Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОСТИ ТРОМБИНА И ФИБРИНОГЕНА

Область техники, к которой относится изобретение

Описан способ измерения активности тромбина в присутствии фибриногена или измерения функциональности фибриногена в присутствии тромбина.

Предшествующий уровень техники

Фибриноген и тромбин представляют собой важнейшие белки, участвующие в достижении гомеостаза после повреждения сосудов и играющие существенную роль в образовании сгустка крови. Фибриноген и тромбин можно комбинировать в форме порошка или в неводной суспензии, без инициации типичной реакции свертывания, таким образом предотвращая образование фибринового сгустка до тех пор, пока белки не будут гидратированы в водной среде или другой жидкой среде, в которой растворимы белки. Смесь этих белков в форме порошка имеет разнообразные потенциальные виды биомедицинского применения, включая местный гемостаз, регенерацию ткани, доставку лекарственных средств и т.д. Кроме того, смесь этих белков можно загружать на носитель или подложку или другое медицинское устройство в виде порошка для получения продукта, которое можно использовать, например, в качестве гемостатического устройства.

Свертывающая активность тромбина обычно измеряется комбинированием тромбина в растворе с известным количеством фибриногена в растворе. В соответствующих условиях скорость образования сгустка после комбинирования этих двух белков зависит от активности тромбина. Скорость образования сгустка образца с неизвестным количеством тромбина сравнивается со скоростью образования сгустка эталоном тромбина или стандартом тромбина для определения активности образца.

Активность тромбина представляет собой имеющий решающее значение атрибут любого продукта тромбина/фибриногена и определяет его функциональность. Хотя измерение свободного тромбина является простым способом, измерение активности тромбина, когда тромбин и фибриноген находятся в не вступившей в реакцию смеси, представляло собой проблему, поскольку его измерение обычно требует, чтобы смесь белков была гидратирована и солюбилизирована, и образование фибринового сгустка между солюбилизированным тромбином и фибриногеном начинается сразу после гидратации. Кроме того, поскольку, как известно, тромбин специфически связывается и взаимодействует со сразу образованным фибриновым сгустком, то тромбин становится связанным с фибриновым сгустком и больше не является свободно растворимым в гидратирующем растворе и становится недоступным для последующего измерения активности тромбина. Следовательно, итоговое измерение активности тромбина продукта тромбина/фибриногена посредством гидратации и образования сгустка является лишь частичным и, следовательно, неточным.

Кроме того, когда белки находятся в не вступившей в реакцию смеси и загружаются на носитель, подложку или медицинское устройство, может быть необходимым удаление белков с подложки для точного измерения активности тромбина, например, если носитель, подложка или медицинское устройство неблагоприятно воздействует на измерение активности или функциональность белков вследствие физических, химических или оптических помех системы выявления и измерения. Для преодоления помех носителя, подложки или медицинского устройства удаление или экстракцию белков нужно выполнять без воздействия на смесь водных условий, которые бы привели к образованию сгустка, препятствующего последующему измерению.

Фибриноген чаще всего измеряют способом, первоначально описанным Clauss, который измеряет функциональность фибриногена на основании скорости образования сгустка. В типичном анализе Clauss образец с неизвестным количеством растворимого фибриногена комбинируется с избытком тромбина. Пропорции фибриногена и тромбина таковы, что фибриноген представляет собой ограничивающий скорость реагент, а скорость образования сгустка является функцией концентрации фибриногена. Быстрое время свертывания было бы показателем высокой концентрации фибриногена. Напротив, более длительное время свертывания указывало бы на низкую концентрацию функционального фибриногена. Количество функционального фибриногена можно определить сравнением времени свертывания образца со временем свертывания серии стандартов для построения стандартной кривой. Концентрацию фибриногена в образце можно определить математически на основании уравнения, выведенного из величин времени свертывания стандартов.

Хотя измерение свободного фибриногена в растворе, например плазме человека, можно выполнить принятыми способами, оценка функциональности фибриногена, когда фибриноген имеется в присутствии тромбина, была проблемой. Гидратация смеси приведет к опосредованному тромбином превращению фибриногена в нерастворимый сгусток фибрина. После генерирования фибрина любое последующее измерение фибриногена больше невозможно, поскольку высвобождение фибринопептидов из фибриногена, приводящее к образованию фибрина, является по существу необратимым.

Следовательно, остается потребность в точном измерении активности тромбина в присутствии фибриногена и в измерении функциональности фибриногена в присутствии тромбина.

Детальное описание чертежей

На фиг.1 показано влияние рН раствора инактивации на активность извлеченного тромбина.

