Конидиеносец двуярусный, по всей везикуле плотно расположены метулы (15-20×5-6 мкм) и фиалиды размером (7-13×2-3) мкм. Конидиеносцы гладкие, неокрашенные до желтоватых тонов, расширение конидиеносца округлое, конидии округлые, гладкие, 3,5-4,0 мкм.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм хорошо растет на стандартных средах: сусло-агаре, среде Чапека, среде Гетчинсона, глюкозо-пептонной среде при температуре 25°С. Спороношение штамм начинает на 4-5 сут, обильноспороносящие колонии формирует к 10 суткам. Штамм термотолерантный, способен расти в интервале температур 8°С-42°С. Штамм обладает протеолитической (казеинолитической) и целлюлозолитической активностью. Штамм поддерживают на косяках с сусло-агаром 4-5°Б с начальным рН 6,0-6,2 или стандартной среде Чапек-агар при комнатной температуре с пересевом через 1-3 месяца, а при хранении при 5°С с пересевом через 6-12 месяцев.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4105D является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом. При внутривенном заражении кроликов не проявляет зоопатогенных свойств. При нанесении экстракта культуры штамма на кожу кролика не вызывает токсической реакции.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4106D выделен А.В.Кураковым из образцов черноземной почвы на карбонатных породах, которые были отобраны им в степной зоне Воронежской области. Штамм выделен на приманку - фильтровальную бумагу, пропитанную сливочным маслом из водно-почвенной суспензии при инкубации в течение 7 сут при 49°С, а затем при 20°С и пересеян на сусло-агар.

Штамм Aspergillus ochraceus депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов под номером BKM F-4106D.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4106D относится к митоспоровым грибам - анаморфам аскомицетного аффинитета: рода Emericella, семейства Trichocomaceae, порядка Eurotiales, класса Eurotiomycetes, отдела Ascomycota.

Культурально-морфологические признаки

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4106D имеет типичные для этого вида культурально-морфологические признаки [8, 9]. Колонии на средах Чапека и сусло-агаре достигают в среднем 3,5 см в диаметре на 10 сут, плоские, могут иметь радиальную складчатость, бархатистые, охристого, темно-охристого до коричневого цвета. Обратная сторона коричневых тонов, могут проявляться красноватые тона, край колонии светло-окрашенный. Конидиальные головки шаровидные, при старении распадаются на 2 компактные колонки светло-охристо-коричневого цвета. Конидиеносец двухярусный, по всей везикуле с плотно расположенными метулами (15-20×5-6 мкм) и фиалидами размером (7-13×2-3) мкм. Конидиеносцы 300-1500 мкм, диаметром 9 мкм, гладкие, слегка шероховатые, неокрашенные до желтоватых, светло-коричневатых тонов, расширение конидиеносца округлое, конидии округлые, гладкие до слабо мелкошероховатых, 3,5-4,0 мкм,

Физиолого-биохимические признаки

Штамм хорошо растет на стандартных средах: сусло-агаре, среде Чапека, среде Гетчинсона, глюкозо-пептонной среде при температуре 25°С. Спороношение штамм начинает на 4-5 сут, обильноспороносящие колонии формирует к 10 суткам. Штамм термотолерантный, способен расти в интервале температур 8°С-46°С. Споры сохраняют жизнеспособность при прогревании в почве в течение нескольких часов при температуре 60°С. На питательных средах растет в широком диапазоне рН, включая щелочную область (рН 7-10). Штамм обладает протеолитической (казеинолитической), целлюлозолитической и ксиланазной (гидролизует целлюлозу, гемицеллюлозу) и липолитической активностью. Продуцирует алкалостабильные липазы.

Штамм поддерживают на косяках с сусло-агаром 4-5°Б с начальным рН 6,0-6,2 или стандартной среде Чапек-агар при комнатной температуре с пересевом через 1-3 месяца, а при хранении при 5°C с пересевом через 6-12 месяцев.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4106D является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом. При внутривенном заражении кроликов не проявляет зоопатогенных свойств. При нанесении экстракта культуры штамма на кожу кролика не вызывает токсической реакции.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4107D выделен А.В.Кураковым из образцов серозема (Туркмения), на среду Гетчинсона с микрокристаллической целлюлозой при инкубации чашек Петри в течение 7 сут при 54°С, а затем в течение 7 суток при 20°С.

Штамм Aspergillus ochraceus депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов под номером BKM F-4107D.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4107D относится к митоспоровым грибам -анаморфам аскомицетного аффинитета: рода Emericella, семейства Trichocomaceae, порядка Eurotiales, класса Eurotiomycetes, отдела Ascomycota.

