Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития ишемического инсульта у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья.

Ишемический инсульт – это клинический синдром, характеризующийся быстро возникшими клиническими жалобами и/или симптомами утраты очаговых и общемозговых функций, длящимися дольше 24 часов или приводящими к смерти [Хронические сосудистые заболевания головного мозга [Текст] / А.С. Кадыков, Л.С. Манвелов [и др.] // М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2013. – 232 с.]. В настоящее время инсульт занимает первые позиции по заболеваемости, инвалидизации и смертности, поэтому исследование молекулярно-генетических механизмов предрасположения к данному заболеванию остается актуальной проблемой современной генетики человека. Установлено, что инсульт – это этиологически гетерогенное заболевание, возникающее в результате взаимодействия внешнесредовых и генетических факторов [Факторы риска, первичная и вторичная профилактика острых нарушений мозгового кровообращения [Текст] / Л.А. Цукурова, Ю.А. Бурса // Российский медицинский журнал, 2012. – №10. – С. 494-499]. В крупномасштабных эпидемиологических исследованиях выявлено, что чрезмерное употребление алкоголя является серьезным фактором риска развития инсульта. Этанол ухудшает регуляцию нейрогенеза, индуцирует возникновение воспалительных процессов в головном мозге, снижает способность клеток и тканей мозга к репарации [New insights on neurobiological mechanisms underlying alcohol addiction [Text] / C. Cui, A. Noronha, H. Morikawa [et al.] // Neuropharmacology, 2013. – Vol. 67. – Р. 223-232].

Наряду со средовыми факторами риска, идентифицированы гены-кандидаты, ассоциированные с восприимчивостью к инсульту, среди которых важное значение имеют гены цитокинов [Insulin-like growth factor I serum levels influence ischemic stroke outcome [Text] / A. De Smedt, R. Brouns, M. Uyttenboogaart [et al.] // Stroke, 2011. – Vol. 42, №8. – Р. 2180-2185]. Цитокины продуцируются нейронами, микроглией, макрофагами, моноцитами, и отвечают за модуляцию размера ишемического повреждения при инсульте [Polymorphisms of IGFI contribute to the development of ischemic stroke [Text] / H.J. Kim, S.K. Kim, H.J. Park [et al.] // Exp Ther Med., 2012. – Vol. 3, №1. – Р. 93-98].

Фактор некроза опухоли альфа (TNFα) – провоспалительный цитокин с молекулярной массой 17 кДа, в состав которого входят 157 аминокислотных остатков [The TNF Superfamily: Methods and Protocols [Text] / B. Jagadeesh // Springer, Berlin; Springer New York; Humana Press. – 2016. – 240 P.]. Установлено, что TNFα выступает в качестве вазоактивного медиатора – ингибирует синтез NO эндотелиоцитами, вызывает вазоконстрикцию сосудов и повышение артериального давления [Tumоr nесrоsis fасtоr-α rеduсеs аrgininоsuссinаtе synthаsе ехрrеssiоn аnd nitriс охidе рrоduсtiоn in аоrtiс еndоthеliаl сеlls [Tехt] / B.L. Gооdwin, L.С. Реndlеtоn, M.M. Lеvy [еt аl.] // Аm. J. Рhysiоl. Hеаrt Сirс. Рhysiоl. – 2007. – Vоl. 293, № 2. – Р. 1115-1121].

Ген, кодирующий TNFα, расположен на коротком плече шестой хромосомы, в области главного комплекса гистосовместимости HLA (6р21.1-6р21.3). При изучении греческой и мексиканской популяций показано, что полиморфизм rs1800629 TNFα вовлечен в формирование таких сердечно-сосудистых заболеваний, как ишемическая болезнь сердца и инфаркт миокарда [Inflammatory cytokine gene variants in coronary artery disease patients in Greece [Text] / A. Manginas, A. Tsiavou, A. Chaidaroglou [еt аl.] // Artery Dis. – 2008. – №19. – Р. 575-582].

