Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОРАЗМЕРНОЙ СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ АНТИБИОТИКОВ РЯДА БЛЕОМИЦИНА В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Изобретение относится к молекулярной биологии, биоорганической химии и медицине и может быть использовано для получения наноразмерных систем доставки антибиотиков ряда блеомицина в эукариотические клетки.

В последние годы возрастает интерес к наноразмерным системам как способу доставки лекарственных средств в клетки. Это, в частности, связано с преимуществами этих систем по сравнению с существующими методами. Для многих видов наночастиц показана их способность проникать через клеточную мембрану. Различные пути доставки лекарств в клетки описаны в ряде обзоров (Jaroszeski M.J., Dang V., Pottinger С., et al., 2000, v.11, p.201-208; Sonoda S., Tachibana K., Uchino E., et al.. Cancer Biol. Ther. 2007, v.6, p.1276-1283; Gabizon A., Price D.C., Huberty J., et al., Cancer Res. 1990, v.50, p.6371-6378). Одним из путей может быть использование наночастиц в качестве носителей, которые могут способствовать проникновению в клетки плохо растворимых лекарств, придавать им большую устойчивость, возможно, уменьшать их побочные эффекты.

Спектр наночастиц, предлагаемых для доставки лекарственных средств, очень широк, они варьируют как по размеру (3-200 нм), так и по составу используемых материалов. В качестве наночастиц используются полимеры (полимерные наночастицы, мицеллы, дендримеры) и органометаллические соединения (наночастицы, нанотрубки) [Cho K., Wang X., Nie S., et al., Clin. Cancer Res. 2008, v.14, p.1310-1316].

Антибиотики ряда блеомицина (блеомицины), активно использующиеся в онкологии для лечения различных видов рака, представляют собой серосодержащие гликопептиды с мол. массой ~1500. Индивидуальные блеомицины отличаются между собой заместителем, связанным с карбоксильной группой битиазольного остатка. На Фиг.1 представлена структура двух антибиотиков ряда блеомицина: блеомицин А5 и блеомицин А2. Блеомицины обладают антибактериальным и противоопухолевым действием, они способны эффективно расщеплять внутриядерную ДНК клетки, приводя ее к гибели. Однако, поскольку блеомицины плохо проникают через клеточную мембрану, для достижения эффектов в терапии применяются большие дозы этих антибиотиков, которые приводят к интоксикации всего организма. Поэтому для снижения концентрации антибиотика необходимо организовать его эффективную доставку внутрь клетки.

Известны различные способы, повышающие эффективность доставки блеомицинов в клетки млекопитающих.

Известен способ доставки блеомицина в клетки с помощью ультразвука и микропузырьков при лечении злокачественной меланомы мышей. Способ позволяет остановить рост опухоли при концентрации блеомицина 0,25 мг/мл, что в 8 раз ниже концентрации, используемой при обычном лечении блеомицином (Sonoda S., Tachibana K., Uchino E., et al., Cancer Biol. Ther. 2007, v.6, p.1276-1283).

Инъекция мышам липосом, состоящих из фосфатидилхолина и блеомицина, меченного In¹¹¹, через 24 ч приводит к большему накоплению (в 20-40 раз) блеомицина в опухоли, чем при использовании свободного блеомицина (Gabizon A., Price D.C., Huberty J., et al., Cancer Res. 1990, v.50, p.6371-6378).

Компонент пчелиного яда мелитин также усиливает действие блеомицина за счет предотвращения репарации поврежденных участков ДНК (Orsolic N. Arh. Hig. Rada. Toksikol. 2009, v.60, p.317-326).

Известен способ доставки блеомицина в клетки с помощью вектора, состоящего из 12 копий аденовирусного белка, ответственного за проникновение в клетки. Конъюгаты вектора с блеомицином индуцируют гибель трансформированных клеток, а блеомицин в составе данной конструкции может фрагментировать ядерную ДНК; при этом эффективная цитотоксическая концентрация конструкции в 100 раз ниже, чем исходного блеомицина (Zochowska М., Раса A., Schoehn G., et al., PLoS ONE, 2009, v.4, e5569).