Культурально-морфологические признаки

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4107D имеет типичные для этого вида культурально-морфологические признаки [8, 9]. Колонии на среде Чапека бархатистые, обильноспороносящие, охристого и темно-охристого цвета, 3,5 см в диаметре, плоские и со складками, темно-охристого цвета, обратная сторона - оранжевато-коричневого цвета, может иметь красноватые оттенки. Образует колонии с зонами более светлого мицелия с меньшим спороношением диаметром до 4,5 см и светло-коричневой обратной стороной. Конидиальные головки шаровидные, при старении распадаются на 2-3 компактные колонки. Конидии округлые, гладкие, диаметром 3,5 мкм. Молодой конидиеносец диаметром 4-5 мкм, с возрастом окрашенный, гладкий, диаметром 10 мкм.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм хорошо растет на стандартных средах: сусло-агаре, среде Чапека, среде Гетчинсона, глюкозо-пептонной среде при температуре 25°С. Спороношение штамм начинает на 4-5 сут, обильноспороносящие колонии формирует к 10 суткам. Штамм обладает протеолитической (казеинолитической) и целлюлозолитической активностью. Штамм термостабильный, выдерживает прогревание в течение 1 час при 100°С, растет при температуре до 43°С. Штамм поддерживают на косяках с сусло-агаром 4-5°Б с начальным рН 6,0-6,2 или стандартной среде Чапек-агар при комнатной температуре с пересевом через 1-3 месяца, а при хранении при 5°C с пересевом через 6-12 месяцев.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4107D является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом. При внутривенном заражении кроликов не проявляет зоопатогенных свойств. При нанесении экстракта культуры штамма на кожу кролика не вызывает токсической реакции.

Пример 1

Посевной материал Aspergillus ochraceus BKM F-4104D выращивают в пробирках скошенного сусло-агара 4-5° Балинга. Засев производят спорами гриба, используют хорошо заспоровавшуюся культуру 6-8 суточного возраста. Споры смывают с поверхности агара стерильной посевной средой, содержащей сусло, глюкозу и пептон в эту же среду. Засеянные колбы выращивают на качалке с 200 об/мин при 28°С. Спустя 2 суток часть выращенного материала переносят в колбы объемом 750 мл со 100 мл ферментационной среды следующего состава (в %):

Начальный рН 6,5.

По истечении 2 суток культивирования мицелий отделяют от среды фильтрованием через бумажный фильтр.

Далее проводят осаждение ферментов культуральной жидкости сульфатом аммония до степени насыщения 80%. Сформированные осадки центрифугируют, растворяют в 0,005 М Трис-НСl буфере (рН 8,2) и диализуют при 4°С против этого же буфера.

Антикоагулянтную активность полученного раствора белков культуральной жидкости определяют по удлинению активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) плазмы крови человека. Тест используют для оценки активации протеина С в форму, которая инактивирует факторы Va и VIIIa свертывания крови. Удлинение АЧТВ определяют по методу, рекомендованному НИИ гематологии и переливания крови (г.Вятка) в следующей модификации [5, 7]. Готовят смесь из 0,1 мл стандартной плазмы крови, 0,1 мл препарата ферментов гриба в физиологическом растворе, 0,1 мл суспензии каолина. Смесь инкубируют в течение 2 мин на водяной бане при 37°С при постоянном перемешивании, после чего добавляют 0,1 мл водного раствора хлорида кальция (0,277%). Время свертывания измеряют секундомером. В контроле вместо испытуемого раствора используют эквивалентное количество физиологического раствора (0,86%-ный раствор хлорида натрия). Относительное АЧТВ рассчитывают по формуле (А-В)×100%/В, где А - время свертывания плазмы в присутствии испытуемого раствора протеаз гриба (сек), В - время свертывания плазмы в контроле (сек). Повторность - 3-кратная.

Антикоагулянтная активность раствора белков культуральной жидкости штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D по АЧТВ составляет 1030%.

Для установления того, что антикоагулянтная активность обусловлена действием протеиназы - активатора протеина С, активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4106D в культуральной жидкости определяют по методике [10] с использованием хромогенного пептидного субстрата pGlu-Pro-Arg-pNA (пироглутамил-пролил-аргинил-пара-нитроанилид) [11, 12]. Активированный протеин С плазмы крови специфично отщепляет п-нитроанилин (pNA) от pGlu-Pro-Arg-pNA. За единицу активности активатора протеина С принимают то количество фермента, которое отщепляет 1 мкмоль·10^-3 п-нитроанилина (pNA) от pGlu-Pro-Arg-pNA за 1 мин в 1 мл при рН 8,2 и 37°С.

Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D в культуральной жидкости составляет 83,2 ед/мл.

Пример 2

Культуральную жидкость штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D получают по примеру 1, но используют питательную среду следующего состава (в %):

Начальный рН 6,5.

В культуральной жидкости обнаруживают активаторную к протеину С активность 85,3 ед/мл.

Пример 3

Культуральную жидкость штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D получают по примеру 1, но используют питательную среду следующего состава (в %):

Начальный рН 6,5.

В культуральной жидкости обнаруживают активаторную к протеину С активность 86,6 ед/мл.

Пример 4

Культуральную жидкость штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D получают по примеру 1, но используют питательную среду следующего состава (в %):

Начальный рН 6,5.

