КОНСОРЦИУМ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАЦИЛЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ЗАКВАСОК ДЛЯ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ, ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ И НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МИКРОФЛОРЫ ДЕТЕЙ В ВОЗРАСТЕ ОТ 3 ДО 12 ЛЕТ

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве препаратов и продуктов питания пробиотического действия, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте от 3 до 12 лет.

В настоящее время основным приемом коррекции нарушенного микробиоценоза человека является применение препаратов и продуктов на основе микроорганизмов - представителей нормофлоры человека - и в первую очередь бифидобактерий и лактобацилл.

В России для приготовления бактерийных препаратов и продуктов лечебно-профилактического назначения для детей используются штаммы в составе монопрепаратов: бифидобактерий (B.bifidum 1, B.bifidum 791, B.bifidum ЛВА-3, B. adolescentis MC-42) и лактобацилл (L.plantarum 8-PA-3, L.fermentum 90-TC-4).

Вместе с тем, более корректным представляется подход к бактериотерапии на основе препаратов многовидового состава.

Это подтверждается прежде всего тем, что бифидофлора, составляющая 90% от совокупности всей нормофлоры, представлена в кишечнике здорового человека сразу несколькими видами, каждый из которых имеет свои биохимические и физиологические особенности.

По данным Гончаровой Г.И. (1982 г.), вид B.bifidum выявляется у здоровых людей всех возрастных групп; у детей на грудном вскармливании он является преобладающим и выделяется у 70% обследованных, до 40% - у детей 4-6 лет и до 15-20% - у взрослых.

Вид B.longum также характерен для детей и взрослых и выделяется у 40-60% детей первого года жизни и у 70-75% детей старшего возраста и взрослых людей среднего возраста; у пожилых людей он выделяется в 30% случаев (1).

Вид В.adolescentis свойственен взрослым людям и детям старшего возраста и обнаруживается у них в 60-65% случаев. Этот вид становится преобладающим у пожилых людей (85%).

Виды B.infantis и B.breve и их подвиды обнаруживаются преимущественно у детей грудного возраста. Изменение типа вскармливания ребенка, снижение общей резистентности организма, а также незрелость ферментативных процессов желудочно-кишечного тракта приводит к изменению видового состава бифидофлоры.

Представленные данные являются убедительным обоснованием необходимости создания препаратов целенаправленного назначения для определенных возрастных групп. Использование в составе лечебных препаратов и продуктов функционального питания сразу нескольких видов пробиотических микроорганизмов предположительно позволит суммировать полезные свойства, присущие отдельным штаммам, повысить биологическую активность препаратов и продуктов, будет способствовать избирательному заселению кишечника культурой того вида, который наиболее адекватен микробиоценозу конкретного индивидуума. Можно предположить, что это должно повысить эффективность коррекции микробиоценоза и как следствие обеспечить быстрейшее выздоровление.

Известен консорциум бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum B379M, Bifidobacterium breve 79-119, Bifidobacterium infantis 73-15, Bifidobacterium adolescentis Г7513, предназначенный для приготовления кисломолочных, неферментированных пищевых продуктов и бактерийных препаратов (2).

Несмотря на широко представленный видовой состав бифидофлоры человека, в нем не учитываются особенности видового состава микробиоценозов разных возрастных групп людей, формирующихся в процессе онтогенеза и изменяющихся при переходе из одной возрастной группы в другую.

Наиболее близким аналогом к заявленному изобретению является способ получения возрастоспецифичных бифидопрепаратов по патенту 2126043 (3). Предложены бифидосодержащие препараты для детей до 3-5 лет, детей старшего возраста и взрослых с использованием не менее трех видов бифидобактерий в определенном соотношении, соответствующем видовому составу бифидофлоры кишечника здорового человека данного возраста. В прототипе предложены определенные количественные соотношения бифидобактерий:
1) для детей в возрасте до 3-5 лет - В.longum - 38,0-52,0, В.bifidum - 30,0-42,0, В.breve или В.infantis - остальное до 100%;
2) детей старшего возраста и взрослых - В.longum - 32,0-42,0, В.bifidum - 29,0-39,0, В.adolescentis - остальное.

