ТРАНСФОРМИРУЕМЫЙ БИОЧИП

Область изобретения

Изобретение относится к области изготовления биочипов, например ДНКовых или пептидных, которые могут быть использованы в качестве диагностических средств в области медицины, биотехнологии, защиты окружающей среды и пищевой промышленности и в криминалистике.

Уровень техники

Известно большое количество технических решений, касающихся разработки биочипов для диагностики, в которых в качестве зондов, размещенных на поверхности биочипа, используют нуклеиновые кислоты, белки, антитела, антигены, клетки и ткани.

Изготовление индивидуальных биочипов и проведение на их основе диагностики представляет собой многоступенчатый процесс. Процесс изготовления включает: предварительную обработку поверхности биочипа, нанесение на рабочую поверхность зондов, гибридизацию исследуемого образца с зондами и анализ полученных результатов.

Одним из ответственных этапов является этап гибридизации, от качества проведения которой зависит результат диагностики. В процессе гибридизации биочипы устанавливают в индивидуальные гибридизационные объемы [1] или проводят процесс гибридизации в раздельных гибридизационных объемах [2].

Известны технические решения, связанные с сокращением гибридизационного объема за счет применения биочипов сложной формы. С этой целью перед введением биочипа в реакционную ячейку с гибридизационным раствором сокращают его габариты [3], трансформируя планарную поверхность гибкого носителя биочипа в цилиндрическую форму. В другом варианте биочип формируют, используя твердый носитель, выполненный в форме параллелепипеда, усеченной призмы или сложенной в гармошку формы. Недостатком такого решения является необходимость применения большого объема реакционной смеси, в котором размещают рабочую и нерабочую поверхности биочипа, что приводит к повышению стоимости анализа и к невозможности одновременной гибридизации множества различных образцов.

Особое направление в решении задач гибридизации связано с повышением эффективности гибридизации за счет формирования одинаковых условий при гибридизации нескольких чипов. Известно изобретение [4], в котором минимизируется объем гибридизационной смеси в устройстве, которое содержит два индивидуальных чипа, выполненных на основе стандартных стеклянных слайдов, установленных рабочими поверхностями друг к другу. Боковые поверхности биочипов размещаются в пазах держателя, расстояние между которыми определяет величину гибридизационного объема. К недостатку конструкции можно отнести необходимость использования длинных игл, с помощью которых вводят и выводят гибридизационную смесь, а также необходимость разборки склеенной конструкции после гибридизации для сканирования результатов.

Известно изобретение [5], в котором первая часть биочипа расположена на отдельных пьедесталах, установленных на нижней основе, а вторая часть биочипа размещена на крышке гибридизационной камеры, к которой приклеены аналогичные пьедесталы. При сборке камеры рабочие поверхности биочипа устанавливаются друг над другом на контролируемом расстоянии. Недостатком такого решения является сложность конструкции, в которой необходимо приклеивать пластины для формирования пьедесталов, и сложность нанесения зондов на отдельные не связанные друг с другом части биочипа.

Одна из технических задач, на решение которой направлено заявляемое изобретение, состоит в упрощении работы с биочипом с малым объемом анализируемого вещества, используемого при гибридизации.

Другая задача изобретения состоит в увеличении воспроизводимости результатов диагностики за счет эффективной гибридизации при минимальном объеме гибридизационной смеси и в создании одинаковых условий для гибридизации множества кластеров, размещенных на биочипе.

Поставленные задачи решаются с помощью трансформируемой конструкции биочипа, которая занимает планарное положение двух частей биочипа на этапе нанесения зондов и на этапе диагностики и сканирования и совмещенное положение двух частей биочипа для создания общего объема в период гибридизации.

Одним из объектов настоящего изобретения является биочип для диагностики в области медицины, биотехнологии, защиты окружающей среды, пищевой промышленности и в криминалистике, содержащий твердый носитель, рабочие зоны, кластеры с зондами, идентификатор, в котором твердый носитель выполнен из двух частей, которые взаимосвязаны друг с другом через гибкую перемычку, с возможностью сгиба перемычки и совмещения вдоль поперечной или продольной оси биочипа, по меньшей мере, одной рабочей зоны с кластерами первой группы и размещенной на одной части биочипа, с рабочей зоной, содержащей кластеры второй группы и размещенной на другой части биочипа для формирования, по меньшей мере, одного общего реакционного объема, содержащего кластеры первой и второй группы. Для формирования общего реакционного объема первая часть носителя содержит выемки квадратной, прямоугольной или круглой формы, в которых размещены рабочие зоны с кластерами первой группы. Кластеры второй группы размещены на лицевой поверхности второй части носителя. В другом варианте общий реакционный объем, в который входят кластеры первой и второй групп, сформирован с помощью, по меньшей мере, одной гибкой прокладки, закрепленной к лицевым поверхностям первой и/или второй части твердого носителя. Причем гибкая перемычка выполнена из материала твердого носителя биочипа, а соотношение между толщиной (Н) и шириной (L) гибкой связи лежит в пределах от 1:1 до 1: 500.

Дополнительно биочип содержит крышку, внутренние боковые поверхности которой прилегают к боковым задним поверхностям первой и второй частей твердого носителя, а верхняя внутренняя часть крышки прилегает к боковым или торцевым частям биочипа, закрывая общий объем, сформированный между первой и второй частями твердого носителя. Биочип содержит идентификатор, который размещен на лицевой поверхности первой и/или второй части твердого носителя и выполнен в виде этикетки с клеящим слоем или магнитной ленты. Индентификатор может содержать штрих-код.

В другом варианте изобретения биочип для диагностики в области медицины, биотехнологии, защиты окружающей среды, пищевой промышленности и в криминалистике состоит из двух твердых носителей, которые взаимосвязаны друг с другом через гибкий многослойный лист, который обеспечивает возможность сгиба гибкого листа и совмещения вдоль поперечной или продольной оси биочипа, по меньшей мере, одной рабочей зоны с кластерами первой группы, размещенной на одной части биочипа, с рабочей зоной, содержащей кластеры второй группы, размещенной на другой части биочипа для формирования, по меньшей мере, одного общего реакционного объема, содержащего кластеры первой и второй групп.

