Питательная среда для культивирования лактобактерий

Изобретение относится к микробиологии и сельскому хозяйству, а конкретно к способу культивированию микроорганизмов на основе молочнокислых бактерий для получения пробиотической добавки с целью повышения мясной продуктивности перепелов.

Современное птицеводство многими путями решает проблему максимальной реализации биоресурсного потенциала птицы и сохранения при этом ее продуктивного здоровья. Ускорение динамики роста и повышение суточных приростов живой массы птицы при снижении экономических затрат на 1 кг прироста живой массы тела является одной из основных задач птицеводства, в частности, перепеловодства.

Известно использование для выращивания микробной культуры мелассной среды в составе на 1 л воды: 45 г свекловичной, мелассы, 2 г КН₂РО₄, 0,02 г дрожжевого экстракта (Патент РФ №243864, МПК C05F 3/00, А01С 3/00, C05F 11/08, 27.12., 2011 г.).

Известен способ предусматривающий применение в составе комбикормов для перепелов пробиотической кормовой добавки, включающей три вида молочнокислых бактерий: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus B-5788, Lactobacillus acidophilus B-3235, Lactococcus lactis ssp. lactis B-3145, выращенных на среде, состоящей из воды, мелассы свекловичной, молока или молочной сыворотки, которая обеспечивает повышение сохранности и продуктивности перепелов (Кобыляцкая Г.В. Получение и эффективность применения пробиотика Трилактобакт в перепеловодстве: автореф. дис. … канд. с.-х. наук / Г.В. Кобыляцкая. - Краснодар, 2013. - 24 с.).

Недостатком данного способа является то, что в состав пробиотика входят микроорганизмы, которые не являются естественными представителями микробиома желудочно-кишечного тракта перепелов, а используемая питательная среда позволяет достичь титра каждой культуры всего лишь 5,0×10⁷ КОЕ/мл, в результате добавка не будет обеспечивать максимальную реализацию биологического потенциала птицы.

Наиболее близким является техническое решение в котором используют для получения пробиотической добавки для перепелов, среду состоящую из мелассы кормовой, К₂НРO₄, дрожжевого экстракта и воды (Интенсификация процесса культивирования физиологически- адаптированных штаммов лактобацилл как основа создания биопрепаратов микробного происхождения для птицеводства / А.Г. Кощаев, Ю.А. Лысенко, Мищенко В.А. [и др.] // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2017. - №04 (128). - С.1102-1115).

Недостатком известного технического решения является то, что недостаточное повышение титра молочнокислых культур Lactobacillus agilis.

Техническим результатом является повышение титра молочнокислых культур Lactobacillus agilis, являющиеся представителями естественной микрофлоры ЖКТ перепелов, за счет использования мелассной питательной среды.

Технический результат достигается тем, что в питательной среде для культивирования лактобактерий, состоящей из мелассы кормовой, К₂НРO₄, дрожжевого экстракта и воды, согласно изобретению меласса кормовая состоит из свекловичной и кукурузной меласс, взятых в равных частях и микроорганизмов Lactobacillus agilis с титром не менее 1,0×10⁵ КОЕ/мл при следующем соотношении исходных компонентов, г/л:

Меласса свекловичная - 22-23;

Меласса кукурузная - 22-23;

К₂НРО₄ - 2,0;

Дрожжевой экстракт - 0,02;

Микроорганизмы Lactobacillus agilis

с титром не менее 1,0×10⁵ КОЕ/мл - 99-101;

Вода - остальное

Новизна заявляемого технического решения обусловлена тем, что используется среда из свекловичной и кукурузной меласс, взятых в равных частях, для выращивания молочнокислых микроорганизмов - Lactobacillus agilis, которые независимыми микробиологическим методом, методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и метагеномными методами были выделены из ЖКТ перепелов (Идентификация штаммов автохтонной микрофлоры - основы биопрепаратов лечебно-профилактического действия / В.В. Радченко, Е.В. Ильницкая, А.С. Родионова, Т.М. Шуваева, Ю.А. Лысенко, Г.А. Плутахин, А.И. Манолов, И.М. Донник, А.Г. Кощаев // Биофармацевтический журнал. - 2016. Том. - 8, №1. - С. 3-12; Метагеномное профилирование бактериозеноза пищеварительного тракта различных линий перепелов / Е.Р. Кириллова, Т.В. Григорьева, М.Н. Синягина и др. // Материалы всероссийской конференции с международным участием, посвященная 40-летию кафедры генетики Института фундаментальной медицины и биологии Казанского университета. - Казань. - 2016. - С. 55-56; Автохтонная микрофлора дикой птицы - основа препаратов лечебно-профилактического действия для промышленной птицы / А.С. Родионова, Е.В. Ильницкая, В.В. Радченко, А.В. Лихоман, Ю.А. Лысенко, А.Г. Кощаев // XXVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Сборник тезисов. - М.: ФАНО России, 2016. - С. 151).