Недостатком вышеуказанного способа является то, что эти композиции составлены без учета постоянного симбиоза бифидобактерий с другими представителями нормофлоры, в особенности с лактобациллами, т.к. именно этот симбиоз является доминирующим в микробиоценозе кишечника. Лактобациллы активно поглощают кислород, образуют углекислый газ, это способствует поддержанию анаэробных условий и высокого парциального давления, что положительно сказывается на развитии бифидофлоры.

Другим недостатком данного изобретения является то, что помимо предложенного принципа рецептуростроения он не содержит конкретных рекомендаций по штаммовому составу препаратов. Следует иметь в виду, что каждому штамму присущи конкретные свойства, продукция определенных метаболитов, оказывающих на микробиоценоз целенаправленный эффект. В связи с этим конструирование препаратов пробиотического действия должно проводиться на широком спектре определенных штаммов, на основе углубленного изучения их биологических и биохимических свойств. Полноценный препарат может быть создан только с учетом индивидуальных особенностей входящих в него штаммов.

Вместе с тем, маловероятно, что при прохождении желудочно-кишечного тракта соотношения, приведенные в данном изобретении, сохранятся. Учитывая различия в биохимических свойствах штаммов, входящих в состав препаратов, при равных стартовых условиях преимущество будет за штаммами, обладающими наибольшим сродством к микробиоценозу конкретного индивидуума.

Задачей настоящего изобретения является создание симбиотического сообщества доминантных микроорганизмов, которые предопределяют функции микрофлоры и максимально приближены к естественному микробиоценозу детей в возрасте от 3 до 12 лет.

Данная задача была решена путем получения консорциума бифидобактерий и лактобацилл Bifidobacterium bifidum I, B.bifidum 791, B.breve 79-88, B.infantis 79-43, B. longum B379M, Lactobacillus plantarum 8-PA-3, L.fermentum 90-TC-4, Lactobacillus acidophilus К3ш24, ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 160, используемый для приготовления бактерийных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте от 3 до 12 лет.

В состав консорциума входят следующие штаммы:
1. Штамм B. bifidum 1 выделен из кишечника здорового грудного ребенка, депонирован в ГИСК им.Тарасевича.

2. Штамм B.bifidum 791 выделен из кишечника здорового грудного ребенка, депонирован в ВНИИгенетика в ЦМПМ под В-3300.

3. Штамм B.breve 79-88 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, депонирован в ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского под 150.

5. Штамм B.infantis 79-43 выделен из кишечника здорового грудного ребенка, депонирован в ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского под 156.

6. Штамм B.longum B379M, выделен из кишечника взрослого человека, депонирован в ВНИИгенетика в ЦМПМ под В-2000.

7. Штамм L.plantarum 8-PA-3, растительного происхождения, депонирован в ГИСК им.Тарасевича.

8. Штамм L.fermentum 90-ТС-4, выделен из кишечника здорового человека, депонирован в ГИСК им.Тарасевича.

9. Штамм L.acidophilus К3ш24, выделен из кишечника здорового человека, депонирован во ВНИИгенетика ЦМПМ под ЦМПМ В-31-90.

Консорциум получен путем двукратного раздельного и последующего совместного культивирования входящих в него штаммов на питательных средах с накоплением биомассы совокупной микрофлоры до lg 8-9.

Использование в составе лечебных препаратов и продуктов функционального питания симбиотической ассоциации микроорганизмов, моделирующей микробиоценоз детей в возрасте от 3 до 12 лет, подтвердило наше предположение, что одновременное использование нескольких видов пробиотических микроорганизмов приводит не только к суммированию полезных свойств, но и к сверхсуммарному эффекту, это позволяет повысить биологическую активность препаратов и продуктов, приготовленных на его основе, и способствует избирательному заселению биотопа теми видами, которые наиболее адекватны микрофлоре конкретного индивидуума. Это обеспечивает более эффективную коррекцию микрофлоры ребенка, повышение иммунного статуса и как следствие быстрейшее выздоровление его.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение консорциума, предназначенного для коррекции микрофлоры кишечника, слизистых, открытых полостей, кожных покровов детей в возрасте от 3 до 12 лет, обладающего иммунокоррегирующим действием и обеспечивающего более высокую защитную, иммунотропную, метаболическую и пищеварительную функции за счет синергизма действия входящих в него бифидобактерий и лактобацилл, стимулирующего рост нормальной микрофлоры, что позволяет использовать его для производства высокоэффективных бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок для приготовления кисломолочных продуктов, что позволит расширить арсенал технических средств лечебно-профилактического назначения.

