СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ФОРМ ХИТОЗАНА

Изобретение относится к области получения водорастворимых форм хитозана и касается синтеза солевых форм хитозана с различными неорганическими, органическими кислотами и водорастворимых производных хитозана в результате его реакции с ангидридами карбоновых кислот, которые могут быть использованы в медицине, в качестве биологически активной добавки к пище, в ветеринарии и косметике.

Известны способы получения солевых форм хитозана на основе минеральных и органических кислот для использования в косметике, медицине и пищевой отрасли [авт. свид. 419529. С 08 В 37/00. 15.03.74; патенты Японии 1152104 А, С 08 В 37/08, 14.06.89 и 1062302 А, С 08 В 37/08, 08.03.89; патент США 5061792, С 08 В 37/08, 29.10.91] и способы получения ацилированных водорастворимых производных хитозана путем его взаимодействия с ангидридами органических кислот [патент РФ 2100373. С 08 В 37/08. Бюл. 36 от 27.12.97; авт. свид. 508212, С 08 В 37/08, Бюл. 11 от 25.03.76].

Ближайшим известным решением является способ получения натриевой соли сукцината хитозана [патент РФ 2144040 С 08 В 37/08. 07.04.98], характеризующийся эффективностью и экологической чистотой без использования органических растворителей и применением кислоторастворимого хитозана со степенью деацетилирования (СД) 76% (в диапазоне 74-82%) и средневязкостной молекулярной массой (ММ) 550 кДa (в диапазоне 26-650 кДа) с относительно узким молекулярно-массовым распределением (ММР).

Известно, что биологическая активность хитозана, его бактериостатические, иммуностимулирующие и другие свойства существенно зависят от молекулярных характеристик - ММ и СД. Показано, что препараты на основе хитозана с СД 70% обладают высокой биологической активностью, способствуют активации макрофагов перитонеального экссудата, натуральных киллеров, увеличивают продукцию антител и клеточнозависимую цитотоксичность [Nishimura К., Nishimura S., Nishi N. Adjuvant activity of chitin derivatives in mice and guinea pigs. Vaccine - 1985. Vol. 3. 5. P. 375-384; Nishimura К., Nishimura S., Nishi N. Immunological activity of chitin and its derivatives. Vaccine - 1984. Vol. 2. 1. P. 93-99]. Кроме этого, обнаружено, что такие препараты активировали продукцию цитокинов, таких как интерлейкин-1, колониестимулирующий фактор, интерферон [Nishimura К. , Nishimura S., Seo H. Macrophage activation with multi-porous beads prepared from partially deacetylated chitin. J. Biomed. Mater. - Res. - 1986. Vol. 20. 9. P. 1359-13721.

При исследовании влияния хитозана на фаговые инфекции установлено, что его инактивирующая способность усиливается с увеличением количества аминогрупп в молекуле хитозана (с увеличением СД), репродукция колифагов эффективнее подавлялась более высокомолекулярным хитозаном [Кочкина З.М., Чирков С. Н. Влияние хитозана на фаговые инфекции. Материалы 5-ой конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана". М: ВНИРО 25-27 мая 1999. С. 1511. Исследование чувствительности микроорганизмов, выделенных из биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки больных язвенной болезнью, выявило, что чувствительность всех микроорганизмов находилась в прямой зависимости от ММ и СД [Червинец В.М., Комаров Б.А., Москвин С.В., Курочкин А.А. Чувствительность микрофлоры желудка и двенадцатиперстной кишки к хитозану и низкоинтенсивному лазерному излучению. Материалы научн. конф. "Фитотерапия и лазеротерапия в 21 веке". Черноголовка РИО ИПХФ РАН 7-9 декабря 1999. С. 1051].

