СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ, ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЙ, ЖЕЛЧЕГОННОЙ АКТИВНОСТЯМИ

Изобретение относится к фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего противовоспалительной, гепатопротекторной активностями.

Одним из важных приоритетов государственной политики в области развития медицинской науки России является разработка новых, конкурентоспособных, импортозамещающих лекарственных средств. Дикорастущие растения, имеющие возобновляемые сырьевые ресурсы - перспективные источники получения новых средств. Трава гипекоума прямого широко распространена в Центральной Азии, Сибири, имеет возобновляемые сырьевые ресурсы и применяется в практике тибетской медицины в составе многокомпонентных средств. Известно, что экстракт и сумма алкалоидов из травы гипекоума прямого обладают противовоспалительным, гипотензивным, жаропонижающим свойствами [Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т. 1. Семейства Magnoliaceae - Juglandaceae, Ulmaceae, Moraceae, Cannabaceae, Urticaceae. - СП.: M.: Товарищество научных изданий КМК. 2008. - 421 с.]. Известен метод получения из 4 кг травы гипекоума прямого 67,7 г (1,69% от массы сырья) хлороформной фракции, из которой было получено 7 алкалоидов общим весом 1,36 г (0,03% от массы сырья), обладающих антибактериальной активностью [Yinfen Su, Shengkun Li, Na Li et. al. Seven alkaloids and their antibacterial activity from Hypecoum erectum L. / Journal of medicinal plants research. - 2011. - Vol. 5 (22). - P. 5428-5432.]. К недостаткам известного метода можно отнести низкий выход конечного продукта, возможность возникновения побочных токсических реакции при длительном применении алкалоидов.

Задача данного изобретения - создание суммарного растительного средства, содержащего фенольные соединения и каротиноиды, обладающие противовоспалительной, гепатопротекторной, желчегонной активностями за счет более высокого содержания биологически активных веществ (БАВ).

Техническим результатом заявленного решения более широкий спектр фармакологической активности средства, полученного заявленным способом.

Указанная цель достигается посредством того, что способ включает экстракцию высушенных и измельченных до размера частиц 0,5-1,0 мм листьев и цветков гипекоума прямого 96% этанолом двукратно при комнатной температуре в течение 2 ч и 1 ч, в соотношении сырье: экстрагент 1: (10-12), затем 40% этанолом при температуре 90±5°С двукратно в течение 1 ч и 0,5 в соотношении 1:10, затем водой очищенной однократно при 100°С в течение 1 ч в соотношении 1:10. Конечный продукт получают объединением спиртовых фракции после удаления спирта с водным извлечением, сепарированием, концентрированием и высушиванием экстракта в вакуум-сушильном шкафу. Выход конечного продукта - экстракта сухого составляет 41-46% от массы сухого сырья) Способ позволяет получить продукт постоянного состава, обладающего противовоспалительной, гепатопротекторной активностями.

Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого технологического решения критерию «новизна» и условию патентоспособности «изобретательский уровень». Для доказательства существенности предложенных признаков способа проведены серии экспериментов, данные которых приведены ниже.

В связи с тем, что гепатопротекторной активностью обладают вещества фенольной природы, изучен качественный состав фенольных соединений листьев и цветков гипекоума прямого. Для количественного анализа БАВ использованы описанные в литературе фармакопейные методики [Государственная Фармакопея РФ XIII изд.]. Установлено, что содержание полифенолов в траве гипекоума прямого составляет 1,31%, в листьях - 1,48%, в цветках - 1,25%, в стеблях - 0,18%. Из-за незначительного содержания полифенолов в стеблях для получения экстракта использованы листья и цветки гипекоума прямого.

Для изучения качественного состава 0,5 кг листьев и цветков гипекоума прямого экстрагировали 60% спиртом при настаивании в течение 3 суток трехкратно. После удаления спирта водный остаток обработали последовательно хлороформом, этилацетатом, бутанолом, получили 19,95 г хлороформной, 8,2 г этилацетатной фракции, 21,5 г бутанольной,. 36,31 г водной фракции. Для хроматографии на бумаге и тонком слое силикагеля использованы системы растворителей: хлороформ-метанол, 9:1 (I), 15% уксусная кислота (II), бутанол-уксусная кислота - вода, 4:1:2 (III), хлороформ (IV). Для нисходящей хроматографии кумаринов использовали импрегнированную смесью формамид-ацетон (1:1) бумагу. В табл. 1 приведены данные об обнаружении биологически активных веществ в разных фракциях.