Многослойный лист закреплен на поверхности первой и второй частей твердого носителя. Для формирования общего объема многослойный лист дополнительно содержит сквозные отверстия квадратной, прямоугольной или круглой формы, положение которых совпадает с положением кластеров первой группы, размещенных на лицевой поверхности первой части твердого носителя, при этом кластеры второй группы размещены на лицевой поверхности многослойного листа. В другом варианте общий реакционный объем, в который входят кластеры первой и второй групп, размещенные на поверхности многослойного листа, сформирован с помощью, по меньшей мере, одной гибкой прокладки, закрепленной на лицевой поверхности многослойного покрытия.

Гибкое соединение, обеспечивающее возможность сгиба, выполнено из материала гибкого многослойного листа, а соотношение между толщиной (Н) и шириной (L) гибкого соединения лежит в пределах от 1:1 до 1: 500.

В другом варианте для создания общего реакционного объема биочип дополнительно содержит, по меньшей мере, одну прокладку, закрепленную на внешней поверхности многослойного листа или поверхности твердого носителя для формирования общего объема, причем прокладка размещена на первой и/или второй части твердого носителя.

Дополнительно биочип содержит крышку, внутренние боковые поверхности которой прилегают к боковым задним поверхностям первой и второй частей твердого носителя, а верхняя внутренняя часть крышки прилегает к боковым или торцевым частям биочипа, закрывая общий объем, сформированный между первой и второй частями твердого носителя.

Идентификатор биочипа выполнен либо в виде графического изображения на поверхности многослойного листа, или в виде этикетки с клеящим слоем, или магнитной ленты и их комбинации. Графический идентификатор может быть выполнен в виде штрих-кода. На лицевой поверхности многослойного листа размещен, по меньшей мере, один идентификатор.

Перечень фигур

На фиг.1 представлены: а) схема фронтального вида и б) вида сбоку биочипа, в котором первая и вторая рабочие части биочипа расположены симметрично относительно поперечной оси и соединены друг с другом с помощью гибкого многослойного листа.

На фиг.2 представлен фрагмент вида сбоку биочипа, представленного на фиг.1 в сложенном состоянии.

На фиг.3 представлена изометрическая проекция биочипа, схема которого представлена на фиг.1.

На фиг.4 представлены варианты крепления прокладок с клеящим слоем.

На фиг.5 представлен вариант формирования общего объема, где а) изометрический вид биочипа в планарном состоянии, б) фрагмент проекции биочипа в сложенном состоянии, в) представлен вариант крепления защитного листа, г) вид биочипа в сложенном состоянии с верхней крышкой.

На фиг.6 представлена изометрическая проекция биочипа, в котором первая и вторая рабочие части биочипа расположены симметрично относительно продольной оси биочипа.

На фиг.7 представлены: а) схема фронтального вида и б) вида сбоку биочипа, в котором сформированы первая, вторая и третья рабочие части биочипа, которые размещены относительно двух гибких соединений.

На фиг.8,а-8,в приведены варианты сечений фрагментов первой и второй частей биочипа для разных вариантов формирования гибких соединений.

Описание терминов

Под термином «твердый носитель» подразумевается твердый планарный элемент преимущественно прямоугольной формы, который выполнен в виде слайдов. В качестве материалов, из которых изготовлены твердые носители, могут быть использованы полимеры, стекло, металл, слюда, керамика или их комбинации.

На выбор материала слайда влияют физико-механические свойства слайдов:

термопластичность, возможность штамповки и формирования в расплавленном состоянии, возможность выдерживать температурные циклы при проведении гибридизации, стойкость к химическим реагентам, входящим в состав гибридизационной смеси и растворов для промывок. Термопластичные пластмассы обеспечивают возможность штамповки и формирования выбранной формы слайда из расплава полимера. Полимеры выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил и др. Используя термопластичные свойства полимеров, на поверхности слайда, могут быть сформированы выемки, выступы, барьеры, канавки.

В рамках данного изобретения под термином «слайд» понимают твердый плоский элемент, выполненный из твердого носителя, на поверхности которого в процессе изготовления биочипа формируют кластеры с зондами, характеризующими индивидуальный биочип. Как конструктивный элемент биочипа, слайд выполняет две функции. В соответствии с основной функцией слайд является носителем зондов, которые иммобилизуют на поверхность слайда или многослойного листа

в границах рабочей зоны. Второй функцией, которую слайды выполняют в качестве конструктивного элемента биочипа, является функция крепления многослойного листа

на поверхности слайда для создания общих объемов. В этом случае слайд выполняет вспомогательную функцию твердого носителя для гибкой пленки.

В зависимости от требований диагностики размеры слайдов, на которых размещают зонды, могут быть меньше или больше стандартных стеклянных слайдов, размер которых составляет 25 мм × 75 мм. Более предпочтительно использовать не только стандартные размеры индивидуальных чипов, но и другие размеры. Например, для сокращения расходов на подготовку индивидуальных биочипов, возможно использовать чипы, габариты которых составляют значение 12,5 мм × 75 мм, либо мини-чипы размером 25 мм × 37,5 м, либо 12,5 мм × 37,5 мм, либо другие размеры слайдов от 4 мм × 4 мм до 120 мм × 120 мм.

Под термином «многослойный лист» подразумевается конструкция для формирования биочипа, которая содержит, по меньшей мере, два гибких слоя с разными физико-химическими свойствами. Многослойный лист может содержать композицию, по меньшей мере, из двух слоев, входящих в группу состоящую из: i) гибкого слоя, ii) клеящего слоя, iii) отражающего слоя, iv) светопроницаемого слоя, v) непрозрачного слоя, vi) поглощающего слоя, viii) гибкого слоя с нанесенным графическим изображением, предназначенного для идентификации параметров биочипа, выбираемого из группы штрих-кодов, цифровой или буквенной информации или их комбинации. Гибкие слои, входящие в состав многослойного листа, могут быть размещены над всей поверхностью биочипа или могут быть размещены на отдельных участках, например на вспомогательной зоне биочипов.