Особенно отметим липотропное действие хитозана, противостоящее сердечно-сосудистой патологии. Предложен антигиперлипидемический препарат, содержащий в качестве активных ингредиентов олигомеры хитозана и/или хитина и не вызывающий побочных явлений даже при длительном применении [Заявка Японии 63-41422 от 06.08.86]. Липотропный эффект хитозана подтвержден учеными и нашей страны [Тарасенко Г.А. Экспериментальное обоснование гипохолестеринемического действия хитозана из панциря камчатского краба. Материалы 5-ой конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана." М: ВНИРО 25-27 мая 1999. С. 198; Петров В.А., Тарасенко Г.А. Токсиколого-гигиеничекая оценка хитозана из панциря камчатского краба в условиях хронического эксперимента. Там же. С. 179].

Наличие водорастворимой фракции хитозана (с ММ≤8-10 кДa, что соответствует≤50-60 звеньям в олигомерной цепи) в препаратах на его основе усиливает противоопухолевое [патент Японии 59-27826. А 61 К 35/56. 14.02.84] и иммуностимулирующее действие [патент Японии 62-61927. А 61 К 39/39, 31/73. 18.03.87; патенты США 4971956. А 61 К 31/73. 20.11.90 и 5912000. А 61 К 45/00. 15.06.99], способствует заживлению ран [патент Англии 1252373. А 61 К 27/00 С 08 В 19/14. 03.02.69; патенты США 3632754 А 61 К 17/00. 04.01.72 и 4772591 от 16.04.86].

Важным качеством хитозана при пероральном применении (особенно в виде растворимых форм: комплексы с кислотами или водорастворимые производные [патент РФ 2174000 от 22.02.2000] являются его сорбционные свойства, способность восстанавливать микрофлору кишечника и очищать его эпителий, предотвращая селиаз-болезнь, а также его хелато- и комплексообразующие свойства, обеспечивающие связывание и вывод из организма ионов тяжелых металлов, радионуклидов и различных токсинов, включая и анионные полимеры. Хитозан в десятки раз превосходит по эффективности ионнообменные смолы, причем все эти свойства находятся в прямой зависимости от ММ и СД хитозана.

Таким образом, анализ литературных данных и представленных сведений приводит к заключению о том, что с целью расширения спектра положительного действия хитозансодержащих препаратов и биологически активных добавок на основе хитозана и его производных следует использовать хитозан полифракционного состава по ММ в пределах от мономера (глюкозамина) до ~150 кДа и его СД в пределах от ~65 до ~95%.

Указанная цель достигается применением хитозана полифракционного состава, образующегося при смешении хитозана с различными характеристиками: 40-45 мас. % хитозана с ММ 80-100 кДа и СД 80-85%; 45-40% хитозана с MM 80-100 кДа и СД 68-72%; 7,0-6,0 мас.% хитозана с MM≤25 кДа и СД 80-85%; 8,0-7,0 мас.% хитозана с MM≤25 кДа и СД 68-72%; 0,0-2,0 мас.% олигомеров хитозана с числом звеньев в цепи от 1 до 10 и СД≤95%, для получения водорастворимых форм хитозана при мольном отношении аминогрупп и неорганической кислоты 1:(0,8-1), аминогрупп и органической кислоты 1:(0,8-1,2), аминогрупп и ангидрида органической кислоты 1: (1-1,4), а хитозан с СД 80-85% (или 68-72%) и требуемой величиной ММ получают путем обработки водной суспензии хитозана с исходной ММ 300-600 кДа перекисью водорода при условии, необходимом для получения заданного значения ММ. Олигомеры хитозана с N=1-10 получают путем обработки хитозана водной ортофосфорной кислотой при весовом соотношении компонентов: хитозан - ортофосфорная кислота - деминерализованная вода, равном соответственно: 1:(0,4-0,6):(0,6-0,4) при 70^oС в течение 4-х часов с последующей нейтрализацией и сублимационным выделением целевого продукта.

Известно, что хитозан и его производные относятся к полужесткоцепным полимерам [патент РФ 2144040 от 07.04.1998]. Гетерогенная деструкция таких полимеров зависит от степени упорядоченности (кристалличности), величин ММ и ММР, причем интенсивность процесса деструкции снижается с увеличением кристалличности, ММ и при сужении ММР [Зуев Ю.С. Разрушение полимеров под действием агрессивных сред. М.: Химия. 1972. С. 72-78]. Это явление обусловлено диффузионной доступностью деструктирующего агента к гликозидным связям хитозана [Н.А. Платэ, А.Д. Литманович, О.В. Ноа. Макромолекулярные реакции. М.: Химия. 1977 С. 47-51].