Наиболее близким к заявляемому способу-прототипу является способ получения наноразмерной системы доставки блеомицина в клетки (Nanoparticle-mediated delivery of bleomycin (2010) Georgelin Т., Bombard S., Siaugue J.-M., Angevante Chemie, v.49, p.1-6), заключающийся в следующем. Магнитные наночастицы (γ-Fe₂O₃, диаметром около 7 нм), покрывают слоем силикагеля (SiO₂), затем дважды обрабатывают полиэтиленгликолем для защиты от ретикулоэндотелиальной системы и затем смесью 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTS) и 2-[метокси(полиэтиленокси)пропил]триметоксисиланом (PEOS) для введения аминогрупп. Емкость частиц по аминогруппам регулируют соотношением APTS и PEOS. К полученным частицам (35-40 нм) ковалентно присоединяют блеомицин с помощью бифункционального реагента (глутарового альдегида) с выходом ~17%. Емкость по блеомицину можно варьировать путем изменения количества, вводимого в реакцию блеомицина. Размер полученных нанокомпозиций - ~50 нм. Полученные нанокмпозиции in vitro способны расщеплять плазмиду и проникать в клетки человеческой фибросаркомы. Цитотоксичность полученных нанокомпозиций возрастает с увеличением концентрации блеомицина в их составе, в то время как сами наночастицы практически не токсичны в выбранных условиях.

Недостатком известного способа является сложность и трудоемкость получения наноразмерной системы доставки, содержащей блеомицин.

Технической задачей изобретения является упрощение и сокращение длительности способа.

Поставленная техническая задача достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем.

Наночастицы диоксида титана, используемые для получения наноразмерной системы доставки блеомицинов в клетки, получают следующим известным способом (заявка RU 2008121609 А, опубл. 10.12.2009). Аморфные TiO₂-наночастицы синтезируют гидролизом тетрахлорида титана в деионизованной воде при 23-25°С, добавляя 2.5 М NaOH по каплям к раствору TiCl₄ в 5 М HCl при интенсивном перемешивании до конечного значения рН 6-7. Кристаллические TiO₂-наночастицы (анатаз) получают, добавляя при перемешивании смесь тетраизопропоксида титана и 2-изопропанола (объемное отношение 6: 1) к водному раствору HNO₃, принимая отношение [H⁺]:[Ti]=0,5 и [Н₂О]:[Ti]=200. Через 7 ч встряхивания при 70°С смесь охлаждают до комнатной температуры. После синтеза образцы TiO₂-наночастиц диализуют против воды в целлюлозных мембранах при 3-4°С. Концентрация TiO₂-наночастиц - 1-10 мг/мл. Нанозоли TiO₂ стабильны в течение нескольких месяцев при 4°С. Наночастицы представляют собой коллоидные растворы, в которых диоксид титана (TiO₂) в аморфном или в кристаллическом состоянии присутствует в виде отдельных частиц размером 2-50 нм, преимущественно, 3-5 нм.

Полученную суспензию, содержащую наночастицы TiO₂ размером 3-5 нм с концентрацией 1-25 мг/мл, озвучивают ультразвуком, смешивают с раствором соответствующего антибиотика ряда блеомицина с заданной концентрацией в соотношении TiO_2: антибиотик, равном 1:(0.01-2), и инкубируют в 0.1-0.5 М растворе NaCl, при комнатной температуре при интенсивном перемешивании в течение не менее 30 мин. Антибиотик в составе полученной наноразмерной системы доставки (нанокомпозиции) сохраняет способность расщеплять нуклеиновые кислоты. Доставку нанокомпозиции в клетки осуществляют путем обычного эндоцитоза, что не повреждает клеточные мембраны.

Определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа являются:

1. В качестве транспортера антибиотика ряда блеомицина в клетки используют наночастицы диоксида титана в аморфной или кристаллической форме размером 3-5 нм, что позволяет получить эффективную систему доставки антибиотика и снизить дозы антибиотика, которые оказывают токсическое действие на организм.