Лимфотоксин альфа (Ltα, TNFβ) – плейотропный цитокин, гомологичный по структуре и функциям TNFα, участвующий в процессах сосудистого воспаления, поддержания Т-клеточного гомеостаза и отвечающий за иммуномодуляцию, пролиферацию и дифференцировку клеток [Ассоциация генов TNF и Ltα с осложнениями атеросклероза у больных, перенесших обострение ишемической болезни сердца [Текст] / Д.А. Затейщиков, А.А. Пушков, А.Г. Никитин [и др.] // Клиническая практика. – 2013. – №1 (13). – С. 4-11]. Цитогенетическое расположение гена, кодирующего Ltα – 6р21.1-6р21.3. Установлено, что замена аллеля А на G по локусу rs909253 Ltα приводит к повышению экспрессии соответствующего гена. Исследования показали, что полиморфизм rs909253 Ltα ассоциирован с развитием осложнений гипертонической болезни [Tumor necrosis factor beta NcoI polymorphism (rs909253) is associated with inflammatory and metabolic markers in acute ischemic stroke [Text] / J. de Sousa Parreira, A.P. Kallaur, M.F. Lehmann [еt аl.] // Metab Brain Dis. – 2015. – Vol. 30 (1). – Р. 169].

В Российской Федерации исследования вовлеченности генов цитокинов в формирование предрасположенности к ишемическому инсульту единичны и фрагментарны, а данные о роли генетических вариантов rs909253 Ltα, rs1800629 TNFα и злоупотребления алкоголем в развитии ишемического инсульта отсутствуют.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ишемического инсульта на основе данных о сочетаниях генетических полиморфизмов rs909253 Ltα, rs1800629 TNFα и злоупотребления алкоголем.

Из области техники известен способ прогнозирования развития острого ишемического инсульта по патенту РФ №2012134988 от 20.02.2014. Способ включает учет показателей ферментов антиокислительной защиты в периферической крови, при этом в качестве ферментов антиокислительной защиты определяют каталазу, пероксидазу и показатель перекисного окисления липидов. При увеличении показателей пероксидазы и перекисной резистентности эритроцитов и снижении показателя каталазы более, чем на 70% от референтных значений, судят о высоком риске развития ишемического инсульта. Однако данный способ не является достаточно информативным, так как не включает генетические маркеры и применим только на клиническом этапе, что исключает раннюю диагностику и проведение профилактических мероприятий по предотвращению развития инсульта.

За прототип выбран патент РФ № 2422523 от 22.04.2010 «Аллель SNP41 гена PDE4D, его применение для прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции, применение молекулярно-генетического маркера индивидуальной предрасположенности к инсульту и способ прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту». Способ включает анализ полиморфизма гена PDE4D на наличие аллеля А SNP41 и в случае выявления наличия указанного аллельного варианта прогноз предрасположенности к инсульту в русской популяции. Изобретение позволяет диагностировать предрасположенность к инсульту в русской популяции и своевременно назначать соответствующие медикаменты. Недостатками указанного способа являются использование в качестве маркера только одного генетического полиморфизма, что снижает статистическую мощность проведенного исследования; а также то, что при прогнозировании риска развития инсульта не используются средовые факторы риска.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования развития ишемического инсульта на основе комбинации генов цитокинов при условии злоупотребления алкоголем.

Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития ишемического инсульта у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья на основе данных о сочетаниях генетических вариантов локусов rs909253 Ltα, rs1800629 TNFα при условии злоупотребления алкоголем.

Способ прогнозирования развития ишемического инсульта в русской популяции, включающий

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизмов генов,

содержит следующие новые признаки:

- проводят анализ полиморфизмов генов цитокинов rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα;

- устанавливают наличие средовых факторов риска развития ишемического инсульта, а именно – выявление злоупотребления алкоголем;

- прогнозируют высокий риск развития ишемического инсульта у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья при выявлении сочетания генотипа АА rs909253 Ltα с генотипом GG rs1800629 TNFα при условии злоупотребления алкоголем.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития ишемического инсульта по наличию сочетания генетических вариантов полиморфных маркеров цитокинов rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα и злоупотребления алкоголем.