Под термином «гибкий слой» в рамках данного изобретения подразумевается полимерный слой, который преимущественно используется для формирования слоев, в которых формируют сквозные отверстия для создания общих объемов.

Гибкий слой дополнительно выполняет несущую функцию и может иметь толщину более чем 0, 05 мм, или более 0,1 мм, 0,3 мм, 1,0 мм или 5 мм и менее чем 10 мм. Клеящие слои имеют толщину более чем 0,01 мм. Отражающий слой имеет толщину более чем 0, 01 мм. Светопроницаемый слой имеет толщину более чем 0,01 мм. Непрозрачный слой имеет толщину более чем 0,01 мм. Поглощающий слой имеет толщину более чем 0,01 мм.

Модифицирующий и/или поглощающий слои наносятся на активные поверхности биочипов в процессе из изготовления.

Для анализа белков, антител, ферментов, в качестве материала слоя, на котором будет проводиться иммобилизация зондов, могут быть выбраны такие полимерные материалы, как нейлон, целлюлоза, PVDF и др.

В состав многослойного листа могут входить: а) гибкие слои, снабженные одним клеящим слоем, б) гибкие слои, снабженные двумя клеящими слоями, нанесенными на верхнюю и нижнюю поверхности гибкого слоя, в) гибкие слои, не снабженные клеящим слоем, г) комбинации слоев, входящих в пункты а), б), в). Гибкие слои многослойного листа размещены друг над другом и соединены таким образом, что одна из поверхностей верхнего или нижнего многослойного листа содержит самоклеящий слой, который приклеивают к поверхности слайдов под действием давления. Адгезивный или клеевой слой должен создавать прочную связь между поверхностью слайдов, поверхностью несущего элемента и многослойным листом.

Эта связь должна быть стабильной и не должна нарушаться при изменении температуры внешней окружающей среды в диапазоне от -20 до 60°С. Адгезионный слой должен сохранять свои клеящие параметры в условиях действия растворов, используемых для промывок поверхности слайдов или при формировании модифицирующего слоя на поверхности слайдов или растворов, участвующих в формировании раствора для гибридизации.

В процессе изучения свойств полимерных материалов, с нанесенным на их поверхность клеящим слоем, в условиях изменяющейся температуры в диапазоне от -10°С до 60°С, а также в буферах для гибридизации и в растворах для модификации поверхности полимеров, было обнаружено, что гибкие полимерные материалы, с нанесенными на них клеящими слоями, выполненные в виде самоклеящихся пленок, позволяют создать множество вариантов недорогих биочипов.

Известны решения, в соответствии с которыми гибридизационный объем создается за счет наклеивания на поверхность биочипа одного или нескольких слоев гибкой основы, на которую нанесен клеящий слой [6-8].

Известны технические решения, в которых самоклеящиеся пленки применяют для выполнения лишь одной функции при изготовлении биочипов. К таким функциям, например, относится: формирование гибридизационных объемов, при котором в гибкой основе формируют отверстия, определяющие форму и габариты гибридизационной зоны [6-8], закрепление на поверхности гибкого основания твердых слайдов с модифицированной поверхностью [9], крепление на поверхности твердого субстрата твердых слайдов [10], а также приклеивание на твердую поверхность слайдов гибких полимерных пленок для формирования активной поверхности [11].

Предлагаемое техническое решение устанавливает иной подход в конструировании биочипов. В данном изобретении для повышения эффективности и удешевления производства биочипов материалы гибких слоев, входящих в состав многослойного листа, выбирают такими, чтобы они могли выполнять одновременно, по крайней мере, три функции.

Первая, конструкционная функция, связана с поддержкой и креплением частей биочипа относительно друг друга на всех этапах производства биочипа, начиная от этапа обработки поверхности слайдов до этапа диагностики.

Второй функцией, которую может выполнять материал гибких слоев, входящих в многослойный лист, является создание разделенных друг от друга реакционных зон на поверхности биочипа. Перегородки между зонами формируют, выполняя сквозные отверстия в материале гибкого листа.

Третья функция гибких слоев определяется выбором материала гибкого слоя и его физико-химическими свойствами поверхности. К таким свойствам относятся: а) обеспечение возможности иммобилизации зондов на модифицированной или немодифицированной поверхности гибкого слоя, б) возможность формирования отражающей поверхности для более эффективного измерения сигналов, в) возможность выбора гибкого слоя с поверхностью, которая осуществляет тушение флуоресценции.

К четвертой функции гибкого слоя, размещенного на внешней поверхности многослойного листа, можно отнести формирование на его поверхности графического изображения штрих-кода или иной графической цифровой или буквенной информации, идентифицирующей кластеры, расположенные на отдельных чипах.

В качестве дополнительной информативной функции биочипа возможно использовать цвет верхнего или нижнего гибкого слоя как индивидуальных слайдов, так и биочипа, входящего в группу биочипов, составляющих мультичип. Это позволяет привязать цвет биочипов к той диагностической функции, которую они выполняют.

Комплексное применение гибкой основы позволяет получить синергический эффект при создании биочипов, который не был получен ранее, поскольку в известных технических решениях использовалось не более двух функций гибкого слоя.

Под термином «биочип» подразумевается устройство, выполненное на основе слайда, которое содержит, по меньшей мере, одну рабочую зону, содержащую активную поверхность и вспомогательную зону. На поверхности рабочей зоны формируют кластеры с зондами. В границах вспомогательной зоны размещают идентификаторы, характеризующие параметры индивидуального биочипа, выполненные в виде отдельных многопараметрических идентификаторов и/или кодовых, цифровых или буквенных идентификаторов.