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию «новизна».

Соответствие заявляемого решения критерию патентоспособности «промышленная применимость» обусловлено тем, что предлагаемое техническое решение работоспособно и возможно его использование для выращивания перепелов.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на рис. 1 - представлен график зависимости количества микроорганизмов от состава мелассной среды; на рис. 2 - представлен график зависимости количества редуцирующих веществ от времени культивирования микроорганизмов на мелассной среде №3; на рис. 3 - представлен график зависимости количества микроорганизмов от состава питательных сред; на рис. 4 - представлен график зависимости количества микроорганизмов от времени их культивирования при температуре 36°С; на рис. 5 - представлен график зависимости количества микроорганизмов от времени их культивирования при ратуре 38°С.

Питательная среда для культивирования лактобактерий воспроизводится следующим образом.

Культивирование микроорганизмов Lactobacillus agilis осуществляют в среде, состоящей из мелассы кормовой 45,0 г, которая состоит из свекловичной и кукурузной меласс взятых в равных частях, К₂НРO₄ - 2,0 г и дрожжевого экстракта - 0,02 г в расчете на 1 литр воды. Затем в полученную смесь добавляют микроорганизмы Lactobacillus agilis с титром не менее 1,0×10⁵ КОЕ/мл в количестве 100,0 г/л и культивируют при температуре 37°С, в течение 24 ч.

При использовании засевной культуры Lactobacillus agilis в количестве менее 100,0 г/л, не будет обеспечиваться достижение необходимого титра культуры в пробиотической добавке.

При использовании засевной культуры Lactobacillus agilis в количестве более 100,0 г/л достигается тот же титр и не имеет смысла брать большее количество.

При использовании свекловичной мелассы в количестве менее 22,5 г/л, не будет обеспечиваться достижение необходимого титра культуры в пробиотической добавке.

При использовании свекловичной мелассы в количестве более 22,5 г/л достигается тот же титр и не имеет смысла брать большее количество.

При использовании кукурузной мелассы в количестве менее 22,5 г/л, не будет обеспечиваться достижение необходимого титра культуры в пробиотической добавке.

При использовании кукурузной мелассы в количестве более 22,5 г/л достигается тот же титр и не имеет смысла брать большее количество.

Первый этап исследований включает выращивание бактерий на мелассной питательной среде различного состава. Время выращивания культуры составляло 48 ч, температурный оптимум 37°С.

Поскольку основным компонентом в среде является состав мелассы, то для подбора питательного субстрата для Lactobacillus agilis использовали мелассную питательную среду следующих составов:

1. Состав мелассной среды №1: 45 г/л мелассы кормовой (100% свекловичной мелассы), К₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л.

2. Состав мелассной среды №2: 45 г/л мелассы кормовой (100% кукурузной мелассы), К₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л.

3. Состав мелассной среды №3: 45 г/л мелассы кормовой (50% свекловичной и 50% кукурузной мелассы), К₂НРO₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л.

4. Состав мелассной среды №4: 45 г/л мелассы кормовой (25% свекловичной и 75% кукурузной мелассы), К₂НРO₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л.

5. Состав мелассной среды №5: 45 г/л мелассы кормовой (75% свекловичной и 25% кукурузной мелассы), К₂НРO₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л.