Примечание: «+++» - доминирование на хроматограмме; «++» - присутствие; «+» - следы, «0» - вещества не обнаружены

В хлороформной и этилацетатной фракции извлечения обнаружены 4 кумарина с R_f (IV): 0,09 (на уровне стандартного образца эскулетин с ярко-зеленой окраской), 0,18 (зеленое пятно), 0,35 (фиолетовое пятно), 0,65 (фиолетовое пятно). В этилацетатной фракции методом двумерной хроматографии (желтое окрашивание пятен на хроматограмме с 3% спиртовым раствором алюминия хлористого) обнаружены 8 веществ флавоноидной природы с R_f (ПЛИ): 0/0,88; 0/0,72; 0,34/0,66; 0,33/0,58 (доминирующее пятно); 0,50/0,57; 0,15/0,49; 0,46/0,49 (доминирующее пятно); 0,43/0,39. В хлороформной фракции проявляются 3 вещества флавоноидной природы с R_f (I): 0,15; 0,30; 0,63. На хроматограммах этилацетатной, бутанольной фракции проявляются 5 фенолокислот с R_f (III): 0,62 (на уровне образца хлорогеновой кислоты); 0,75; 0,77: 0,84 (на уровне образца феруловой кислоты); 0,87.

Для обнаружения алкалоидов по 0,05 г фракции смешивали с 2 мл 10% раствора аммиака, затем обработали 5 мл хлороформа трижды, хлороформное извлечение высушили на водяной бане, к сухому остатку добавили 5 мл 10% раствора серной кислоты, извлечение обработали 5 мл диэтилового эфира трижды, после отделения эфирного слоя к остатку сернокислого раствора добавили концентрированный аммиак до pH 8,0, затем экстрагировали 5 мл хлороформа трижды. Хлороформное извлечение высушивали, растворяли в 96% спирту, хроматографировали, при обработке хроматограммы реактивом Драгендорфа проявляются оранжево-розовые пятна алкалоидов с R_f (III): 0,59; 0,68, 0,88. В остальных фракциях алкалоиды не проявляются.

Для обнаружения полисахаридов 0,05 г извлечения растворяли 5 мл воды очищенной, добавляли 15 мл 96% спирта, оставляли на холоду в течение 3 ч, выпавший осадок отфильтровали, количественное содержание полисахаридов определяли гравиметрически. Данные качественного анализа показали, что фенольные соединения распределены во всех фракциях, и для их извлечения в экстракт необходимы экстрагенты разной полярности.

В табл. 2 приведены данные по определению оптимальных условий экстракции листьев и цветков гипекоума прямого.

Примечание: знак «-» означает, что определение веществ затруднено из-за минимального содержания (менее 0,01%); * - полисахариды не выпадают в осадок.

Для извлечения каротиноидов, агликонов фенольных и тритерпеновых соединений и других неполярных веществ экстракцию вели 96% спиртом этиловым при комнатной температуре, гликозидов фенольных и тритерпеновых веществ - 40 -96% спиртом и полисахаридов - водой очищенной. Контроль выхода липофильных веществ проводили спектрофотометрическим методом по содержанию каротиноидов при комнатной температуре для предотвращения деструкции термолабильных веществ, среднеполярных фенольных соединений - титриметрическим методом по количеству полифенолов, окисляемых перманганатом калия. Наибольшее количество каротиноидов извлекается 96% спиртом, полифенолов - 40% спиртом. Подобраны оптимальные соотношения для экстракции 96% спиртом - (1:10-12), 40% спиртом - 1:10 (Табл. 2). Измельчение сырья до 0,5-1,0 мм обеспечивает наиболее полный выход биологически активных веществ. Выход фенольных соединений увеличивается при повышении температуры экстракции, и оптимальной выбрана температура при 90±5°С (табл. 2).

Установлено, что при двукратной экстракции 96% спиртом в течение 2 ч и 1 ч извлекается основное количество липофильных веществ, при двукратной экстракции 40% этанолом в течение 1 часа и 0,5 ч при температуре 90°С - среднеполярных веществ. Полисахариды не осаждаются в извлечениях второй и третьей экстракции, таким образом, однократная экстракция водой при 100°С извлекает большую часть оставшихся в шроте водорастворимых полисахаридов. Способ получения экстракта сухого гипекоума прямого с использованием оптимальных параметров экстракции приведен в примерах 1-3.