Один из аспектов изобретения включает выбор материала, из которого выполняют биочип. Одним из основных параметров материала биочипа являются его оптические свойства, которые связаны со способом регистрации данных диагностики.

Взаимодействие между исследуемым образцом и зондом детектируется с помощью метки. В рамках данного изобретения могут быть использованы любые метки, выбранные из группы, состоящей из флуоресцентных, колориметрических, ферментных, радиоактивных меток, а также меток, связанных с резонансным переносом энергии (FRET, BRET), меток, излучающих сигнал люминесценции (хемилюминесцентные или биолюминесцентные метки).

Наибольшее распространение получили биочипы с иммобилизованными олигонуклеотидами и белками. В зависимости от выбранного типа метки, которая иммобилизуется с исследуемым фрагментом ДНК или антитела, используют каталитические, лигандные, флуоресцентные или радиоактивные метки. В качестве каталитических меток используют гемин, цианкобаламин или флавин. В качестве лигандных меток используют биотин, диоксигенин или динитробензол. В качестве флуоресцентных меток используют Су3, Су5, Су7, FAM, TAMRA, R6G, R110, ROX или JOE. Приведенные перечни меток включают, но не ограничивают других вариантов меток, которые можно использовать для детектирования сигнала.

Разные типы меток регистрируют разными физическими методами. Наиболее широко распространены измерение пропускания [12] или измерение отраженных или флуоресцентных сигналов. Исходя из выбранного типа метки и способа регистрации, материал, из которого изготавливают слайд, может представлять собой однородный твердый материал, например стекло, слюду, полимер, металл, керамику. При изготовлении слайдов из полимеров они могут быть прозрачными, матовыми, белыми, черными или цветными.

Для измерения пропускания материал слайда должен обладать величиной пропускания света не менее 80-90%. При измерении отраженного колориметрического сигнала требования к материалу слайда связаны с качеством формирования белой отражающей поверхности. При измерении сигналов флуоресценции необходима минимальная собственная флуоресценция материала слайда. В зависимости от способа регистрации флюоресценции материал может быть прозрачным и выполненным из стекла или прозрачного пластика, например полиметилметакрилата, или выполнен в виде непрозрачного материала, например черного цвета, обладающего минимальной отражающей способностью, выполненного, например, из поливинилхлорида.

Под термином «зонд» подразумевается одна из двух связываемых молекул, которые взаимодействуют друг с другом посредством специфичного ковалентного взаимодействия. Молекула зонда иммобилизована на рабочей поверхности биочипа, а качество связывания определяется выбором структуры зонда. В состав группы типичных пар молекул, которые используют при изготовлении белковых и ДНК-чипов, могут входить олигонуклеотиды, ДНК, белки, антигены, антитела, ферменты. Анализируемое вещество включает один или несколько типов молекул, которые необходимо диагностировать.

Под термином «кластер» подразумевается часть активной рабочей поверхности биочипа, на которой иммобилизованы зонды одного типа. На рабочей поверхности биочипов со средним уровнем плотности размещают до 100 кластеров, в которых размещают от 2 до 10 000 зондов. Рабочие зоны, в которых размещают кластеры, могут иметь форму прямоугольника, квадрата, круга, эллипса, многоугольника, треугольника или представлять собой линейную структуру, выраженную линейной последовательностью точек. Кластеры могут наноситься на модифицированную поверхность слайдов [12] или закрепляться на немодифицированной поверхности [13].

Описание

В процессе разработки биочипов с малым реакционным объемом на основе многослойного листа, закрепленного на поверхности биочипа, было обнаружено новое техническое решение, состоящее в том, что гибкий многослойный лист, который используют для формирования реакционных объемов на поверхности индивидуальных биочипов, позволяет изменять (трансформировать) положение одной части биочипа по отношению к другой части за счет своих гибких свойств.

Например, биочип может быть выполнен из первой и второй частей, которые на этапах подготовки поверхности биочипов к нанесению зондов и в процессе печати зондов расположены планарно относительно друг друга, а во время проведения реакции, например, гибридизации могут складываться друг с другом вдоль поперечной или продольной осей биочипа, а на этапах промывки и сушки и этапе сканирования данных диагностики могут снова раскладываться и формировать планарную поверхность.

В процессе гибридизации планарную форму биочипа трансформируют в сложенную структуру, при этом первую часть биочипа располагают над второй частью биочипа и рабочие поверхности с нанесенными зондами соприкасаются с общим объемом реакционной смеси, что позволяет формировать минимальный и постоянный объем реакционной смеси и создать одинаковые оптимальные условия для гибридизации.

На фиг.1,а представлена схема фронтального вида одного из вариантов биочипа. В данном варианте биочип выполнен из первой (192) и второй (193) части, выполненных, преимущественно, в виде планарной твердой основы прямоугольной формы и гибкого многослойного листа (231). Возможны несколько вариантов крепления первой части биочипа по отношению ко второй части биочипа. Первый вариант крепления частей биочипа, представленный на фиг.1,б и фиг.2 (где представлен боковой вид биочипа (218) в сложенном состоянии), основан на использовании гибкого многослойного листа (231), который выполнен из гибкого слоя (229) и клеящего слоя (232). Согласно изобретению, биочип (218) имеет ось симметрии (222), расположенную между первой (223) и второй (224) рабочими зонами биочипа, в направлении, перпендикулярном продольной оси (221) биочипа (218). В первой (223) и второй (224) рабочих зонах сформированы участки (225, 226) для размещения кластеров (3). Положение каждого участка с кластерами (3) по координатам ХУ в первой рабочей зоне (223) симметрично относительно поперечной оси (222) положению каждого кластера во второй рабочей зоне (224) биочипа (218).