2. Суспензию наночастиц TiO₂ с концентрацией 1-25 мг/мл смешивают с раствором соответствующего антибиотика ряда блеомицина с заданной концентрацией в соотношении TiO_2: антибиотик, равном 1:(0.01-2), и инкубируют в 0.1-0.5 М растворе NaCl, при комнатной температуре при интенсивном перемешивании в течение не менее 30 мин, что позволяет получать нанокомпозиции TiO₂ / антибиотик за счет нековалентного связывания антибиотика с поверхностью наночастиц, а также упростить способ и сократить время получения наноразмерной системы доставки.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение системы доставки блеомицина с диоксидом титана TiO₂/Blm_A5.

Предварительно получили суспензию, содержащую наночастицы TiO₂ размером 3-5 нм в аморфной форме с концентрацией 10 мг/мл, и озвучили ультразвуком. Далее к 50 мкл водной суспензии наночастиц, содержащей 0.5 мг TiO₂ (10 мг/мл), добавили 40 мкл (1 мг) раствора блеомицина А5 (pingyangmycin, Китай) (25 мг/мл) и 10 мкл 2 М NaCl и инкубировали смесь в 0.2 М растворе NaCl при комнатной температуре при интенсивном перемешивании в течение 30 минут. Концентрация частиц в суспензии полученных нанокомпозиции - 5 мг/мл, соотношение TiO₂:Blm=1:2. Длительность способа составляет 40 мин.

Пример 2.

Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что к наночастицам добавляли 8 мкл (0.2 мг) раствора блеомицина и 32 мкл воды. Концентрация частиц в суспензии полученных нанокомпозиций - 5 мг/мл, соотношение TiO₂:Blm=1:0.4.

Пример 3.

Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что к наночастицам добавляли 4 мкл (0.1 мг) раствора блеомицина и 36 мкл воды. Концентрация частиц в суспензии полученных нанокомпозиций - 5 мг/мл, соотношение TiO₂:Blm=1:0.2.

Пример 4.

Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что к 50 мкл водной суспензии наночастиц, содержащей 50 мкг TiO₂ наночастиц (1 мг/мл) в кристаллической форме (анатаз), добавляли 2 мкл (0.5 мкг) раствора блеомицина (0.25 мг/мл), 38 мкл воды и 10 мкл 1 М NaCl. Концентрация частиц в суспензии полученных нанокомпозиций - 0.5 мг/мл, соотношение TiO₂:Blm=1:0.01.

Пример 5. Получение нанкомпозиции блеомицина с диоксидом титана TiO₂/Blm_A2.

Способ осуществляли аналогично примеру 3, за исключением того, что вместо блеомицина А5 использовали блеомицин А2 (веро-блеомицин, ООО Лэнс-Фарм, Россия). Концентрация частиц в суспензии полученных нанокомпозиций - 5 мг/мл, соотношение TiO₂:Blm=1:0.2.

Пример 6. Получение нанокомпозиций флуоресцентно-меченного блеомицина А5 с диоксидом титана TiO₂/Blm_A2(Flu).

Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо блеомицина А5 использовали препарат Blm_A5(Flu), содержащий флуоресцентную метку. Конъюгат Blm_A5(Flu) получали, добавляя 1 мг флуоресцеинизотиоционата (FITC, Merck, Германия) к раствору 1.5 мг блеомицина в 100 мкл 0.2 М Na₂CO₃. После 1 ч инкубации при 60°С реакционную смесь осаждали ацетоном. Выделение Blm(Flu) из реакционной смеси проводили путем ступенчатой хроматографии на DEAE целлюлозе (колонка 1 мл). Продукт Blm(Flu) элюировали водой, а продукты гидролиза FITC отмывали 0.1 М и 1 М NaCl. Продукт растворяли в 0.3 мл воды. Наличие Blm(Flu) в элюате проверяли с помощью ТСХ в системе изопропанол-аммиак-вода (6:1:3). Подвижность продукта (R_f~0.5) была значительно меньшей по сравнению с производными флуоресцеина, но большей по сравнению с исходным блеомицином. Продукт характеризовали с помощью ТСХ и электронного спектра, который представлял собой суперпозицию спектров Blm и Flu и практически совпадал со спектром смеси Blm и FITC с молярным соотношением 1:1. Соотношение Blm:Flu определяли с учетом коэффициентов молярного поглощения для блеомицина (ε₂₆₀=16000 l·mol^-1·см^-1) и для флуоресцеина (ε₄₉₅=74000 l·mol^-1·см^-1). Выход Blm_A5(Flu) составил 35-40%. Конечная концентрация Blm_A5(Flu) составила 1.3·10^-3 М (2 мг/мл).