Краткое описание сущности изобретения

В настоящем документе описан способ определения активности или функциональности или первого реактивного компонента, или второго реактивного компонента в смеси первого реактивного компонента и второго реактивного компонента, включающий стадии (а) обратимого ингибирования первого реактивного компонента для получения смеси, содержащей инактивированные первый реактивный компонент и второй реактивный компонент; (b) добавления к смеси избытка второго реактивного компонента при оценке активности первого реактивного компонента или избытка первого реактивного компонента при оценке активности второго реактивного компонента; (с) обратимой активации первого реактивного компонента; (d) предоставления возможности первому реактивному компоненту взаимодействовать со вторым реактивным компонентом в смеси и с избытком второго реактивного компонента или предоставления возможности первому реактивному компоненту взаимодействовать со вторым реактивным компонентом в смеси и с избытком первого реактивного компонента; и (е) определения активности или функциональности первого или второго реактивного компонента, первоначально присутствовавших в сухой смеси.

Детальное описание изобретения

Как обсуждено выше, для определения активности тромбина не вступившей в реакцию смеси тромбина и фибриногена, например, в форме порошка или неводной суспензии, такой как суспензия в этаноле, необходимо повторно гидратировать белки и солюбилизировать тромбин и фибриноген в гидратирующей среде для получения точного измерения активности тромбина. После вступления смеси в контакт с гидратирующей средой любой солюбилизированный тромбин и фибриноген вступит в реакцию для немедленного образования сгустка, и любой имеющийся тромбин свяжется со сгустком и не будет свободно доступен для его измерения.

В одном варианте осуществления активность фибриногена не вступившей в реакцию смеси временно ингибируется или обратимо ингибируется, посредством этого предотвращая образование сгустка фибрина до полной солюбилизации тромбина и фибриногена. Путем ингибирования активности тромбина можно избежать образования сгустка, и тромбин способен свободно растворяться в водной гидратирующей среде и остается доступным для измерения.

Временного или обратимого ингибирования активности тромбина можно достичь, например, регулированием щелочной среды тромбина. Например, это можно осуществить растворением или гидратацией не вступившей в реакцию смеси тромбина и фибриногена в ингибиторном или инактивирующем растворе, т.е. щелочном растворе, имеющем рН в диапазоне примерно от 8,5 до 11,5, предпочтительно, примерно от 9,5 до 10,5, а предпочтительнее, примерно 10, для формирования первого раствора. Максимальная извлеченная активность тромбина наблюдалась, когда щелочность инактивирующего раствора находилась на уровне рН 10. В пределах диапазона рН 9,5-10,5 было достигнуто, по меньшей мере, 80% максимальной извлеченной активности тромбина. При уровнях рН менее чем 9,5 и более чем 10,5 максимальная извлеченная активность тромбина снижалась по мере того, как уровень рН далее отклонялся от 10. При уровнях рН 9,25 и ниже доказательство образования сгустка наблюдалось во время гидратации и может объяснить сниженную максимальную извлеченную активность тромбина, которая наблюдается при более низких величинах рН, приближающихся к нейтральным условиям. В кислотных условиях, например рН 4 и 5, максимальная извлеченная активность тромбина была значительно меньше, чем активность, наблюдавшаяся при щелочных условиях, что может быть показателем необратимой инактивации тромбина.

Ингибиторный или инактивирующий раствор может представлять собой щелочной раствор или забуференный щелочной раствор, включая без ограничения раствор карбоната, TRIS основание, борат, глицин, фосфат, метиламин, 2-(циклогексиламино)этансульфоновую кислоту (CHES), 3-(циклогексиламино)-1-пропансульфоновую кислоту (CAPS) или 3-(циклогексиламино)-2-гидрокси-1-пропансульфоновую кислоту (CAPSO).

После того как тромбин и фибриноген становятся полностью солюбилизированными в ингибиторном или инактивирующем растворе, первый раствор или его часть может комбинироваться с известным количеством фибриногена во втором растворе, предпочтительно имеющем избыточное количество фибриногена, для формирования третьего раствора, в то же время поддерживая рН на уровне примерно от 8,5 до 11,5, предпочтительно, примерно от 9,5 до 10,5, а предпочтительнее, примерно 10. Используется избыток фибриногена так, чтобы количество тромбина в смеси представляло собой ограничивающий скорость реагент при образовании сгустка фибрина, для обеспечения того, чтобы активность тромбина коррелировалась со скоростью образования сгустка. Если бы фибриноген присутствовал не в избытке, то скорость свертывания зависела бы и от тромбина, и от фибриногена.