К лицевым поверхностям первой (234а) и второй (234б) частей биочипа (см. фиг.2) закреплен с помощью клеевого слоя (232), по меньшей мере, один слой (229) гибкого многослойного листа (231). В варианте, приведенном на фиг.1 и фиг.2, для формирования общего реакционного объема многослойный лист (231) содержит в первой части (192) биочипа сквозные отверстия (243), положение которых в ХУ координатах в сложенном состоянии совпадает с положением (242) участков кластеров (226) на второй части (193) биочипа.

Многослойный лист (231) за счет гибких свойств формирует гибкую связь (180) между первой (192) и второй (193) частями биочипа и позволяет трансформировать планарное положение первой части (192) относительно второй части (193) биочипа. При этом рабочая поверхность первой части(234а) помещается над рабочей поверхностью второй части (234б) биочипа, как это показано на фиг.2. В процессе трансформирования зеркально совмещаются зоны, размещенные на первой и второй поверхностях биочипа для формирования, по меньшей мере, одного общего реакционного объема (233) между участками (225) и (226) с размещенными кластерами. Для обеспечения гибкой связи между первой и второй половинами биочипа в зависимости от толщины H1 многослойного листа (231) выбирают расстояние L1 между первой и второй частями биочипа.

На фиг.3 представлена изометрическая проекция биочипа (218) в складываемом положении с нанесенным реакционным объемом (265) на один участок с кластерами. Для удобства разборки сложенной конструкции на вспомогательной зоне первой и/или второй части чипа формируют участки (266), в которых отсутствует многослойная структура (231) или выполнена выемка в теле твердой основы биочипа и в создавшееся пространство можно ввести устройства, позволяющие механически отделить первую часть (192) биочипа от второй части (193). Для удобства крепления первой части (192) биочипа относительно второй части (193) во вспомогательной зоне дополнительно с размещением штрих-кода (16) могут быть укреплены прокладки (251), содержащие двухсторонний клеящий слой с разной степенью адгезии к поверхности. Клеевой слой, наклеиваемый на первую (192) или вторую (193) поверхность биочипа, должен иметь более высокую степень адгезии к поверхности, чем клеевой слой, размещенный на внешней стороне прокладки (251). При совмещении первой и второй частей биочипа образуется разъемное клеевое соединение между двумя прокладками (251).

Для проведения последующего этапа сканирования биочипа клеевое соединение разъединяют и возвращают биочип в исходное положение, в котором первая и вторая части биочипа занимают планарное горизонтальное положение относительно друг друга и устанавливают биочип (218) в держатель для сканирования данных.

На фиг.4,а-е представлены дополнительные варианты крепления прокладок для биочипов, которые содержат первую и вторую части основы биочипа, к лицевым поверхностям которых прикреплен гибкий многослойный лист (231), а на его лицевую поверхность установлена, по меньшей мере, одна прокладка. Прокладка (251) снабжена первым клеящим слоем (252) и вторым клеящим слоем (253), к которому на этапе хранения и транспортировки прикреплена защитная полоса (254) или защитный лист (255), как это представлено на фиг.5,б,в. Фрагменты клеевых соединений между поверхностью первой (192) и второй (193) частей биочипа, клеящих слоев (252) и (253) подробно раскрыты на фиг.5а-5в. При совмещении первой части биочипа с его второй частью за счет гибкого соединения, образованного свойствами гибкого многослойного листа (231) и гибкой прокладки (251), образуется общий реакционный объем (256) между лицевыми поверхностями первой (192) части и второй (193) части биочипа (218). В зависимости от геометрических размеров первой и второй частей биочипа и в зависимости от требований к устройствам выбирают тип формы прокладок (251) для создания общих реакционных объемов между первой и второй частями биочипа, варианты которых представлены на фиг.4,а-е.

На фиг.5,а-г представлен другой вариант биочипа (218), который содержит первую (192) и вторую части (193) основы биочипа, на лицевой поверхности которой прикреплен многослойный лист (231) и на лицевой поверхности которого установлены первая (251а) и вторая (251б) прокладки, которые расположены вдоль боковых границ биочипа и снабжены первым клеящим слоем (252) и вторым клеящим слоем (253). Клеящие поверхности прокладок (251а) и (251б) в процессе хранения и транспортировки защищают защитные полосы 254. В более предпочтительном варианте, представленном на фиг.6,в, к клеящим поверхностям (253) прокладок (251а) и (251б) на этапе хранения и транспортировки прикреплен защитный лист (255), который выполняет функцию защиты нанесенных на первую и вторую поверхности биочипа зондов от влияния внешних условий и защиты второго клеящего слоя (253) от высыхания. Перед нанесением, например, гибридизационной смеси на рабочие зоны биочипа защитный лист (255) снимают, освобождая второй клеящий слой (253) прокладок, и накладывают лицевую поверхность первой части биочипа на лицевую поверхность второй части биочипа. При этом за счет перегиба клеящих прокладок (251 а, б) их часть, которая находится на первой части биочипа, приходит в контакт со второй частью прокладок, расположенных на второй части биочипа.

После механического сдавливания первые и вторые части прокладок (251а, б) склеиваются и образуют совместно с лицевой поверхностью гибкого многослойного листа (231) общий реакционный объем (256), представленный на фиг.5,б,г. В данном объеме кластеры (257), размещенные на первой части биочипа, расположены напротив кластеров (258), размещенных на второй части биочипа. Регулируя толщину прокладок (251), можно изменять величину объема (256) реакционной смеси. Ввод реакционной смеси осуществляется в пространство между боковыми поверхностями первой и второй частей биочипа. Данная конструкция позволяет закрепить на боковых поверхностях первой (259) и второй (260) частей биочипа дополнительную гибкую крышку (261), представленную на фиг.5,г, в которой устанавливают первый (262) и второй (263) жидкостные входы для ввода и вывода реакционной смеси, а также для промывок внутренней поверхности реакционного объема (256). После проведения реакции, например, гибридизации снимают крышку (261) с боковых поверхностей биочипа (259, 260) и разделяют клеящие слои (253) прокладок относительно друг друга, используя свободное пространство (264) между первой и второй частями биочипа в месте расположения штрих-кода (16), и устанавливают биочип в держатель сканера для последующего сканирования результатов диагностики.