Поэтому для деструкции под действием перекиси водорода использовали свежепереосажденный хитозан при рН 6,9-7,5, характеризующийся пониженной упорядоченностью и повышенной доступностью гликозидных связей [патент РФ 2144040 от 07.04.1998].

Известно, что перекись водорода при рН ~7,0 и температуре ≤80^oС разлагается медленно в большом диапазоне концентраций, а скорость разложения является линейной функцией от времени [Перекись водорода и перекисные соединения. Под ред. проф. М.Е. Позина. Л: ГНТИ хим. л-ра. 1951. С.88-106]. Катализаторами разложения перекиси водорода могут быть некоторые ферменты животных и растительных клеток, а также ионы меди и железа, особенно в гомогенной среде и при совместном их присутствии, когда скорость разложения может увеличиваться в сотни раз. Контроль содержания металлов в хитозане и проведение его деструкции в гетерогенной среде позволяет получать воспроизводимые данные при концентрациях: [Н₂О₂]≤0,20 мас.%, [хитозан]≤3,0 мас.% и температуре ≤80^oС.

Специально проведенные исследования позволили установить для гетерогенной деструкции хитозана под действием перекиси водорода универсальную зависимость степени деструкции (DD - dgradation degree) от условий процесса [Шийчук А.В. Универсальный показатель глубины деструкции полимера. Логарифм отношения молекулярных масс. Укр. Хим. журн. Т. 57. 11. 1991. С. 1229]. Экспериментально определенная зависимость DD=1n(М₀/М)=f{[Н₂О₂]•τ}, где М₀ и М - средневязкостная ММ соответственно исходного и деструктированного кислоторастворимого хитозана [Gamzazade A.I., Slimak V.M., Sklar A.M., Shtikova E. V., Pavlova S.V., Rogojin S.V. // Acta Polymerica. 1985. V. 36. 8. P. 420], τ - время в мин, позволяет установить условия деструкции для заданной ММ целевого хитозана при любых значениях ММ исходного полимера. При этом экспериментально установлено, что величина СД хитозана при его гетерогенной деструкции под действием перекиси водорода существенно не изменяется.

Гетерогенная деструкция набухшего жесткоцепного или полужесткоцепного полимера, как правило, приводит к снижению ММ и расширению ММР из-за увеличения содержания низкомолекулярных фракций полимера. Эта закономерность подтверждена и для хитозана. Исследования методом экслюзионной хроматографии на приборе "Waters" с колонкой фирмы Waters Ultrahydrogel-250 (7,8•300 мм) показали, что при изменении отношения М₀/М от ~6,7 (DD=1,9) до~21,1 (DD=3,1) при гетерогенной деструкции ММР хитозана, как и следовало ожидать, уширяется, а содержание низкомолекулярной фракции включительно до мономера - глюкозамина возрастает на 20-30%. Проведенные оценки показали, что гетерогенно деструктированный хитозан со средневязкостной MM ~80-100 кДа имеет широкое ММР: от ~ 150 кДа до водорастворимой фракции, а с ММ ≤25 кДа от ~50 кДа до глюкозамина. Исследование методом ГПХ показало, что продукт глубокого кислотного гидролиза хитозана состоит из глюкозамина и его гомологов с числом звеньев в цепи не более 10.