Затем активность тромбина может быть устранена, например, доведением рН третьего раствора до диапазона, в котором активность тромбина больше не ингибируется, т.е. примерно от 6,0 до менее чем 8,5, предпочтительно, примерно от 7,0 до менее чем 8,5, а предпочтительнее, примерно 7,5. Альтернативно, инактивирующий раствор, содержащий солюбилизированные белки или их часть, т.е. первый раствор, может комбинироваться с известным количеством фибриногена во втором растворе, предпочтительно, избыточным количеством фибриногена, для формирования третьего раствора, посредством чего одновременно устраняется ингибирование активности тромбина. Примеры второго раствора включают без ограничения буферные растворы TRIS-HCl, имидазол, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновую кислоту (HEPES), фосфат, барбитал, 4-морфолинпропансульфоновую кислоту (MOPS), 3-морфолин-2-гидроксипропансульфоновую кислоту (MOPSO), 1,4-пиперазиндиэтансульфоновую кислоту (PIPES), N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминэтансульфоновую кислоту (BES), цитрат или карбонат.

Объем и забуферивающая способность второго раствора должны быть достаточными для приведения к получению третьего раствора, имеющего рН примерно от 6,0 до менее чем 8,5, предпочтительно, примерно от 7,0 до менее чем 8,5, а предпочтительнее, примерно от 7,5, при добавлении к первому раствору. Например, соотношение между объемами между первым и вторым растворами обычно находится в диапазоне примерно от 1:1 до 1:20, а предпочтительно, примерно от 1:4 до 1:10, например, когда молярность второго раствора составляет примерно от 25 мМ до 500 мМ буфера TRIS-HCl, а предпочтительно, примерно от 100 мМ до 150 мМ буфера TRIS-HCl.

Активность тромбина можно определить анализатором свертывания с механическим устройством выявления граничной точки для выявления образования сгустка, таким как анализатор свертывания Diagnostica Stago ST4, или устройством, которое измеряет изменения мутности вследствие образования сгустка фибрина. Солюбилизированные белки в инактивирующем растворе могут комбинироваться со вторым раствором в одном из этих устройств, и можно измерить время до свертывания, которое может затем коррелироваться с величинами времени свертывания для известных уровней активности тромбина.

Другим способом, которым можно измерить активность тромбина, является использование хромогенной или флуорогенной пептидной подложки для тромбина. В этом способе солюбилизированный тромбин комбинируется с избытком хромогенной или флуорогенной подложки. Тромбин вызовет расщепление подложки, высвобождая хромофор или флуорофор, мониторинг которых можно осуществлять в спектрофотометре или флуориметре. Примеры хромогенных или флуорогенных подложек включают соответственно β-Ala-Gly-Arg-п-нитроанилиддиацетат и Z-Gly-Pro-Arg-AMC [Z = бензилоксикарбонил; АМС = 7-амино-4-метилкумарин]. Скорость высвобождения хромофора или флуорофора может коррелироваться с активностью тромбина.

В другом варианте осуществления функциональность фибриногена в не вступившей в реакцию смеси с тромбином можно измерить ингибированием активности тромбина регулированием щелочной среды тромбина. Например, это может быть осуществлено растворением или гидратацией смеси тромбина и фибриногена в ингибирующем или инактивирующем растворе, т.е. щелочном растворе, имеющем рН в диапазоне примерно от 8,5 до 11,5, предпочтительно, примерно от 9,5 до 10,5, а предпочтительнее, примерно 10, для формирования первого раствора. Ингибирующий или инактивирующий раствор может представлять собой щелочной раствор или забуференный щелочной раствор, включая без ограничения раствор карбоната, TRIS (Tris(гидроксиметил)аминометан)основание, борат, глицин, фосфат, метиламин, 2-(циклогексиламино)этансульфоновую кислоту (CHES), 3-(циклогексиламино)-1-пропансульфоновую кислоту (CAPS) или 3-(циклогексиламино)-2-гидрокси-1-пропансульфоновую кислоту (CAPSO). Дополнительно и необязательно, к ингибирующему или инактивирующему раствору или к первому раствору можно добавить ингибитор тромбина, такой как бивалирудин (Angiomax) для достижения максимального ингибирования активности тромбина, таким образом обеспечивая возможность солюбилизации большей части фибриногена для последующего тестирования. Другие ингибиторы тромбина включают антитромбин, гепарин, гепарин низкой молекулярной массы, аналоги гепарина низкой молекулярной массы, фондапаринукс, аргатробан, мелагатран, эфегатран, иногатран, дабигатран, гирудан и производные гирудана, такие как лепирудин и десирудин.