Нанокомпозицию TiO₂/Blm_A5(Flu) получали, добавляя 25 мкл (0.05 мг) конъюгата Blm_A5(Flu), 10 мкл 2 М NaCl и 15 мкл воды к 50 мкл суспензии наночастиц, содержащей 0.5 мг TiO₂ в аморфной или кристаллической (анатаз) форме. Концентрация частиц в суспензии нанокомпозиции - 5 мг/мл, соотношение TiO₂:Blm_A5(Flu)=1:0.1.

Пример 7. Определение цитотоксичности нанокомпозиции TiO₂/Blm(A5).

Токсичность TiO₂-наночастиц, препаратов Blm_A5 и TiO₂/Blm_A5 в отношении клеток HeLa оценивали по стандартной методике с использованием суправитального красителя нейтрального красного [Borenfreund E., Puerner J.A. Toxicol Lett. 1985, v.24, p.119-124], который, при добавлении в среду, накапливается в лизосомах живых клеток. Использовали TiO₂-наночастицы в аморфной форме.

Эксперимент проводили следующим образом. Клетки рассеивали на 96-луночные планшеты (концентрация 10^-4 клеток на лунку) в среде IMDM, содержащей 10% ЭТС и антибиотики (пенициллин и стрептомицин, по 100 ед/мл) и через сутки добавляли образцы препаратов TiO₂, Blm или TiO₂/Blm в различных концентрациях: TiO₂ (0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.2 и 5 мг/мл), Blm (0.001, 0.005, 0.02, 0.1, 0.25, 0.5 мг/мл) или TiO₂/Blm (концентрация по TiO₂ - 0.5 мг/мл, концентрации по Blm - 0.001, 0.005, 0.02, 0.1, 0.25, 0.5 мг/мл, т.е. соотношение TiO₂:Blm=1:(0.01, 0.04, 0.2, 0.5, 1). Клетки инкубировали с препаратами в течение 5, 24 и 72 ч, после чего отмывали буфером PBS и добавляли среду RPMI с нейтральным красным (0.1 мг/мл); через 3 ч инкубации клетки промывали 2 раза буфером PBS и лизировали 50% этанолом, содержащим 1% уксусную кислоту. Оптическую плотность в полученных лизатах измеряли при 570 нм на планшетном фотометре Thermo Multiskan Ascent (Fisher Scientific, США). Процент ингибирования определяли по соотношению оптической плотности в эксперименте и в контрольном образце, не содержащем препаратов с наночастицами.

Были определены токсические концентрации для препаратов TiO₂, Blm, TiO₂/Blm (IC₅₀), при которых погибает половина клеток. Цитотоксичность препаратов при 5-часовой инкубации не детектируется. Было обнаружено, что TiO₂-наночастицы после 24 и 72 ч инкубации слаботоксичны (IC₅₀=1.7±0,2 мг/мл), а после 72 ч инкубации их цитотоксичность несколько увеличивается (IC₅₀=0.62±0.14 мг/мл). Чтобы исключить влияние наночастиц на цитотоксичность препарата TiO₂/Blm, использовали нетоксическую концентрацию TiO₂ (0.5 мг/мл) при варьировании концентрации блеомицина. Величины IC₅₀ через 24 ч для препаратов Blm_A5 и TiO₂/Blm_A5 составили 0.36±0.15 мг/мл и 0.16±0.02 мг/мл соответственно, а через 72 ч - (4±0.08)·10^-3 мг/мл и 0.15·10^-3 мг/мл соответственно, т.е. блеомицин в составе нанокомпозиции проявляет большую токсичность по сравнению со свободным блеомицином, причем это различие увеличивается с увеличением времени инкубации препаратов с клетками. Очевидно, различие в цитотоксичности препаратов Blm_A5 и TiO₂/Blm_A5 вызвано большей эффективностью проникновения блеомицина в составе нанокомпозиции по сравнению с несвязанным блеомицином.

