Результат интеллектуальной деятельности: Средство для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов

Изобретение относится к биотехнологии, представляет собой применение штамма микофильного гриба Hypomyces odoratus ВКПМ F-242. по новому назначению.

Происхождение штамма: выделен в 1977 году путем моноспорового отбора из плодового тела Cystoderma amianthinum в Московской области и по совокупности морфологических и физиолого-биохимических свойств идентифицирован как Hypomyces rosellus. Штамм передан кафедрой микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова в коллекцию Центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика и депонирован под коллекционным номером F-242 в качестве продуцента протеазного комплекса и препарата антибактериального и фунгицидного спектра действия (SU 1135189 А1 30.08.1985). По результатам проведенного анализа нуклеотидной последовательности штамма ВКПМ F-242 с использованием полимеразной цепной реакции по видоспецифическому гену, кодирующего 18SpPHK, а также домена D1/D2 гена 28SpPHK Mychael A.Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky, Thomas J. White. PCR protocols. A guide to metods and applications. // Academic press, INC. 1990 г.) и метода сравнения нуклеотидных последовательностей кодирующих ген 5,8SpРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 (Е. De Clerck, T.Vanhoutte, T.Hebb, J. Geerinck, J. Devos and P. De Vos. Isolation and Environmental // Microbiology, 2004. - June. - p. 3664-3672) установлено, что исследуемый штамм наиболее близок к виду Hypomyces odoratus (Cladobotrium mycophilum). Депонирован под коллекционным номером ВКПМ F-242.

Известны штаммы микроскопических грибов - продуцентов комплекса карбогидраз для биодеградации целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов (RU 2057179 С1 14.09.1994, RU 2303057 С1 20.07.2007, RU 2287570 С2 10.10.2004). К недостаткам можно отнести отсутствие продуктивности в отношении хитиназы и β-1,3-глюконазы. Известны штаммы микроскопических грибов Trichoderma longibrachiatum TW-1 и TW-420, способные расти на среде хитином, пектином, ламинарином, лихенином (RU 2195490 С2 27.12.2002, RU 2303065 С1 20.07.2007). Недостатком является на фоне высокой активности целлюлолитических ферментов низкая продуктивность других карбогидраз.

Известны штаммы гриба Fusarium sambucinum, которые используются в качестве продуцентов простагландинов, убихинона Q10 (RU 1459244 А1 10.04.1995, RU 1446928 С 30.12.1994, RU 2064499 С1 20.07.2000). Однако вышеуказанные штаммы продуцируют соединения, ограниченные одним видом биологической активности. Известен штамм гриба Fusarium sambucinum ВКМ F-3051D как продуцент широкого спектра биологически активных веществ в культуральной жидкости (RU №2054484 C1 23.07.1992). Недостатком известного штамма является сложная технология их извлечения. Известен штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 ВКПМ F-867 как продуцент биологически активных веществ, обладающий способностью стимулировать рост и развитие растений (RU 2004105836 А 20.08.2004). К недостаткам относится отсутствие соединений с антибиотической активностью, что не позволяет использовать его для защиты растений. Известен штамм Hypomyces rosellus ВКПМ F-672 - продуцент липидов с одновременным присутствием органического пигмента. Недостатком штамма является отсутствие антибиотической активности и образования гидролитических ферментов (RU 2020155 С 30.09.1994).

Известен штамм микроскопического гриба Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 как продуцент протеолитических ферментов и антибиотически активного препарата с антибактериальным и фунгицидным спектром действия (SU 1135189 A1 30.08.1985). Недостатком штамма является ограниченный спектр фунгицидной и гидролазной активности культуральной жидкости для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов (прототип).

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в применении штамма Hypomyces odoratus ВКПМ F-242 для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов.