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl₂, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20^°С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Анализ полиморфизма гена rs909253 Ltα проводят методом ПЦР-синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин. при t=54°С; денатурация – 15 сек при t=95°С. При проведении ПЦР в амплификаторе (CFX96) с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs909253 Ltα зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю А, зонд с красителем FAM – аллелю G (фиг.1).

Для исследования полиморфизма rs1800629 TNFα используют наборы 2,5х реакционной смеси для проведения ПЦР-РВ в объеме 25 мкл на 1 образец, включающие 2,5х реакционную смесь (2,5х ПЦР буфер: (KСl, ТрисHСl (рH 8,8), 6,25 мМ MgСl₂), SynTаq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Twееn 20) в объеме 10мкл, 25мМ MgСl₂ в объеме 1,5 мкл, ddH₂О (деионизированная вода), по 10 пкмоль каждого праймера и по 5 пкмоль каждого зонда. При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе CFX96) генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs1800629 TNFα зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM – аллелю A (фиг.2).

Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров [Hulkkonen J., 2002; Mirjam M. de Jong et al., 2003].

Изобретение характеризуется фигурами.

Фиг. 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма Ltα (rs909253): - GG, - АА, - AG, ■ - отрицательный контроль.

Фиг. 2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма TNFα (rs1800629): - АА, - GG, - GA, ■ - отрицательный контроль.

Фиг. 3. Диаграмма взаимодействий локусов цитокинов и злоупотребления алкоголем (ALK) в трехфакторной модели при формировании инсульта, полученная методом GMDR с коррекцией на коварианты, где столбики слева соответствуют группе больных, столбики справа соответствуют контрольной группе.

Генотипирование полиморфизмов rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα осуществляют методом детекции TagMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени.

Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов и злоупотребления алкоголем с ишемическим инсультом проводят с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/) (фиг. 3). В основе использованных методов лежит общий принцип выявления переменной, содержащей информацию о нескольких локусах, и формирование кластеров, содержащих комбинации генотипов высокого и низкого риска развития изучаемой патологии.

Возможность использования предложенного способа для оценки риска возникновения и развития ишемического инсульта подтверждает анализ результатов наблюдений 303 пациентов с инсультом и 527 индивидуумов контрольной группы. Общий объем исследуемой выборки составил 830 человек. Средний возраст пациентов с инсультом составил 59,58±8,21 лет, а средний возраст представителей контрольной группы – 58,81±7,74 лет. В группе больных с инсультом оказались 201 мужчина и 102 женщины, а в контрольной группе – 322 мужчины и 205 женщин. В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Группа больных с инсультом и контрольная группа полностью сопоставимы по возрасту, полу, месту рождения и национальности.

Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводили на базе неврологического и кардиологического отделений Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, с информированного согласия пациентов на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, проводимых за период госпитализации и после нее для научно-исследовательских целей. В работе использовалась анкета-опросник, включающая антропометрические, социально-демографические показатели, а также сведения о наличии у респондентов средовых факторов риска цереброваскулярных заболеваний, таких как курение, злоупотребление алкоголем, низкий уровень физической активности, особенности питания, стрессовые ситуации [Полоников, А.В. Промоторный полиморфизм -1293G>C гена CУР2E1 увеличивает риcк развития гипертоничеcкой болезни у мужчин, злоупотребляющих алкоголем [Текcт] / А.В. Полоников, В.П. Иванов, М.А. Cолодилова // Бюллетень экcпериментальной биологии и медицины. – 2013. – Т. 155, № 6. – C. 695-698]. Пациентов, употребляющих алкогольные напитки несколько раз в неделю и чаще, относили в группу с высоким употреблением алкоголя (что соответствует ≥40 г этанола в день для мужчин и ≥20 г этанола в день для женщин). Пациенты, не употребляющие или употребляющие алкогольные напитки не чаще 1 раза в неделю, относились в группу с умеренным/низким употреблением алкоголя. Полученные материалы протоколировали по стандартам этического комитета Российской Федерации.

Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов цитокинов и статуса употребления алкоголя с ишемическим инсультом проводили с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/), с коррекцией на индекс массы тела, уровни холестерина, триглицеридов, липопротеидов низкой плотности, липопротеидов высокой плотности, низкую физическую активность, предпочтение к жирной пище, редкое употребление овощей и фруктов. Для валидации полученных результатов проводили пермутационный тест – выполнено 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивает р_perm<0,001

Установлены особенности «конституции» больных с ишемическим инсультом на основе комбинаций генов цитокинов и злоупотребления алкоголем. Выявлена модель генно-средовых взаимодействий полиморфизмов rs909253 Ltα, rs1800629 TNFα и злоупотребления алкоголем, ассоциированная с высоким риском развития ишемического инсульта: воспроизводимость модели (CVC) составила 100%, точность предсказания модели (Test.Bal.Acc.=53,72), отношение шансов OR=2,56 (95% CI 1,42-4,61) при уровне значимости р=0,01 (р_реrm<0,001). В рамках данной модели выявлена комбинация, являющаяся фактором риска развития ишемического инсульта: сочетание генотипа АА rs909253 Ltα с генотипом GG rs1800629 TNFα и злоупотреблением алкоголем наблюдается у 6,93% пациентов с инсультом и у 1,52% индивидуумов контрольной группы (Х²=15,15, р=0,001). Наличие данного сочетания генотипов со злоупотреблением алкоголем является фактором риска развития ишемического инсульта (ОR=4,83, 95% СI 2,01-12,03) независимо от влияния прочих средовых факторов.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование добровольцев русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья и не являющихся родственниками между собой: определен статус злоупотребления алкоголем и проведено генетическое обследование по локусам rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα.

Пример 1. У пациента П. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров было выявлено, что генотип мужчины по локусу rs909253 Ltα – АА, генотип по локусу rs1800629 TNFα – GG. При анкетировании установлено, что пациент П. употребляет крепкие спиртные напитки 2-3 раза в неделю (что соответствует злоупотреблению алкоголем). Сочетание генотипа АА rs909253 Ltα, генотипа GG rs1800629 TNFα и злоупотребление алкоголем позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития ишемического инсульта. Дальнейшее наблюдение и результаты ультразвукового дуплексного сканирования (УЗДС) выявили у пациента окклюзивное заболевание сонных артерий, а именно, нарушение мозгового кровоснабжения, что подтвердило высокий риск развития инсульта по ишемическому типу.

Пример 2. У пациентки С. произведен забор венозной крови, при генотипировании ДНК-маркеров выявлено, что ее генотип по локусу rs909253 Ltα – GG, генотип по локусу rs1800629 TNFα – GG. При анкетировании установлено, что пациентка С. Употребляет алкоголь не чаще одного раза в месяц. По данным генотипирования и отрицательному статусу злоупотребления алкоголем пациентка С. не включается в группу больных с высоким риском развития инсульта. При дальнейшем наблюдении не было зафиксировано нарушений мозгового кровообращения.

Пример 3. У пациента Е. после забора венозной крови из локтевой вены и последующего генотипирования выявлен генотип GG по локусу rs909253 Ltα и генотип АА по локусу rs1800629 TNFα. При анкетировании установлено, что пациент Е. употребляет более 40 грамм алкоголя в сутки (что соответствует злоупотреблению алкоголем). По данным генотипирования пациент Е. не включается в группу больных с высоким риском развития ишемического инсульта. Дальнейшее обследование и результаты компьютерной томографии показали, что мозговое кровообращение пациента Е. соответствует норме.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди индивидуумов группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития ишемического инсульта.