Пример 1. 0,138 кг высушенной травы гипекоума прямого, раскладывают на столе, отделяют стебли от листьев и цветков. Отделенные от стеблей 0,10 кг листьев и цветков гипекоума прямого измельчают до размера частиц 0,5 мм загружают в экстракционный аппарат, заливают 1,2 л 96% спирта этилового, экстрагируют при постоянном перемешивании в течении 2 ч, извлечение фильтруют в сборник, повторяют экстракцию в течение 1 ч, добавляя спирт в количестве, равном слитому, извлечение фильтруют. Шрот экстрагируют 1,0 л 40% спирта в течение 1 ч при температуре 90±5°С, извлечение фильтруют. Экстракцию повторяют в течение 0,5 ч, добавляя экстрагент в количестве, равном слитому, отфильтрованные спиртовые извлечения объединяют. Шрот после спиртовой экстракции экстрагируют при температуре 100°С 1,0 л воды очищенной в течение 1 ч при постоянном помешивании, водное извлечение фильтруют. Спиртовые извлечения упаривают на роторном испарителе под вакуумом, водные остатки объединяют с водным извлечением пятой экстракции, сепарируют для удаления растительной пыли и балластных веществ, сгущают до 1/10 первоначального объема, высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 40-60°С в течение 8 ч. Получают 46,0 г экстракта сухого с влажностью 2,8%, выход - 46% от массы листьев и цветков или 33,3% от массы травы гипекоума прямого.

Пример 2. 0,072 кг высушенной травы гипекоума прямого, раскладывают на столе, отделяют стебли от листьев и цветков. Отделенные от стеблей 0,05 кг листьев и цветков гипекоума прямого измельчают до размера частиц 0,5 мм загружают в экстракционный аппарат, заливают 0,6 л 96% спирта этилового, экстрагируют при постоянном перемешивании в течении 2 ч, извлечение фильтруют в сборник, повторяют экстракцию в течение 1 ч, добавляя спирт в количестве, равном слитому, извлечение фильтруют. Шрот экстрагируют 0,5 л 40% спирта в течение 1 ч при температуре 90±5°С, извлечение фильтруют. Экстракцию повторяют в течение 0,5 ч, добавляя экстрагент в количестве, равном слитому, отфильтрованные спиртовые извлечения объединяют. Шрот после спиртовой экстракции экстрагируют при температуре 100°С 0,5 л воды очищенной в течение 1 ч при постоянном помешивании, водное извлечение фильтруют. Спиртовые извлечения упаривают на роторном испарителе под вакуумом, водные остатки объединяют с водным извлечением пятой экстракции, сепарируют для удаления растительной пыли и балластных веществ, сгущают до 1/10 первоначального объема, высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 40-60°С в течение 8 ч. Получают 21,8 г экстракта сухого с влажностью 3,1%, выход - 43,6% от массы листьев и цветков или 30,3% от массы травы.

Пример 3. 0,141 кг высушенной травы гипекоума прямого, раскладывают на столе, отделяют стебли от листьев и цветков. Отделенные от стеблей 0,10 кг листьев и цветков гипекоума прямого измельчают до размера частиц 0,5 мм загружают в экстракционный аппарат, заливают 1,0 л 96% спирта этилового, экстрагируют при постоянном перемешивании в течении 2 ч, извлечение фильтруют в сборник, повторяют экстракцию в течение 1 ч, добавляя спирт в количестве, равном слитому, извлечение фильтруют. Шрот экстрагируют 1,0 л 40% спирта в течение 1 ч при температуре 90±5°С, извлечение фильтруют. Экстракцию повторяют в течение 0,5 ч, добавляя экстрагент в количестве, равном слитому, отфильтрованные спиртовые извлечения объединяют. Шрот после спиртовой экстракции экстрагируют при температуре 100°С 1,0 л воды очищенной в течение 1 ч при постоянном помешивании, водное извлечение фильтруют. Спиртовые извлечения упаривают на роторном испарителе под вакуумом, водные остатки объединяют с водным извлечением пятой экстракции, сепарируют для удаления растительной пыли и балластных веществ, сгущают до 1/10 первоначального объема, высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 40-60°С в течение 8 ч. Получают 41,0 г экстракта сухого с влажностью 3,5%, выход - 41% от массы листьев и цветков или 29,1% от массы травы.