Указанный технический результат достигается тем, что культуральная жидкость гриба используется в предпосевной обработке семян. Подавление фитопатогенных микроорганизмов, которыми могут быть заражены семена, происходит благодаря тому, что культуральная жидкость гриба содержит такие продукты биосинитеза, как биологически активные соединения и миколитические ферменты -хитиназа и β - глюканаза.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Хитинолитическая и β-1,3-глюканазная активность

Выращивание гриба проводили в ферментерах мешалочного типа емкостью 10 л в течение 48-72 часов с подачей воздуха 0,2-0,4 л/л в минуту, при перемешивании 300 об/минуту и температуре 25-26°C на питательной среде с соевой мукой (Торопова Е.Г., Максимов В.Н., Береснева Г.Г., Егоров Н.С., Буракаева А.Д. Оптимизация состава среды для биосинтеза антибиотика, протеаз и пигментов микофильным грибом Hypomyces rosellus с помощью метода математического планирования эксперимента // Антибиотики и медицинская биотехнология.- 1986. - №6.- С. 408-411). В качестве индуктора синтеза миколитических ферментов вносили: крахмал картофельный (0,5%) или пшеничные отруби (0,5%) или коллоидный хитин (0,2-0,5%) или N-ацетил-D-глюкозамин (0,5%) или 0,5% мицелия фитопатогенного гриба Bipolaris sorokiniana (0,5%). Посевной материал выращивали на среде: сусло 4 по Баллингу, в колбах Эрленмейера на качалках (200-220 об/мин.) в течение 48 часов. Выход биомассы на третьи сутки роста составлял 2,2-2,4% от сухого веса мицелия.

В культуральной жидкости определяли хитинолитическую, β-1,3-глюканазную и протеолитическую активность (Decleire М., De Cat W., Tang V.H. Determination of endo- and exzochitinase activity of Serratia marcescens in relations to culture media composition and comparison of their antifungal properties. // Chitinenzimology, May 8-11, 1996, Senigallia (Ancona) Italy, V.2. - P. 165-169, 1996 г.;. Тиунова H.A., Кобзеева Н.Л. Ферментативное расщепление клеточных стенок дрожжей, находящихся в различных фазах роста. // Микробиология, 1976. - Т. 45. - №5. - С. 781-786; Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз // Прикл.биохим. и микробиол., 1971. - Т.7. - №2. - С. 225-228).

Исходя из данных, представленных в таблице 1, видно, что Hypomyces odoratus обладает более широким спектром активности ферментов.

Пример 2. Биологически активные соединения, обладающие антибиотической активностью.

Культивирование гриба проводили аналогично примеру 1.

Антибиотически активная культуральная жидкость штамма Hypomyces odoratus ВКПМ F-242 обладает более широким спектром действия в отношении фитопатогенных грибов и стрептомицетов (таблица 2). Экстракцию биологически активных соединений вели одновременно из фильтрата культуральной жидкости и разрушенных клеток мицелия органическими растворителями. Полученный препарат-сырец подвергали очистке и разделению методом препаративной тонкослойной и колоночной хроматографии. Хроматографическое поведение антибиотически активных соединений культуральной жидкости и мицелия гриба контролировали биоавтографическим проявлением. Идентификацию соединений проводили с использованием спектральных методов анализа. Обнаружено, что антибиотической активностью обладают алифатические терпены, производные диоксана и диоксалана и нафтахиноны.

Антибиотически активное соединение, идентифицированое как смесь близких по структуре и изомерных ациклических ненасыщенных оксикарбоновых кислот, обладает антибактериальным спектром действия в отношении грамположительных бактерий и имеет в УФ - спектре 2 максимума поглощения при 224 и 230 нм, которые характеризуют наличие в структуре сопряженных двойных связей типа - С=С-С=С-.

Протонам метиленовых групп соответствует мультиплет при 1,5 м.д. Сигнал при 2,08 м.д. отвечает метиленовым протонам, сопряженным с карбонильной группой. Широкие сигналы при 2,66 и 3, 76 м.д. соответствуют протонам эфирной и гидроксильной группировки. Характерным мультиплетным разрешением резонируют протоны при двойной связи в области 5,1 и 5,4 м.д. Широкие сигналы в области 7,3 м.д. принадлежат протонам карбоксильной функции. Анализ масс-спектров позволяет определить наличие трех компонентов в исследуемой смеси, а также величины молекулярных ионов, равные М+ 256, М+ 284, М+ 288.

Тритерпеновый углеводород сквален (С₃₀Н₅₀) был идентифицирован методом хромато-масс-спектроскопии в составе углеводородной фракции при содержании 61 и 25% во фракциях Rf=0,75 и Rf=0,9 соответственно.