Бактерийные препараты на основе консорциума могут быть как в жидком, так и в сухом виде (порошки, таблетки, капсулы, суппозитории, мази, гранулы, кремы, свечи. Биологически активные добавки могут найти широкое применение как в пищевой промышленности при производстве пищевых продуктов питания, так и в косметической промышленности при производстве косметической продукции, при этом БАД может быть в жидком виде, а также в виде порошков, таблеток, гранул, капсул, мазей и кремов. Закваски могут быть как в жидком, так и в сухом виде - порошкообразном, таблетированном, гранулированном.

Использование консорциума при производстве ферментированных и неферментированных пищевых продуктов позволит расширить ассортимент пищевых продуктов, обладающих лечебно-профилактическим действием, таких как квас, соки, нектары, овощные и фруктовые пюре, детское питание, что одновременно упростит способ введения в организм ребенка пробиотика.

Культурально-морфологические признаки консорциума.

Клетки штаммов бифидобактерий, выращенных в ферментере, представляют собой равномерно окрашенные грамположительные палочки, расположенные цепочками или скоплениями, строгие анаэробы; клетки штаммов лактобацилл представляют собой грамположительные палочки, расположенные поодиночке или цепочками из 2-4 или более клеток, микроаэрофилы.

Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов, входящих в консорциум.

Для бифидобактерий оптимальная температура выращивания составляет 37,5-38^oС, рН питательных сред 7,2-7,4. Каталазу не образуют, желатин не разжижают. Сбраживают глюкозу с образованием кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,1-3,9. Видовая принадлежность каждого из штаммов определена в соответствии с их ферментативной активностью.

Для лактобацилл оптимальная температура выращивания составляет 37,5-38^oС, рН питательных сред 7,2-7,5.

Штамм L.plantarum 8-PA-3 ферментирует глюкозу с образованием кислоты без газа, разлагает рамнозу, сахарозу, галактозу, целлобиозу, слабо ферментирует сорбит, мальтозу, лактозу, салицин и маннит.

Штамм L. fermentum 90-TC-4 ферментирует глюкозу с образованием газа, разлагает лактозу, мальтозу и галактозу и слабо маннозу и сахарозу. Сорбит, целлобиозу, рамнозу, салицин и маннит не сбраживает.

Штамм L. acidophilus К3ш24 не образует газа, продуцирует каталазу, сбраживает глюкозу, лактозу, галактозу, маннозу и декстрозу.

Консорциум активно размножается на средах разного состава, принятых в производстве, к концу экспоненциальной фазы культивирования достигая в 1 мл lg 8,9-9,3; сквашивает молоко с высокой концентрацией бифидобактерий и лактобацилл, что является основным показателем возможности его использования в технологическом процессе производства кисломолочных продуктов. (табл.1).

Улучшение массообменных характеристик при культивировании в ферментере: периодическое барботирование азотом, перемешивание со скоростью 300 об/мин, углеводная подпитка, автоматическая регуляция значения рН - позволяют сократить экспоненциальную фазу роста до 6-8 ч.

Продуцируя органические кислоты, перекись водорода, антибиотикоподобные вещества, консорциум ингибирует рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (табл.2).

Как видно из табл. 2, антагонистическое действие консорциума in vitro проявляется значительно более активно, чем в монопрепаратах.

Подтверждением лабораторных исследований препаратов явились клинические испытания лиофилизированного препарата, приготовленного на основе консорциума. Целью испытаний было показать переносимость и клиническую эффективность, обусловленную корригирующим воздействием препарата на микрофлору кишечника, и сопоставлению его эффективности с коммерческими препаратами.

Под наблюдением находилось 48 больных детей в возрасте от 3 до 12 лет с дисбактериозом кишечника: 18 из них принимали коммерческий препарат бифидумбактерина, 12 - коммерческий препарат лактобактерина, 18 - препарат на основе предлагаемого консорциума. Переносимость всех препаратов была хорошей, не обнаружена отрицательная динамика в показателях периферической крови, анализы мочи также оставались нормальными.

Сравнительное изучение микробиоценоза кишечника детей, получавших коммерческие монопрепараты (бифидумбактерин и лактобактерин) и препарат на основе консорциума показало, что при лечении последним микрофлора кишечника приходит в норму эффективней и в более ранние сроки (табл.3).