Хитозан полифракционного состава, состоящий из макромолекул с различным числом звеньев в цепи: от 1 (мономерное звено - глюкозамин) до ~1000, получают путем совмещения фракций хитозана с различными молекулярными характеристиками. Аморфизацию хитозана осуществляют при его выделении путем обработки его растворов щелочным агентом до рН среды 6,8-7,5 и путем обработки суспензии смеси фракций хитозана в деминерадизованной воде в кавитационных или механических полях со сдвиговым воздействием, реализующимся при использовании гомогенизатора марки MPW-302 (Польша) или смесителя с высокооборотной (~ 1400 об/мин) дисковой мешалкой специальной конструкции [патент РФ 2144040 от 07.04.1998] , позволяющей создавать кавитационные и механические поля со сдвиговым воздействием на рабочие объемы.

Испытания водорастворимых форм полифракционного хитозана начаты с 1990-1991 г. в качестве биологически активных добавок к пище. Использование в клинической практике хитодеза в чистом виде и в сочетании сначала с настоями сборов лекарственных растений, а затем с сухими экстрактами различных сборов позволило обнаружить высокую эффективность предлагаемого состава хитозана в профилактике и лечении различных заболеваний [Червинец В.М., Богатов В. В. , Соловьев В.А., Шомина С.А., Петрова М.Б., Комаров Б.А. Способ повышения чувствительности бактерий к биодеструктивному действию лазерного излучения в сочетании с фотосенсибилизатором. Патент РФ 2151601 от 09.09.1999; Червинец В. М., Комаров Б.А. Способ лечения хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Патент РФ 2150271 от 13.10.1999; Трескунов К. А. , Комаров Б.А. Способ лечения онкозаболеваний. Патент РФ 2165253 от 20.01.1998; Червинец В.М., Богатов В.В., Шомина С.А., Комаров Б. А. Способ местного лечения острых периостатитов. Патент РФ 2153318 от 13.10.1999; Трескунов К.А., Комаров Б.А. Способ лечения бронхиальной астмы. Патент РФ 2172634 от 18.08.1998; Погорельская Л.В., Трескунов К.А., Трякина И. П., Комаров Б.А., Турьянов М.Х., Петрова Е.В. Способ лечения инфекционных заболеваний. Патент РФ 2174000 от 22.02.2000]. Указанные обстоятельства свидетельствуют о соответствии заявляемого технического решения критерию "новизна".

В связи с тем, что водорастворимые формы хитозана полифракционного состава могут использоваться не только в косметике и в лечебно-профилактическом наружном применении, но и в качестве биологически активной добавки к пище, важно отметить токсичность и биологическую активность получаемого продукта. Как отечественные исследователи [К.Д. Жоголев, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган. Препараты на основе хитина, хитозана в медицине и рациональном питании. Серия: Медицина 21 века. С.Пб. 2000. С. 6], так и зарубежные [S.S. Davis, Illum. Хитозан для доставки лекарств оральным путем. В кн. "Хитозан per os. От пищевой добавки - к лекарственному средству". /Под редакцией Риккардо А. А. Муццарелли/ Нижний Новгород: Изд-во "Вектор - ТиС". 2001. С. 187] отмечают низкую токсичность хитозана при пероральном применении. Токсическое свойство хитозана проявляется в случае приема в количестве, большем 18 г в день на 1 кг массы тела мышей. При этом не делается различия между образцами хитозана с различными молекулярными характеристиками [К.Д. Жоголев, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган. Препараты на основе хитина, хитозана в медицине и рациональном питании. Серия: Медицина 21 века. С.Пб. 2000. С. 17]. Отсутствие токсичности хитозана отмечается и при внутримышечном или внутрибрюшинном введении. Исследование 30 образцов хитина и хитозана с ММ от 50 до 300 кДа и 9-и их низкомолекулярных водорастворимых производных выявило токсическое их действие только при внутривенном введении [Коваль Ю.Ф., Жоголев К.Л., Никитин В. Ю. , Буланьков Ю.И., Десятова А.В. Медико-биологические аспекты использования хитина, хитозана и их производных // Совершенствование производства хитина и хитозана из панцырьсодержащих отходов криля и пути их использования. М. 1992. С. 30-36].