Другой вариант крепления первой и второй части биочипа приведен на фиг.6,а-6,б. В данном варианте первая и вторая части биочипа расположены симметрично продольной оси (221). Так же как и в варианте, представленном на фиг.6,а, крепление первой (197) и второй (198) частей биочипа может быть основано на технических решениях, приведенных на фиг.5,а-5,г. Для формирования реакционных зон можно использовать двухсторонние клеящие прокладки (251), аналогично тому, как это представлено на фиг.4 и фиг.5.

Выбор поперечного или продольного расположения первой и второй частей биочипа осуществляют в зависимости от удобства ввода реакционной смеси в сформированный объем и в зависимости от конструкции термостатирующих устройств, которые используют для проведения, например, гибридизации. Приведенное в данном изобретении техническое решение по созданию общих реакционных объемов позволяет дополнительно разбивать общий реакционный объем на две части. На фиг.7,а представлена схема фронтального вида биочипа (219), который содержит три отдельные твердые основы (194, 195, 196), каждая из которых выполнена преимущественно в виде прямоугольной формы. К центральной части (195) симметрично прилегают левая (194) и правая (196) части. Многослойный лист (231) закреплен на лицевых поверхностях отдельных частей (194-196), объединяет эти части в единую конструкцию и формирует два гибких соединения (181 и 182). На поверхности центральной части (195) биочипа размещены участки для размещения кластеров (225). Участки для размещения кластеров (226) расположены на левой (194), а участки (227) с кластерами расположены на правой (196) части биочипа и размещены на внешней поверхности многослойного листа (231).

В данном варианте конструкции в многослойном листе предусмотрены отверстия (243), положение которых по ХУ координатам совпадает с положением кластеров (225), размещенных на поверхности центральной части (195) биочипа. Данная конфигурация позволяет разнести две группы кластеров (226,225) и (227, 225) на рабочей поверхности биочипа и снизить возможность контаминации исследуемых образцов. В других вариантах отверстия (243) могут быть сформированы на всей площади многослойного листа (231), или на правой, или левой частях биочипа. В случае применения прокладок (251), например, аналогичных фиг.4, возможно не формировать отверстия (243) в многослойном листе (231).

На фиг.8,а-8,в представлены другие варианты формирования гибких соединений согласно данному изобретению. Данные варианты крепления частей биочипа друг с другом включают, но не ограничивают других вариантов, которые могут быть сформулированы на основе данного изобретения.

В общем случае варианты создания гибких соединений между первой и второй частями биочипа выбирают из группы, состоящей из: i) крепления раздельных частей биочипа за счет гибкого многослойного листа (представлен на фиг.1 - фиг.7), ii) крепления первой и второй частей биочипа с помощью гибкого многослойного листа и твердой перемычки между первой и второй частями биочипа с возможностью разделения твердой перемычки между частями биочипа (представлен на фиг.8,а), iii) крепления двух частей биочипа с использованием гибких свойств материала основы биочипа и гибких свойств материала многослойного листа, закрепленного на поверхности биочипа (представлен на фиг.8,б), iv) крепления двух частей биочипа за счет гибких свойств основы биочипа (представлен на фиг.8,в).

Вариант гибкого соединения (183) между первой и второй частями биочипа с помощью гибкого многослойного листа и твердой перемычки между первой и второй частями биочипа с возможностью разделения твердой перемычки между частями биочипа представлен на фиг.8,а. Первая (192) и вторая (193) части биочипа выполнены из единой твердой основы, на лицевую поверхность которой закреплен многослойный лист (231). На задней стороне биочипа выполнено углубление (228), боковые стороны которого формируют торцевые поверхности первой (192) и второй (193) частей биочипа. Форма углубления может быть выбрана из группы, состоящей из: прямоугольной, треугольной, трапецеидальной, цилиндрической, многоугольной. Толщину перемычки Н 2б и ширину расстояния L 2 между частями биочипа выбирают в зависимости от параметров хрупкости твердой основы биочипа. При выборе параметров гибкого соединения (183) биочипа учитывают толщину многослойного листа Н2а. При совмещении двух частей биочипа твердая перемычка разламывается. Вариант крепления двух частей биочипа для формирования гибкого соединения (184) с использованием гибких свойств материала основы биочипа и гибких свойств материала многослойного листа, закрепленного на поверхности биочипа, представлен на фиг.8,б.

Другой вариант формирования крепления двух частей биочипа за счет гибких свойств основы, из которой выполняют биочип для обеспечения возможности гибкого соединения (185), представлен на фиг.8,в.

Известно, что многие полимерные материалы обладают достаточной жесткостью и сохраненяют форму при нагреве до 60°С при толщине более 1 мм. Если в таком полимере сформировать углубление (228), например, трапецеидальной формы, как это представлено на фиг.8,б и 8,в, то за счет снижения толщины слоя Н3б, Н4 твердая основа биочипа приобретает гибкие свойства, что позволяет осуществить формирование гибкой перемычки с обеспечением возможности перегиба перемычки и поворота первой части (192) биочипа относительно второй (193) части биочипа.

Для более эффективного гибкого соединения двух половин биочипа выбирают оптимальное соотношение между значением толщины гибкой перемычки Н и расстоянием L между частями биочипа. Значение соотношения H/L лежит в пределах от 1:1 до 1:100. Толщина Н может лежать в пределах от 0,05 до 1 мм, расстояние L в пределах от 0,5 до 5 мм и определяется, в том числе, размерами биочипа и его толщиной.

На фиг.8,а-8,б приведены фрагменты сечений второй (193) части биочипа (218) для варианта, в котором для формирования общего реакционного объема многослойный лист (231) содержит сквозные отверстия (243), положение которых в ХУ координатах совпадает с положением кластеров(242) на второй части (193) биочипа.