Определение титра микрофлоры проводили согласно ГОСТу 10444.11-89 (пункт 4.2.2). Брали 1,0 мл выращенной каждой культуры и помещали в колбу объемом 100 см³ и заливали 99,0 мл стерильным физиологическим растворов, оставляли на 1 ч. При этом получали разведение 1:100. После этого готовили ряд последовательных десятикратных разведений до 10^-10. Для каждого разведения применяли отдельные стерильные наконечники. Посев в чашки Петри проводили согласно (на Лактобакагар из разведений 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10. Из разведений 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10 стерильным наконечником автоматического дозатора по 1 мл суспензии переносили в 4 чашки Петри, в которые заливают стерильную, расплавленную питательную среду, охлажденную до 38-40°С. Круговым движением чашек Петри в них перемешивали среду и оставляют до застывания агара. Чашки с засеянными средами помещали в термостат и выдерживали при (37±1)°С в течении 72 ч. По количеству выросших колоний согласно (ГОСТ 9225-84 (пункт 4.5.3) определяли общий титр микроорганизмов. Число жизнеспособных клеток в 1 мл препарата (X), вычисляли по формуле:

X=N×P,

где: N - среднеарифметическое значение числа колоний в чашках Петри; Р - порядковый номер десятикратного разведения, в котором отмечается рост бактерий.

В процессе культивирования проводился анализ динамики потребления редуцирующих веществ (РВ) с исходной концентрацией 4%. Метод определения редуцирующих веществ основан на восстанавливающей способности моноформ сахаров - глюкозы и фруктозы.

Результаты по количеству исследуемых микробных культур, полученные в лабораторных условиях при культивировании в мелассной среде, представлены на рисунке 1, где по оси абсцисс указаны номера составов мелассной среды, а по оси ординат - количество микроорганизмов.

В результате проведенного исследования наиболее эффективной оказалась мелассная среда №3, где в качестве кормовой мелассы использовалось 50% свекловичной и 50% кукурузной мелассы, титр Lb. agilis составил 3,3×10¹⁰ КОЕ/мл, в то время как на других вариантах титр используемых культур не превысил 1,0×10⁹ КОЕ/мл. Так на мелассной питательной среде №1 количество Lb. agilis составило 2,1×10⁹ КОЕ/мл; на варианте №2 Lb. agilis - 6,7×10⁹ КОЕ/мл; вариант №4 Lb. agilis - 9,0×10⁹ КОЕ/мл и вариант №5 Lb. agilis - 6,3×10⁹ КОЕ/мл.

Также в процессе культивирования снимали динамику потребления редуцирующих веществ (РВ) на мелассной среде №3, результаты которой представлены на рисунке 2, где по оси абсцисс указано время культивирования микроорганизмов, а по оси ординат - количество редуцирующих веществ.

По результатам контроля потребления углеродного субстрата можно сделать вывод о его истощении уже к 24 ч от начала культивирования.

Следующим этапом исследований являлось определение влияния на рост используемых культур различных питательных сред, которые часто используют для культивирования лактобактерий. Время выращивания для всех культур составляло 48 ч, температурный оптимум 37°С.

Для доказательства эффективности заявляемой среды для сравнения были использованы среды следующего состава:

1. Среда для молочнокислых бактерий (г. Углич): дрожжевой экстракт - 0,2%; кукурузный экстракт - 0,3%; глюкозный сироп - 2%; аскорбиновая кислота (цитрат натрия) - 4 г/л; КН₂РO₄ - 2 г/л.

2. Состав среды МРС, г/л: пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 20,0; глюкоза - 20,0; дикалия гидрофосфат - 2,0; натрия ацетат - 5,0; триаммония цитрат - 2,0; магния сульфат - 0,2; марганца сульфат 4-водный - 0,05.

3. Состав среды ГПС, г/л: Na₂HPO₄ 12-водный - 3,2; КН₂РO₄ - 0,3; MgSO₄ - 0,5; NaCl - 0,5; пептон - 2,0; дрожжевой экстракт - 0,05; глюкоза - 25.

4. Состав мелассной среды: 45 г/л мелассы кормовой (50% свекловичной и 50% кукурузной мелассы), К₂НРO₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л.

Результаты по количеству исследуемых микробных культур, полученные в лабораторных условиях при культивировании в различных питательных средах, представлены на рисунке 3, где по оси абсцисс указаны различные питательные среды, а по оси ординат - количество микроорганизмов.

В результате проведенного исследования наиболее эффективной оказалась мелассная среда, так как титр Lb. agilis составил 4,7×10¹⁰ КОЕ/мл. Менее эффективной оказалась среда для молочнокислых бактерий г. Углич - Lb. agilis - 8,7×10⁹ КОЕ/мл. При выращивании лактобактерий на среде ГПС были получены следующие результаты: Lb. agilis - 2,7×10⁹ КОЕ/мл, а на МРС: Lb. agilis - 2,0×10⁹ КОЕ/мл.