Пример 8. Оценка способности нанокомпозиции TiO₂/Blm_A5(FIu) проникать в клетки HeLa.

Получение флуоресцентно-меченного конъюгата Blm_A5(Flu) и нанокомпозиции TiO₂/Blm_A5(Flu) описано в примере 6. В эксперименте использовали клетки HeLa, Hoechst 33343, Cell Mask Plasma Membrane Stain, клеточную среду IMDM, эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), антибиотики, PBS (Invitrogen, США). Для экспериментов клетки рассеивали в необходимой концентрации на 8-луночные камеры (Chamber Slide, Nunc. Inc.) и культивировали в среде IMDM, содержащей 10% ЭТС и антибиотики (пенициллин и стрептомицин, по 100 ед/мл) до достижения 70% монослоя, после этого заменяли культуральную среду на среду (200 мкл) без сыворотки и антибиотика.

К клеткам добавляли раствор Blm_A5(Flu) и нанокомпозицию TiO₂/Blm_A5(Flu) (содержащую наночастицы в аморфной форме), полученные, как описано в примере 6:

- 5 мкл раствора Blm_A5(Flu); конечная концентрация в клеточной среде - ~0.05 мг/мл;

- 5 мкл нанокомпозиции TiO₂/Blm_A5(Flu); конечная концентрация в клеточной среде - ~0.1 мг/мл по наночастицам и - 0.01 мг/мл по Blm(Flu).

После 5 или 24 ч инкубации клетки отмывали PBS, фиксировали 3.7% формалином (10 мин) и окрашивали Hoechst 33343 и Cell Mask Plasma Membrane Stain в течение 10 мин. Полученные образцы анализировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 UV Meta Microscope (Carl Zeiss, Inc., Германия) (Центр коллективного пользования ИЦИГ СО РАН).

Проникновение в клетки HeLa нанокомпозиции TiO₂/Blm_A5(Flu) (а, б) и образца Blm_A5(Flu) (в, г) после инкубации с клетками в течение 5 ч (а, в) и 24 ч (б, г) иллюстрируется Фиг.2(а-г).

Из Фиг.2 видно, что уже после 5 ч инкубации клеток с нанокомпозицией TiO₂/Blm_A5(Flu) заметно появление эндосом в цитоплазме клеток, содержащих меченный блеомицин, и увеличивается размер самих клеток, что характерно для действия блеомицина на клетку. После 24 ч количество эндосом с меченными нанокомпозициями увеличивается. Свободный блеомицин также способен проникать в клетки, но в значительно меньшей степени, поэтому внутри клетки визуализировать его не удалось. Полученные результаты свидетельствуют о том, что блеомицин в составе предлагаемой системы доставки на основе наночастиц TiO₂ более эффективно проникает внутрь клетки.

Пример 9. Оценка способности нанокомпозиции TiO₂/Blm_A5(Flu) проникать в клетки MDCK.

Способ осуществляли аналогично примеру 8, за исключением того, что в качестве клеток использовали клетки MDCK, а в качестве наночастиц в составе нанокомпозиции TiO₂/Blm_A5(Flu) использовали TiO₂ в аморфной и кристаллической (анатаз) форме, полученные, как описано в примере 6. Полученные результаты (Фиг.3а, б) свидетельствуют о том, что наночастицы TiO₂ способствуют проникновению блеомицина внутрь клетки.

Пример 10. Воздействие не связанного Blm_A5 и нанокомпозиции TiO₂/Blm_A5 на внутриклеточную ДНК.