В культуральной жидкости обнаруживают активаторную к протеину С активность 86,0 ед./мл.

В таблице 1 приводятся данные по активаторной к протеину С активности культуральной жидкости Aspergillus ochraceus BKM F-4104D при различной концентрации компонентов в ферментационной среде.

Пример 5

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4105D выращивают и получают культуральную жидкость и ферментный препарат активатора протеина С по примеру 1. Активность активатора протеина С в культуральной жидкости штамма BKM F-4105D по описанной в примере 1 стандартной рекомендованной методике [10] достигает 85,0 ед./мл. Активность активатора протеина С у штамма BKM F-4105D, определенная по АЧТВ, составляет 1020%.

Пример 6

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4106D выращивают и получают культуральную жидкость и ферментный препарат активатора протеина С по примеру 1. Активность активатора протеина С в культуральной жидкости штамма BKM F-4106D по описанной в примере 1 стандартной рекомендованной методике [10] достигает 89,9 ед./мл. Активность активатора протеина С у штамма BKM F-4106D, определенная по АЧТВ, составляет 1032%.

Пример 7

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4107D выращивают и получают культуральную жидкость и ферментный препарат активатора протеина С по примеру 1.

Активность активатора протеина С в культуральной жидкости штамма ВКМ F-4107D по описанной в примере 1 стандартной рекомендованной методике (10) - достигает 85,2 ед./мл.

Активность активатора протеина С у штамма ВКМ F-4107D, определенная по АЧТВ, составляет 1024%.

Пример 5. Сравнение предлагаемого способа и ближайшего аналога

Сравнение активаторной к протеину С активности в культуральной жидкости у штаммов Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D, Aspergillus ochraceus ВКМ F-4105D, Aspergillus ochraceus ВКМ F-4106D, Aspergillus ochraceus ВКМ F-4107D при культивировании на ферментационной среде с начальным рН 6,5, содержащей (в %)

и в культуральной жидкости Aspergillus ochraceus 1, выращиваемом на ферментационной среде с начальным рН 5,5, содержащей (в %): глюкозу - 3,5, крахмал - 1,0, соевую муку - 2,0, мясной экстракт - 0,5, пептон - 0,5, NaCl - 0,2, КН₂РO₄ - 0,05, MgSO₄-7H₂O - 0,05, показывает, что по предлагаемому способу получают более высокую активаторную к протеину С активность (на 12% и более) и за меньший период ферментации - на 2 сут, а не на 7 сут (табл.2).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить культуральную жидкость с более высокой активностью протеиназы - активатора протеина С и сократить время ферментации.

Литература

1. Коган А.Е., Струкова С.М. 1993. Протеин С: механизм активации и антикоагулянтного действия. Биохимия, 58, 6, 827-844.

2. Gempeler-Messina P.M., Volz К., Buhler В., Muller С.2001. Protein С activators from snake venoms and their diagnostic use. Haemostasis, 31, 266-272.

3. Martinoli J.L., Stoker K. 1986. Fast functional protein С assay using Protac^®, a novel protein С activator. Thromb. Res., 43, 253-256.

4. Stoker К., Fisher H., Meier J., Brogli M., Svedsen L., 1987. Characterization of the protein С activator Protac^® from the venom of southern copperhead (Agkistrodon contortrix) snake. Toxicon, 25, 3, 239-252.

5. Ландау Н.С., Кураков А.В., Гуликова О.М., Батомункуева Б.П., Струкова С.М., Егоров Н.С. 1998. Экстрацеллюлярные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулятными свойствами. Микробиология, 67, 2, 215-220.

6. Батомункуева Б.П., Егоров Н.С. 2001. Выделение, очистка и разделение комплексного препарата внеклеточных протеиназ Aspergillus ochraceus 513 с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами. Микробиология. 70, 5, 602-606.

7. Струкова С.М., Коган А.Е., Тара А.А., Аавиксаар А.А. 1989. Противотромботический эффект активатора протеина С из змеинового яда. Вопр. Мед. Химии. 35, 5, 115-119.

8. Билай В.И., Коваль Э.З. 1988. Аспергиллы. Определитель. Киев: Наукова Думка, 203 с.

9. Raper K.B., Fennell D.J. The genus Aspergillus. USA, Baltimore, Williams a. Wilkins Co., 1965.686р.

10. Kogan А.Е., Makarov A.N., Bobrushkin I.D., Strukova S.M. Comparative study of protein С activators from the Agkistrodon snake venoms. Trombosis research. 1991. V.62. P.775-780.

11. Sakata Т., Hatsuyama H., Kitamwa Т., Hekida K., Katayama J., Matsumata T. Study of chromogenic substrate on protein С activity assay - in patients treated with narfarin. Rinsho Byori. 1990. V.38, №8, P.937-941.

12. Dang Q.D., Cera E.D., 1997. Chromogenic Substrates selective for activated protein C. Blood, 89, 2220-2221.