Далее определяли оптимальную температуру культивирования испытуемых микроорганизмов с целью повышения титра клеток в наиболее короткие сроки. Представленные выше результаты культивирования получены при температуре выращивания 37°С.

Была заложена серия опытов по определению максимальной термотолерантности данных культур при выращивании на мелассной среде №3 в течение 48 ч. Результаты зависимости количества клеток молочнокислых бацилл от температуры представлены на рисунках 4 и 5, где по оси абсцисс указано время культивирования микроорганизмов, а по оси ординат - количество микроорганизмов.

Итог культивирования при 39°С не представлен, так как при этой температуре ни одна культура не выявила роста относительно засевного титра. Однако после снижения температуры культивирования до 37°С рост восстановился в прежнем объеме, что свидетельствует о том, что культура не отмерла, а перешла в фазу задержки роста, продолжавшуюся до снижения температуры на 2-3°С.

На основании приведенных результатов культивирования на различных средах и при различных температурах установлено, что наибольший титр клеток достигался к 24 ч от начала выращивания независимо от состава сред. Более длительное выращивание и повышение температуры ведет к снижению титра и, как правило, увеличению количества нежизнеспособных клеток.

Результаты проведенных исследований показали, что наиболее эффективной питательной средой является мелассная среда следующего состава: 45 г/л мелассы кормовой (50% свекловичной и 50% кукурузной мелассы), К₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, при этом оптимум температурного и временного режимов составляют 37°С и 24 ч, соответственно. Разработанная мелассная среда может быть использована в производственных условиях при дальнейшей разработки биопрепаратов для животноводства, в том числе птицеводства.

Для доказательства эффективности полученной пробиотической добавки на основе микроорганизмов Lactobacillus agilis были проведены научные исследования на перепелах японской породы.

Методом групп аналогов было сформировано пять групп перепелов по 20 голов в каждой: контрольная группа - в рационе присутствовал только основной полноценный комбикорм и питьевая вода; 1-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,2 мл/гол; 2-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,5 мл/гол; 3-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 1,0 мл/гол. Применение пробиотической добавки в опытных группах осуществлялось ежедневно (таблица 1).

Перепела выращивались в полупромышленных многоярусных металлических клетках.

Результаты хозяйственных показателей при выращивании перепелов представлены в таблице 2.

Результаты хозяйственных показателей при выращивании перепелов представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы, значительное повышение по живой массе перепелов в сравнении с группой контроля было выявлено на 21-е сутки во 2-й и 3-й опытных группах, соответственно, на 7,80 и 7,16%. На 28-е сутки во 2-й опытной группе живая масса перепелов была больше, чем в контроле на 13,46%, а в 3-й - на 14,21%. На 35-й день выращивания птицы значительное повышение живой массы наблюдалось во 2-й и 3-й опытных группах на 10,60 и 10,83%. Аналогичная тенденция в этих опытных группах по изучаемому показателю наблюдалась на 42-е сутки, в которой живая масса была выше на 9,12 и 9,75%. Необходимо отметить, что в 1-й опытной группе наблюдалось незначительное повышение живой массы за весь период выращивания.

Сохранность перепелов во всех группах была одинакова и составила 100,0%. Прирост живой массы перепелов за весь период выращивания в опытных группах также был больше, чем в контрольной на 2,91; 9,45 и 10,10%.

Как видно из данных таблицы 2, с ростом живой массы опытных птиц повышается и потребление ими комбикормов. При этом затраты корма на 1 кг прироста живой массы в опытных группах оставались ниже, чем в контрольной на 2,01; 7,79; и 6,78%.

В целом, обосновать повышенную динамику живой массы перепелов в опытных группах, можно за счет положительного воздействия биопрепаратов на основе культур Lactobacillus agilis, которые способствуют лучшему усвоению энергии и питательных веществ комбикорма птицей.

Таким образом, результаты испытаний показали, что выращивание перепелов с использованием разработанной пробиотической добавки на основе культуры вида Lactobacillus agilis, выделенная из ЖКТ перепела, а также выращенная на мелассной среде, в испытуемых дозах обеспечивает повышение продуктивности перепелов, что особенно выявлено в дозе 0,5 мл/гол.