Другой вариант формирования гибридизационного объема приведен на фиг.8,в. В данном варианте вторая часть биочипа содержит углубления (244), в которых размещают кластеры второй группы (242), кластеры первой группы (241) размещают на поверхности первой части (192) биочипа. При использовании прокладок (251), закрепленных непосредственно на поверхности основы биочипа в соответствии с аналогичными вариантами, приведенными на фиг.4 - фиг.6, возможно формировать общие реакционные объемы без формирования углублений (244).

На фиг.1,а и фиг.7,а приведены примеры размещения кластеров в рабочих зонах (225, 226), которые имеют квадратную форму, что включает, но не ограничивает вариантов размещения зон и вариантов форм размещения кластеров. Варианты форм рабочих зон могут дополнительно включать прямоугольную, круглую и линейную формы с разными геометрическими размерами и разным количеством размещенных рабочих зон на поверхности биочипа.

В границах вспомогательной зоны биочипа размещают идентификаторы, характеризующие параметры индивидуального биочипа. Идентификаторы выполняют в виде отдельных многопараметрических идентификаторов, например штрих-кодов или магнитных лент, и/или дополнительно включают размещение кодовых, цифровых или буквенных идентификаторов, расположенных рядом с кластерами.

На фиг.1,а приведен пример размещения идентификаторов, размещенных рядом с торцевыми границами первой (192) и второй (193) частей биочипа. Вариант центрального размещения идентификатора (16) и размещение буквенных (249) и цифровых (250) идентификаторов для идентификации соответствующих строк и столбцов, в которых размещены рабочие зоны с кластерами (225, 226), а также введение меток (267), которые можно использовать для привязки изображения кластеров при обработке данных диагностики, приведено на фиг.7,а. Идентификаторы могут быть установлены на поверхность биочипа в виде этикетки с клеящим слоем. Более предпочтительно предварительно нанести графическое изображение идентификатора на поверхности гибкого многослойного листа перед использованием в конструкции биочипа, например, с помощью автоматических графических принтеров.

Изложенные технические решения позволяют использовать их для формирования устройств, содержащих, по меньшей мере, два индивидуальных биочипа. С этой целью вместо первой и второй частей биочипа используют первый и второй биочипы, располагая их рядом вдоль боковых или торцевых поверхностей и закрепляя относительно друг друга с помощью многослойного листа 231. Возможны другие варианты, например, с использованием четырех биочипов. В данном варианте, используя гибкий многослойный лист, рабочую поверхность первого чипа накладывают на поверхность второго, а поверхность четвертого биочипа накладывают на поверхность третьего биочипа.

При отработке структуры биочипов, в состав конструкции которых входят самоклеящие пленки, было найдено новое и неочевидное решение по отношению к известным вариантам формирования гибридизационных объемов [6, 8]. В известных изобретениях зонды иммобилизуют на поверхности биочипа, выполненного из материала одного типа. В рамках данного изобретения зонды в кластерах первой (241) и в кластерах второй (242) групп (см фиг.1 - фиг.8) могут быть иммобилизованы в рамках рабочих зон первой и второй частей биочипа на поверхности гибкого слоя и/или на поверхности твердой основы. Материал гибкого многослойного листа может отличаться от материала твердой основы биочипа.

С этой целью выбор материала твердой основы и материала многослойного листа осуществляют с учетом возможности модификации одним типом реагента. В процессе исследования свойств материалов было обнаружено, что достаточно широкий перечень материалов, которые можно использовать в качестве твердой основы биочипа и материалов, которые использованы для формирования многослойного листа, могут быть модифицированы аминосиланами.

Известны методы модификации стеклянных подложек с применением функциональных кремнийорганичесих соединений. На стадии модификации на стеклянную подложку действуют раствором соединения формулы Y-X-Si(OR)₃, где Х -алкильный, арильный или алкиларильный мостик, R - алкил или арил, Y - требуемая функциональная группа в подходящем растворителе. В качестве модифицирующих агентов могут применяться триалкоксисиланы, содержащие функциональную группу, необходимую для дальнейшей иммобилизации биомолекул, например, эпокси-, меркапто-, амино-, акрилоил- и др. Подходящими модифицирующими агентами могут быть:

3-(глицидилокси)пропилтриэтоксисилан,

3-(глицидилокси)пропилтриметоксисилан,

3-меркаптопропилтриэтоксисилан,

3-меркаптопропилтриметоксисилан,

3-аминопропилтриэтоксисилан,

3-аминопропилтриметоксисилан,

3-(акрилоилокси)пропилтриэтоксисилан,

3-(акрилоилокси)пропилтриметоксисилан.

В качестве растворителя можно использовать этанол, метанол, пропанол, воду или их комбинации. В ходе процесса вода вызывает гидролиз алкоксигрупп, а полученный продукт реагирует с силанольными группам стекла. Параллельно идет процесс самопроизвольной поликонденсации. В результате с поверхностью подложки силоксановыми мостиками оказывается связанным большое число молекул алкоксисилана, несущее требуемые функциональные группы. Концентрация модифицирующего агента может варьировать в пределах от 0.1 до 20% по объему. Температуру проведения модификации выбирают в пределах от 15 до 30°С. Предпочтительно использовать комнатную температуру. Длительность стадии модификации выбирают от 30 мин до 4 часов, предпочтительно 1 час.

Для ковалентной модификации полимерных подложек, включающих электрофильные фрагменты (сложноэфирные группы, галогеналкановые фрагменты и др.), необходимо использовать только соединения указанной формулы с Y=NH₂. При этом модифицирующий агент следует использовать в гидролизованной форме. В результате модификации на поверхности полимера формируются аминогруппы. Температуру проведения модификации выбирают в пределах от 15 до 70°С. Длительность стадии модификации выбирают от 10 мин до 12 часов, предпочтительно от 20 до 120 минут. Модификация отдельных частей, входящих в состав биочипа, может проводиться предварительно перед сборкой биочипа и поэтому можно использовать достаточно высокую температуру (до 110°С) для предварительной сушки и модификации поверхности элементов (192)-(196) биочипа, выполненных, например, на основе стекла.