Согласно данным хромато-масс-спектров антибиотически активных фракций (рис. 1) и ИК-спектров, обнаружены соединения, представляющие собой производные диоксана и диоксалана с брутто-формулами С₇Н₁₄О₇, C₁₃H₁₆O₄, С₁₈Н₂₄О₅, С₁₅Н₂₀О₄, C₁₅H₁₇O₂N₃Cl₂. ИК-спектр фракции показал частоты, лежащие в области 500 - 750 см^-1 которые соответствуют C-Cl связям, в области 1040-1200 см^-1 - соответствует простым эфирам, в области 1475-1525 см^-1 - соответствуют ароматическим соединениям, в области 1480-1660 см^-1 соответствуют C=N связям в цикле, в области 1730-1750 см^-1 соответствуют алифатическим эфирам, в области 2250 - 2700 см^-1 соответствуют , в области 2860-2885 см^-1 соответствуют СН₂ -связям, в области 2950-2975 см^-1 соответствуют СН₃ связям, частоты лежащие в области выше 3000 см^-1 соответствуют спиртам и фенолам.

Экстракт суммы липофильных веществ мицелия гриба разделяли методом колоночной хроматографии. Пробы, снятые с колонки, были проанализированы спектральными методами. Анализируя данные ИК-, УФ-спектроскопии, выяснили о наличии замещенных ароматических соединений (1100-1050 см^-1), алифатики (2940-2910 см^-1); кетонов (1710 см^-1). ЯМР ¹H-спектры для пробы 1 подтвердили присутствие метальной группы в фенольном радикале (2,2 м.д.), гидроксильньгх групп (3,5 м.д.).

Согласно данным спектральных анализов газожидкостной хроматографии (ГЖХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), УФ-, ИК-, ЯМР Н¹, ЯМР С¹³ и элементного анализа установлено, что фракция 1 состоит из 7 компонентов, фракция 2 - из 3-х и фракция 3 -из 8 компонентов и имеют следующие предполагаемые структуры нафтахиноновой природы.

Пример 3. Использование штамма микофильного гриба Hypomyces odoratus ВКПМ F-242 в защите растений от фитопатогенных микроорганизмов.

Культуральную жидкость исследуемого штамма, полученную по примеру 1, использовали для предпосевной обработки семян, предварительно зараженных фитопатогенными грибами, согласно известным методам (Методы экспериментальной микологии (справочник) / И.А. Дудка, С.П. Вассер, И.А. Эланская и др. [под ред. В.И. Билай.]. - Киев: Наукова думка, 1982. - 551 с.).

Для этого семена следующих культур: салат сорта Берлинский, горох сорта «Труженик», предварительно стерилизованные раствором формалина и отмытые от стерилента, раскладывали в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу. Семена в чашках обрабатывали по схеме: 1. Контроль (H₂O_дист); 2. Культуральная жидкость; 3. 10 мл суспензии спор Botrytis cinerea (для гороха) и Rhizoctonia solani (для салата), не менее 10 КОЕ/чашку; 4. 10 мл суспензии спор Botrytis cinerea (для гороха) и Rhizoctonia solani (для салата) не менее 10⁸ КОЕ/чашку + 1 мл культуральной жидкости, полученной по примеру 1. Чашки Петри закрывали и ставили в термостат при температуре 25°C на 24 часа. По истечении суток семена поливали дистиллированной водой и оставляли в растительной камере, создавая влажную атмосферу. Исследования проводились в четырехкратной повторности при средней выборке 100 семян.

Культуральная жидкость гриба Hypomyces odoratus ВКПМ F-242, полученная по примеру 1, оказывает стимулирующее и защитное воздействие на рост растений на фоне искусственно зараженных семян (таблица 3 и 4). Защитные свойства культуральной жидкости в отношении фитопатогенных грибов объясняются присутствием биологически активных веществ с антибактериальным и фунгицидным спектром действия, а также комплекса гидролитических ферментов - протеаз, хитиназ и β - глюканаз, направленных на гидролиз клеточных стенок фитопатогенных грибов.

Применение штамма Hypomyces odoratus ВКПМ F-242 для одновременного получения двух и более полезных продуктов и использования для защиты растений от фитопатогенных грибов позволяет повысить эффективность биотехнологического процесса за счет более рационального использования биосинтетических возможностей продуцента.