После того как активность тромбина была ингибирована, функциональность фибриногена можно определить комбинированием первого раствора или его части с известным количеством тромбина во втором растворе, предпочтительно содержащем избыточное количество тромбина, для формирования третьего раствора, в то же время поддерживая рН на уровне примерно от 8,5 до 11,5, предпочтительно, примерно от 9,5 до 10,5 и предпочтительнее, примерно 10. Используется избыток тромбина с тем, чтобы количество фибриногена в смеси представляло собой ограничивающий скорость реагент при образовании сгустка фибрина для обеспечения того, чтобы концентрация фибриногена высоко коррелировалась со скоростью образования сгустка. Если бы не было избытка тромбина, то скорость свертывания зависела бы и от тромбина, и от фибриногена.

Затем активность тромбина может быть устранена, например, доведением рН третьего раствора до диапазона, в котором активность тромбина больше не ингибируется, т.е. примерно от 6,0 до менее чем 8,5, предпочтительно, примерно от 7,0 до менее чем 8,5, а предпочтительнее, примерно 7,5. Альтернативно, инактивирующий раствор, содержащий солюбилизированные белки или их часть, т.е. первый раствор, может комбинироваться с известным количеством тромбина во втором растворе, предпочтительно, избыточным количеством тромбина, для формирования третьего раствора, посредством чего одновременно устраняется ингибирование активности тромбина. Примеры второго раствора включают без ограничения буферные растворы TRIS-HCl, имидазол, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновую кислоту (HEPES), фосфат, барбитал, 4-морфолинпропансульфоновую кислоту (MOPS), 3-морфолин-2-гидроксипропансульфоновую кислоту (MOPSO), 1,4-пиперазиндиэтансульфоновую кислоту (PIPES), N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминэтансульфонвую кислоту (BES), цитрат или карбонат при рН примерно 7,5.

Функциональность фибриногена можно определить, используя анализатор свертывания с механическим устройством выявления граничной точки для выявления образования сгустка, таким как анализатор свертывания Diagnostica Stago ST4, или устройством, которое измеряет изменения мутности вследствие образования сгустка фибрина. Солюбилизированные белки в инактивирующем растворе могут комбинироваться со вторым раствором в одном из этих устройств, и можно измерить время до свертывания, которое может затем коррелироваться с величинами времени свертывания для известных уровней функциональности фибриногена.

Альтернативно, функциональность фибриногена можно определить ингибированием активности тромбина с использованием ингибитора тромбина, такого как бивалирудин (Angiomax). Необязательно, щелочную среду тромбина можно регулировать в комбинации с использованием ингибитора тромбина. Другие примеры ингибиторов тромбина включают антитромбин, гепарин, гепарин низкой молекулярной массы, аналоги гепарина низкой молекулярной массы, фондапаринукс, аргатробан, мелагатран, эфегатран, иногатран, дабигатран, гирудан и производные гирудана, такие как лепирудин и десирудин. После того как активность тромбина была ингибирована, функциональность фибриногена можно определить использованием подобного тромбину фермента, который способен действовать на фибриноген для образования сгустка, но не подвергается воздействию ингибитора тромбина. Примеры подобных тромбину ферментов включают без ограничения батроксобин (полученный из яда южноамериканской гремучей змеи Bothrops atrox) и анкрод (полученный из яда Calloselasma rhodostoma.).

В случае когда белки находятся в не вступившей в реакцию смеси и загружены, например, на носитель, подложку или медицинское устройство, смесь может быть представлена в форме порошка, где белки являются сухими или высушенными, удаление белков перед регидратацией и солюбилизацией может выполняться экстрагированием белков с использованием неводной жидкости, включая без ограничения перфорированные углеводороды, такие как HFE-7000, HFE7001, HFE7003, HFE-7300 и PF-5060 (имеющиеся в продаже от компании 3М of Minnesota), и может использоваться любая другая жидкость-носитель, в которой не растворяются белки, такая как спирты, простые эфиры или другие органические жидкости. После того как белки были экстрагированы с использованием неводного растворителя, активность тромбина или функциональность фибриногена можно измерить, как описано выше.

Альтернативно, когда белки загружены на носитель, подложку или медицинское устройство, активность тромбина или функциональность фибриногена можно определить, как описано выше, без удаления белков. Например, белки могут гидратироваться помещением носителя, подложки или медицинского устройства, имеющих на них белки, непосредственно в ингибирующий или инактивирующий раствор, пробы которого можно брать для тестирования на активность тромбина или функциональность фибриногена, как описано выше.