Используя меченые вещества ³H-хитозан и хитозан, маркированный технецием-99m, авторам [S.S. Davis, Illum. Хитозан для доставки лекарств оральным путем. В кн. "Хитозан per os. От пищевой добавки - к лекарственному средству". / Под редакцией Риккардо А.А. Муццарелли / Нижний Новгород: Изд-во "Вектор - ТиС". 2001. С. 187] не удалось обнаружить транспортировку хитозана через всю назальную слизистую в кровоток. Но при оральном применении [Б.А. Комаров, А. И. Албулов, Г.А. Эстрина, Я.И. Эстрин, Н.А. Шевченко, Р.И. Папина, Г. В. Костюк. Исследование хитодеза и фитохитодеза как перспективных биологически активных пищевых добавок. Материалы 6 Межд. конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" М. - Щелково. Изд. ВНИРО. 2001. С. 195] обнаружено быстрое (через 3 мин) проникновение олигомерного ³H-хитозана не только в кровь, а и в различные органы. Существенно, что при использовании ³H-хитозана с MM~87 кДа при прочих равных условиях также обнаруживается хитозан в крови и различных органах, но в этом случае максимальное его содержание в крови достигается через 15 мин и является меньшим в 1,7 раз по сравнению с олигомерным ³Н-хитозаном.

Эти сведения важны для понимания иммуномоделирующего действия хитозана - одного из основных компонентов проявления биологической активности. Специальные исследования позволили установить, что препараты хитозана вызывают достоверное увеличение активности ферментов гликолиза, гексозомонофосфатного шунта и цикла Кребса, активируют фагоцитоз микроорганизмов, увеличивают количество мигрирующих фагоцитов в очаг воспаления [К.Д. Жоголев, В.Ю. Никитин, В. Н. Цыган, В.Н. Егоров. Разработка и изучение некоторых лекарственных форм препаратов на основе хитозана. Материалы 6 Межд. конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" М. - Щелково. Изд. ВНИРО. 2001. С. 165; К.Д. Жоголев, В. Ю. Никитин, В.Н. Цыган. Препараты на основе хитина, хитозана в медицине и рациональном питании. Серия: Медицина 21 века. С.Пб. 2000; L. Gorovoj, O. Seniouk, G. Beketova, N. Savichuk, G. Amanbaeva. Использование хитинсодержащего препарата Mycoton в педиатрической гастроэнтерологии. В кн. "Хитозан per os. От пищевой добавки - к лекарственному средству". /Под редакцией Риккардо А. А. Муццарелли/ Нижний Новгород: Изд-во "Вектор -ТиС". 2001. C. 241].

Рассмотрим другой аспект проявления биологической активности хитозана - его бактериостатические свойства. Широкие исследования, проведенные на микробной обсемененности слизистой оболочки гастродуоденальной зоны в биоптатах, взятых при фиброгастродуоденоскопии из периульцерозной зоны, антрального и фундального отдела желудка больных хроническим гастритом, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, а также из слизистой оболочки нижней трети пищевода больных эзофагитами с применением хитозана с ММ от 26 до 600 кДа, позволили установить высокую антимикробную активность хитозана в изученном диапазоне MM - от 58 до 85% микроорганизмов чувствительны ко всем образцам хитозана [В. М. Червинец. Изменение микробиоценоза при воспалительных и эрозивно-язвенных поражениях пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки и пути его коррекции. Автореферат на соискание уч. степени д. мед. наук. М. 2002; В.М. Червинец, В.М. Бондаренко, А.И. Албулов, Б.А. Комаров. Антимикробная активность хитозана с разной молекулярной массой. Материалы 6 Межд. конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" М. - Щелково. Изд. ВНИРО. 2001. С. 252]. Обнаружена тенденция увеличения антимикробной активности хитозана с увеличением его СД. Наибольшая чувствительность выделенной микрофлоры из пораженных участков слизистой оболочки эзофаго-гастродуоденальной зоны обнаружена к образцам хитозана с ММ 320-350 кДа (82-87%).