В то же время указанные агенты для модификации поверхности можно использовать для полимерных твердых носителей. Полимеры не обладают хрупкостью и могут быть изготовлены с помощью разных технологий, включающих, но не ограничивающих, способы штамповки, отливки, механической обработки. Группа используемых полимеров для формирования твердой основы включает, но не ограничивает, полиметилметакрилат, полибутилметакрилат, поливинилхлорид, поликарбонат, сополимеры метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил и др. Более предпочтительно использовать полиметилметакрилат, который имеет меньший уровень собственной флуоресценции, прозрачен и может составлять основу композитных несущих поверхностей. Поливинилхлорид также позволяет эффективно проводить модификацию поверхности и являться основой для изготовления индивидуальных биочипов.

Таким образом, в рамках данного изобретения, возможно использовать широкий спектр полимеров для создания многослойных листов. Материал, из которого изготавливают гибкий многослойный лист, может быть выполнен из прозрачных или цветных гибких полимеров, полимеров, которые снабжены отражающим слоем, полимеров с малым уровнем собственной флуоресценции, полимеров, способных к модификации поверхности для иммобилизации на ней олигонуклеотидных или белковых зондов.

К таким материалам можно отнести полиэтилен, полипропилен, поливинилхлорид и др. Наиболее предпочтительным является полимерный носитель, выполненный из поливинилхрода с нанесенным на него слоем клея. Например, фирма 3М (США) [14] и фирма Orafol Klebetechnik (Германия) выпускают широкий спектр самоклеящихся материалов, выполненных на основе прозрачного, белого и цветного поливинилхлорида (ПВХ) и ПВХ с напыленной отражающей поверхностью.

Известно применение ПВХ в качестве конструкционного элемента биочипов, но в известных решениях используют одну функцию ПВХ, например, для создания поверхностного слоя [15] или для применения в качестве клейкой основы для приклеивания внешнего слоя на слайд [11].

В предлагаемом изобретении техническая задача решается с помощью материалов, которые позволяют исключить термическое расширение и расслоение слоев, в процессе изготовления биочипа. В качестве примера, который включает, но не ограничивает объем изобретения, в качестве материала, из которого выполнены гибкие слои многослойного листа, выбран поливинилхлорид.

Неочевидность технического решения дополнительно связана с одновременным использованием всех технологических возможностей ПВХ. Разнообразие известных типов ПВХ позволяет создать биочип с новыми усовершенствованными возможностями.

К этим возможностям относятся: а) выбор цвета вспомогательной поверхности биочипов для создания цветовой гаммы биочипа, б) применение самоклеящейся пленки с напыленным слоем алюминия в качестве отражающей поверхности или создание отражающей поверхности из слоя алюминия, прикрепленного к поверхности полимера методом тиснения, в) выбор разной толщины слоя ПВХ для регулирования объема реакционной смеси, г) нанесение на поверхность ПВХ модифицирующего слоя для активации поверхности, д) нанесение на внешний слой гибкой основы графического изображения для штрих-кодов или других цифровых или буквенных идентификаторов.

Промышленная применимость

Конструктивные элементы биочипа на основе твердого субстрата и гибкого многослойного листа позволяют производить разные конструкции биочипов. Трансформирование поверхности позволяет уменьшить объем анализируемого вещества и снизить стоимости анализов. Конструкция биочипа позволяет проводить, например, процесс гибридизации при минимальном объеме реакционной жидкости в одинаковых условиях, что обеспечивается трансформируемой конструкцией биочипа. Обеспечение защиты поверхности биочипов при их хранении осуществляется за счет установки защитного слоя и прикрепления его краев к несущим поверхностям биочипа или за счет складывания лицом друг к другу рабочих зон симметричных частей биочипа.

Литература

1. Oligonucleotide Microarray Hybridization Chamber Quick Start Guide. Техническое описание фирмы "Aligent Technologies" (15.08.2002).

2. Mainquist J. К. et al. Apparatus and methods to process substrate surface features. US Patent Applic. 20040141887 (July 22, 2004).

3. Tajima H. et al. Reaction vessel and reaction apparatus comprising three-dimensional particle array. US Patent Applic. 20050282182 (December 22, 2005).

4. Hu Q. et al. Multi-array systems and methods of use thereof. US Patent Applic. US Patent Applic.20040248287 (December 9, 2004).

5. Xing W. et al. Microarray devices having controllable reaction volume. US Patent Applic. 20060141610 (June 29, 2006).

6. Lee J. et al. Patch for microarray reaction chamber having adhesive means support and two or more adhesive materials. US Patent Applic. 20050136459 (June 23, 2005).

7. Miyagawa I. et. al. Hybridization method, microarray for hybridization and kit for hybridization. JP Applic. 2005249421 (15.09.2005).

8. Yin Li-Te et al. Biochip containing reaction wells and method for producing same and use thereof. US Patent Applic.20050106607 (May 19, 2005).

9. Agrawal A. et al. Tiled biochips and the methods of making the same. US Patent Applic. 20030224506 (December 4, 2003).

10. Henninger D. et al. Array substrate holder. US Patent Applic. 20020085960 (July 4,2002).

11. Lebrun S. J. Substrate chemistry for protein immobilization on a rigid support. US Patent Applic. 20040063220 (April 1, 2004).

12. Белецкий И.П. и др. Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа. Патент RU 2265668 (2005.12.10).

13. Зарытова В.Ф. и др. Способ получения ДНК-чипов. Патент RU 2236467 (2004.09.20).

14. Техническое описание фирмы «Minnesota Mining and Manufacturing» (3M), (http://multimedia.mmm.com).

15. Solomon К. et al. Composite microarray slides US Patent Applic. 20030219816 (November 27, 2003).