Для каждого эксперимента нанокомпозиции TiO₂/Blm_A5, полученные, как описано в примерах 1-3, обрабатывали ультразвуком непосредственно перед добавлением к клеткам. Клетки HeLa рассеивали на 6-луночные планшеты; после достижения 70% монослоя заменяли среду на среду без сыворотки и антибиотика (450 мкл), и добавляли 50 мкл препаратов Blm_A5 (конечные концентрации в среде: 0.1 мг/мл; 0.2 мг/мл; 1 мг/мл) и TiO₂/Blm_A5 с соотношением TiO₂:Blm=1(0.2-2) (конечные концентрации в среде: TiO₂ - 0.5 мг/мл; Blm(A5) - 0.1 мг/мл; 0.2 мг/мл; 1 мг/мл). После 5 ч инкубации клетки промывали буфером PBS, снимали с поверхности планшета, осаждали центрифугированием и выделяли ДНК по стандартной методике (Herrmann M., Lorenz H.M., Voll R., et al., Nucleic Acids Res. 1994, v.22, p.5506-5507). К осадку клеток добавляли 50 мкл лизирующего буфера (1% NP 40 в 20 мМ ЭДТА, 50 мМ Tris-HCl, pH 7.5), встряхивали 30 с и центрифугировали 5 мин при 1600 g. Супернатант отделяли и процедуру с осадком повторяли. К супернатанту добавляли 10% SDS до конечной концентрации 1% и обрабатывали РНКазой А (конечная концентрация 5 мг/мл) при 56°С в течение 2 ч, затем протеиназой К (конечная концентрация 2,5 мг/мл) при 37°С в течение 2 ч. ДНК осаждали 3-кратным объемом смеси 10М ацетата аммония и 96% этанола (1:5). Осадок промывали 70% спиртом, высушивали и растворяли в деионизованной воде. Электрофорез проводили в 1% агарозном геле при напряжении 5 В/см. Окрашенные бромистым этидием фрагменты ДНК визуализировали на трансиллюминаторе (Gel Doc XR System, Bio-Rad, США). На Фиг.4 приведены результаты электрофореграммы фрагментированной ДНК, выделенной из клеток HeLa, обработанных свободным Blm_A5 в разных концентрациях (дор. 2-4), TiO₂-наночастицами (дор. 5) или нанокомпозициями TiO₂/Blm_A5, с разным соотношением TiO₂:Blm, равным 1:(0.2-2) (дор. 6-8). М - маркер (100-1000 нп).

Деградацию ДНК в клетке можно наблюдать через 5 ч [Mungunsukh О., Griffin A.J., Lee Y.H., Day R.M. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. (2010) v.298, L696-L703]. На Фиг.4 приведена электрофореграмма реакционных смесей, полученных после 5 ч инкубации препаратов TiO₂, Blm_A5 и TiO₂/Blm_A5 с клетками HeLa. Видно, что обработка клеток наночастицами в концентрации 0.5 мг/мл (нетоксичной для клеток, см. пример 7) в отсутствие блеомицина не приводит к расщеплению ДНК (Фиг.4, дор.5). При использовании свободного блеомицина степень расщепления ДНК за это же время возрастает с увеличением его концентрации. При концентрации блеомицина 0.1 мг/мл не наблюдается продуктов реакции; при концентрации 0.2 мг/мл наблюдается лишь очень слабое расщепление ДНК и лишь концентрация 1 мг/мл приводит к заметному расщеплению ДНК (Фиг.4, дор.2, 3 и 4 соответственно). В присутствии нанокомпозиции TiO₂/Blm_A5 этот процесс усиливается: уже при концентрации 0.1 мг/мл наблюдается слабое расщепление ДНК (Фиг.4, дор.7). Сравнение дорожек 4 и 7, демонстрирующих примерно одинаковую степень расщепления ДНК, позволяет сделать вывод о том, что нанокомпозиция TiO₂/Blm_A5 приблизительно в 5 раз более эффективна, по сравнению со свободным Blm_A5.

Предлагаемый способ позволит упростить и сократить длительность известного способа (прототипа) и обеспечить получение эффективной наноразмерной системы доставки антибиотиков блеомицинового ряда в эукариотические клетки, а также позволит снизить дозы антибиотика, которые оказывают токсическое действие на организм.