Клинические испытания, проведенные в Институте питания РАМН в 1996 г., позволили констатировать, что прием БАД к пище "Хитозан пищевой" на фоне гипокалорийной гипонатриевой противосклеротической диеты способствовал заметному подавлению чувства голода (у 88% больных), при этом потеря веса составила 6,7%, что превышало на 2,2% в контрольной группе больных, выявил выраженный гиполипидемический эффект: снижение уровня холестерина и триглицеридов в сыворотке крови у пациентов опытных групп на 19% (против 10 и 12% в контроле), привел к снижению уровня билирубина в сыворотке крови в 3 раза более выраженное, чем у контрольной группы больных. Последнее в сочетании с гипохолестеринемическим действием свидетельствует о наличии желчегонного действия хитозана.

На основании представленных данных можно заключить, что иммуностимулирующее действие препаратов на основе хитозана полифракционного состава будет определяться олигомерной водорастворимой фракцией хитозана, а бактериостатические антимикробные свойства - наличием высокомолекулярной фракцией хитозана, способной растворяться только в подкисленной воде.

Предлагаемый способ получения хитозана полифракционного состава испытан в лабораторных и производственных условиях. В настоящее время производятся опытные партии различных БАД к пище на основе пищевого хитозана полифракционного состава.

Сущность изобретения демонстрируется следующими примерами.

Пример 1. 515,5 г хитозана с ММ ~600 кДа и СД 68-72% растворяют при перемешивании в течение 4 ч при 15^oС в 31 л 1%-ного раствора ледяной уксусной кислоты в деминерализованной воде. Раствор фильтруют через капроновую сетку от нерастворимых примесей, содержание которых составляет ≤3 мас.%. К полученному раствору при перемешивании медленно добавляют 8,02 кг 2,5 мас.% раствора NaOH в деминерализованной воде и доводят рН среды до 6,8. Высадившийся хитозан фильтруют с помощью специального фильтра из бельтингткани диагонального плетения, промывают деминерализованной водой и отжимают, получают 500 г свежепереосажденного хитозана в виде 5,5 мас.% суспензии. Полученную суспензию загружают в эмалированный или стеклянный реактор емкостью ~25 л, разбавляют деминерализованной водой до концентрации 3 мас.%, нагревают до температуры ≤80^oС, добавляют перекись водорода в расчете 0,15 мас.% от общего веса суспензии и при интенсивном перемешивании выдерживают в течение 25 мин, затем фильтруют, промывая холодной деминерализованной водой (17-20 л). Полученную суспензию отжимают до содержания хитозана 7,2-7,5 мас.%. Потери практически отсутствуют. Деструктированный хитозан имеет ММ ~80 кДа, СД ~ 68-72%.

Пример 2. Аналогично примеру 1, но берут для растворения хитозан с ММ 300 кДа и СД 80-85%, при высаживании раствором NaOH рН среды доводят до 7,5, суспензию свежепереосажденного хитозана обрабатывают перекисью водорода концентрации 0,2 мас. % в течение 34 мин. Получают хитозан с MM ≤25 кДа и СД 80-85%.

Пример 3. 500 г порошкообразного хитозана с влажностью ≤7-8 мас.%, MM 350 кДа и СД 80-85% загружают в эмалированный или стеклянный реактор емкостью ~ 2 л, добавляют 500 г 60 мас.% ортофосфорной кислоты в деминерализованной воде (плотность раствора 1,426 г/мл), что соответствует отношению: хитозан - ортофосфорная кислота - деминерализованная вода, равному 1-0,6-0,4. Затем нагревают при перемешивании и термостатировании при 70^oС в течение 4 ч. После охлаждения порционно при интенсивном перемешивании добавляют гидроокись кальция до рН 4, снова охлаждают, фильтруют, доводят рН до 7,0-7,5 и отстаивают в течение не менее 12 ч. Затем декантируют и водный раствор лиофилизируют. Выход олигомеров с числом звеньев в цепи от 1 до 10-67 г, или 13,4 мас.%, СД ≥95% (267 г 25 мас.% раствора олигомеров в деминерализованной воде). Используют в сухом виде или в растворе.