Способность консорциума активно наращивать биомассу в питательных средах, сквашивать молоко в короткие сроки, проявлять большую специфическую (антагонистическую) активность in vitro, более высокую клиническую эффективность по сравнению с монопрепаратами делает возможным его использование в приготовлении бактерийных препаратов, биологически активных добавок, заквасок для кисломолочных продуктов, вводить в состав неферментированных и ферментированных пищевых продуктов.

Как видно из табл.3, после 30-дневного курса приема всех препаратов происходило повышение содержания бифидобактерий и лактобацилл; причем значительно более эффективно после приема консорциума.

Пример 1. Получение консорциума
1-й пассаж
Лиофилизированные штаммы B.bifidum 1, B.bifidum 791, В.breve 79-88, B. infantis 79-43, B.longum B379M, L.plantarum 8-PA-3, L.fermentum 90-TC-4, L. acidophilus К3ш24 в количестве 0,1 г сухой биомассы (1 доза) вносят каждый отдельно в среду выращивания и титруют методом десятикратных разведений до 10^-7-8. Выращивают 48-72 ч при 37,5-38^oС.

2-й пассаж
Выросшую культуру каждого из штаммов в объеме 5-10% вносят в среду накопления и раздельно культивируют в течение 16-18 ч при 37,5-38^oС.

Затем биомассу каждого из штаммов смешивают в следующем соотношении: 10 ч. совокупной биомассы бифидобактерий (в равных долях каждого из штаммов) и 1 ч. лактобацилл.

Полученную совокупную биомассу в объеме 5-10% вносят в среду выращивания и культивируют при 37,5-38^oС, регулируя процесс в течение 6-8 ч в ферментере. Получают консорциум в жидком виде. Содержание пробиотических микроорганизмов в полученной биомассе симбиотической ассоциации составляет lg 8-9 в 1 мл.

Пример 2. Получение лиофилизированного бактерийного препарата
К консорциуму, приготовленному по примеру 1, добавляют защитную среду высушивания (сахароза 80% и желатин 8% в объеме 10-12%) и разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при минус 40-45^oС и лиофильно высушивают. Полученный препарат содержит в 1 г сухой биомассы не менее 10⁹ живых клеток пробиотических микроорганизмов.

Пример 3. Использование консорциума в качестве закваски для приготовления продукта лечебно-функционального питания для детей от 3 до 12 лет.

Закваску (консорциум, приготовленный по примеру 1) в объеме 5% вносят в стерильное молоко, перемешивают и культивируют 6-10 ч до образования сгустка, после чего продукт охлаждают и сливают. В результате получают лечебно-профилактический кисломолочный продукт с содержанием полезной микрофлоры не менее 10⁸ в 1 мл.

Пример 4. Получение жидкой биологически активной добавки к пище, предназначенной для детей от 3 до 12 лет.

Консорциум, приготовленный по примеру 1, в объеме 5-10% вносят в ферментер с питательной средой следующего состава в расчете на 1 л продукта: 5%-ный водный экстракт топинамбура, 2% эпидермата-0, 0,5% хлористого натрия, 0,1% аскорбиновой кислоты, 0,1% агар-агара и культивируют, регулируя процесс, в течение 6-8 ч при 37,5-38^oС и стерильно разливают в емкости. В результате получают биологически активную добавку к пище с общей концентрацией пробиотической микрофлоры не менее 10⁸ в 1 мл.

Полученная добавка обладает выраженным иммунокоррегирующим действием.

Пример 5: Получение ферментированного напитка (кваса)
Консорциум, приготовленный по примеру 1, в объеме 5% вносят в подготовленную основу для приготовления кваса (вода, сахар, мед, сусло, аскорбиновая кислота), перемешивают и культивируют 8-10 ч до получения напитка с величиной титруемой кислотности 65-85^oТ, после чего продукт охлаждают и сливают. В результате получают напиток с высокими органолептическими показателями, с содержанием в 1 мл не менее 10⁸ живых пробиотических микроорганизмов, который помимо хороших вкусовых характеристик обладает высокими лечебно-профилактическими свойствами.

Источники информации
1. Гончарова Г.И. "Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин", диссертация д.б.н., 1982 г.

2. Патент РФ 2109054, А 23 С 9/12, А 61 К 35/74, 01.04.1997.

3. Патент РФ 2126043, А 23 С 9/12, А 61 К 35/74, 10.03.1999.