Пример 4. Аналогично примеру 3, но берут 500 г хитозана с ММ ≤25 кДа, СД 80-85% (или 68-72%), добавляют 500 г 40 мас.% ортофосфорной кислоты в деминерализованной воде (плотность раствора 1,254 г/мл). Выход олигомеров хитозана от мономера до десятимера ~100 г, или ~20 мас.%, СД ≥95% (400 г 25 мас. % раствора олигомеров в деминерализованной воде).

Пример 5. В эмалированной емкости объемом 8 л растворяют 37,7 г L-глутаминовой кислоты в 3 л деминерализованной воды при ≤40^oС и постоянном перемешивании гомогенизатором марки MPW-302 (Польша) в течение 1-1,5 мин, после этого при интенсивно работающем гомогенизаторе в режиме создания кавитационных и механических полей со сдвиговым воздействием на рабочий объем порционно добавляют навески фракций хитозана: 400 г суспензии хитозана, 7,2 мас. %, (28,8 г) с ММ 80-100 кДа и СД 80-85%; 450 г суспензии хитозана, 7,2 мас. %, (32,4 г) с ММ 80-100 кДа и СД 68-72%; 70 г суспензии хитозана, 7,2 мас. %, (5,04 г) с MM ≤25 кДа и СД 80-85%; 80 г суспензии хитозана, 7,2 мас. %, (5,76 г) с ММ ≤25 кДа и СД 68-72% в соответствии с мольным отношением L-глутаминовой кислоты и NH₂-групп всех фракций хитозана, равным 0,8:1, и перемешивают до растворения в течение 1,5-2 мин. Полученный раствор замораживают и лиофилизируют. После лиофилизации измельчают и таблетируют. Выход 97-98 мас.%.

Пример 6. Аналогично примеру 5, но берут янтарную кислоту при мольном отношении к NН₂-группам всех фракций хитозана, равном 1,2:1, и фракции хитозана: 450 г суспензии хитозана, 7,2 мас.%, (32,4 г) с ММ 80-100 кДа и СД 80-85%; 400 г суспензии хитозана, 7,2 мас.%, (28,8 г) с ММ 80-100 кДа и СД 68-72%; 60 г суспензии хитозана, 7,2 мас.%, (4,32 г) с MM ≤25 кДа и СД 80-85%; 70 г суспензии хитозана, 7,2 мас.%, (5,04 г) с MM ≤25 кДа и СД 68-72% и 5,76 г раствора олигомеров хитозана, 25 мас.%, (1,44 г) с числом звеньев в цепи от 1 до 10 и СД ≥95%.

Пример 7. Аналогично примеру 5, но берут хлористоводородную кислоту при мольном отношении к NH₂-группам всех фракций хитозана, равном 1:1.

Пример 8. Аналогично примеру 7, но берут мольное отношение хлористоводородной кислоты к NН₂-группам всех фракций хитозана, равном 0,8:1, и фракции хитозана: 450 г суспензии хитозана, 7,2 мас.%, (32,4 г) с ММ 80-100 кДа и СД 80-85%; 400 г суспензии хитозана, 7,2 мас.%, (28,8 г) с ММ 80-100 кДа и СД 68-72%; 70 г суспензии хитозана, 7,2 мас.%, (5,04 г) с ММ ≤25 кДа и СД 80-85%; 70 г суспензии хитозана, 7,2 мас.%, (5,04 г) с ММ ≤25 кДа и СД 68-72% и 2,88 г раствора олигомеров хитозана, 25 мас.%, (0,72 г) с числом звеньев в цепи от 1 до 10 и СД ≥95%.

Пример 9. Аналогично примеру 5, но аморфизацию смеси фракций хитозана осуществляют с помощью смесителя с высокооборотной дисковой мешалкой специальной конструкции, позволяющей создавать кавитационные и механические поля со сдвиговым воздействием на рабочий объем. В процессе аморфизации к смеси фракций хитозана добавляют порошок янтарного ангидрида с размером частиц ≤100 мкм при его мольном отношении к NH₂-группам всех фракций хитозана, равном 1:1.

Пример 10. Аналогично примеру 9, но добавляют к смеси фракций хитозана порошок янтарного ангидрида с размером частиц ≤100 мкм при его мольном отношении к NН₂-группам всех фракций хитозана, равном 1,4:1.

Концентрацию NH₂-групп в хитозане полифракционного состава, состоящего из смеси n-фракций расчитывают по формуле: [NH₂] = СУММА(G_n•СД_n)/(μ_n•100), где G_n и СД_n - соответственно сухой вес в г и степень деацетилирования в процентах n-фракции хитозана, μ_n - средний вес звена молекулы n-фракции хитозана определяют по уравнению μ_n = 203-(42•СД_n)/100.
Обнаруженная в клинической практике высокая эффективность хитодеза в определенной степени обусловлена частичным проникновением хитозана в кровь и различные органы. Рассмотрим этот вопрос более подробно. Факт усваивания хитозана и его выведения установлен на количественном уровне при специальном исследовании динамики проникновения и выведения олигомеров ³H-хитозана с числом звеньев в цепи от 1 до 10 в кровь и различные органы самцов мышей линии С-57/ВС. Олигомер ³H-хитозана вводился per os в виде раствора в воде в дозе 4 мг/кг веса животного (~100 мкг на одно животное), что соответствует приему 5-7 раз в день двойных доз для человека весом 70-90 кг (1 доза хитодеза равна 25 мг).

Оказалось, что наиболее активно ³H-хитозан проникает в печень, в которой максимальное его содержание (≤1,2 мас.% от введенного количества) обнаруживается через три минуты после перорального введения, затем содержание хитозана сначала снижается быстро (до ~15 мин), потом плавно (до 20 часов). Отметим, что в крови и органах ³H-хитозан обнаруживается уже через 1 мин после введения. Существенно, что качественные испытания кислоторастворимого ³Н-хитозана с ММ 87 кДа и СД 76%, полученном описанным в данном патенте методом гетерогенной деструкции, также обнаруживают проникновение в кровь и различные органы, но в этом случае через 15 мин его содержание в крови в ~ 1,7 р меньше по сравнению с олигомерным ³H-хитозаном при равных дозах и условиях введения, в дальнейшем содержание в крови этих двух типов ³H-хитозана выравнивается. Содержание кислоторастворимого ³H-хитозана в печени через 15 мин после введения в три раза меньше, чем олигомерного ³H-хитозана. Очевидно, что изменением содержания олигомерной фракции (от 1 до 10 звеньев в цепи) в хитозане полифракционного состава можно регулировать степень проникновения его в кровь и различные органы.

Исследования продолжаются. Но уже сейчас можно заключить, что многие обнаруженные разными исследователями и школами свойства пищевого хитозана обусловлены именно его способностью к частичному быстрому усвоению и проникновению в кровь и различные органы при условии наличия, по-видимому, в хитозане подобной олигомерной фракции. Этот факт может лежать в основе разнообразных положительных эффектов в клинической практике применения хитодеза и фитохитодезов.

Кроме этого, эффективность хитодеза может быть обусловлена важным его качеством растворимости в воде, слюне. При пероральном применении только водорастворимых форм хитозана при постепенном изменении среды в двенадцатиперстной кишке от кислой до нейтральной или слабо щелочной (7<рН≤7,3) возможен переход хитозана в коллоидное состояние. (Известно, что для фазового выделения кислоторастворимого хитозана потребуется увеличение рН среды до значений 8,5-9,0). Удельная поверхность коллоидных частиц может достигать 10⁶-10⁸ м² на 1 г. Очевидно, что адсорбционные, хелато- и комплексообразующие свойства хитозана в этом состоянии существенно усиливаются, что повышает детоксицирующее, противовоспалительное действие, а также способствует эффективной очистке эпителия кишечника, устранению причин целиаз-болезни. Повышенная активность хитозана в коллоидном состоянии позволила применять умеренные дозы на один прием - 25 мг, что облегчает изменение дозировки и порядка приема в острых случаях.