В полученных экстрактах определено содержание каротиноидов в пересчете на β - каротин - 27,97 ± мг %, флавоноидов - в пересчете на кверцетин - 0,14±0,01%, полифенолов - в пересчете на танин - 3,17±0,09%, аскорбиновой кислоты - 3,54±0,07%, полисахаридов - 17,0±0,8%.

Изучение фармакологических свойств полученного экстракта гипекоума прямого (далее экстракт - для обозначения в таблицах) проведено согласно методическим рекомендациям [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. МЗ РФ. Департамент контроля качества, эффективности и безопасности фармакологических средств. Фармакологический комитет МЗ РФ. 2 изд., перераб. и доп. - М., 2005]. LD₅₀ экстракта гипекоума при однократном внутрибрюшинном введении белым мышам обоего пола массой 25-30 г составлял 2217±147,3 мг/кг, что позволяет отнести его к относительно безвредным веществам по действующей классификации Кербера [Требования по доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ. - М., 1984. - 49 с.].

Изучение противовоспалительной активности экстракта сухого гипекоума прямого. Острое асептическое воспаление воспроизводили путем субплантарного введения крысам в правую заднюю лапку 0,1 мл 3% раствора формалина. Экстракт гипекоума прямого в дозе 50 мг/кг вводили внутрижелудочно в объеме 1 мл/100 г массы животных за 3 часа до субплантарного введения формалина, а затем через 5 и 18 ч после этого. Оценку антиэкссудативного эффекта экстракта проводили онкометрическим методом через 24 ч после введения формалина.

Моделирование воспалительного процесса осуществляли по методу Менкина. Экстракт гипекоума прямого в дозе 50 мг/кг вводили животным в течение 29 дней. Животные контрольной группы получали воду очищенную по аналогичной схеме в эквиобъемных количествах. На 9, 20 и 29 сутки эксперимента оценивали площадь кожно-мышечного дефекта планиметрическим методом.

Для определения влияния экстракта гипекоума на пролиферативную стадию воспаления животным под эфирным наркозом подкожно имплантировали стерильные ватные тампоны (шарики) массой 20 мг. Экстракт гипекоума в дозе 50 мг/кг в виде водного раствора вводили крысам внутрижелудочно один раз в сутки в течение 7 дней. Спустя 7 суток с начала опыта извлеченные у животных под эфирным наркозом гранулемы взвешивали до помещения в термостат и после высушивания при температуре 56°С в течение 24 часов. На основании полученных данных оценивали влияние испытуемого средства на пролиферативную стадию воспаления. Результаты опытов приведены в таблице 3.

Установлено, что экстракт гипекоума в указанной дозе оказывает выраженное антиэкссудативное действие, угнетая развитие формалинового отека на 31% по отношению к контролю (Табл. 3). Курсовое введение животным экстракта гипекоума в течение 25 дней сопровождается торможением действия флогогенного агента и стимуляцией заживление кожно-мышечного дефекта, вызванного 9% раствором уксусной кислоты. На 9 сутки опыта площадь некротизированной ткани у крыс, получавших экстракт гипекоума по сравнению с таковой у крыс контрольной группы снижалось на 22% (р>0,05), на 20 сутки отмечено достоверное уменьшение площадей деструкции, которые составляли 29% и на 29 сутки - 30%, что свидетельствовало о стимулировании процессов регенерации в очаге воспаления под влиянием испытуемого экстракта (Табл. 3).

Из данных, приведенных в табл.3 видно, что экстракт гипекоума стимулирует образование фиброзно-грануляционной ткани на 15%. Следовательно, экстракт сухой обладает умеренной пролиферативной активностью. Таким образом, испытуемый экстракт гипекоума обладает выраженной антиэкссудативной, антиальтеративной и умеренной пролиферативной активностью.

Изучение гепатопротекторной и желчегонной активности экстракта гипекоума. Предварительно было установлено, что увеличение дозы выше 50 мг/кг не приводит к существенному увеличению секреции желчи (Табл. 4) и в связи с этим, для последующих экспериментов экстракт гипекоума использовали в дозе 50 мг/кг.

Экспериментальный гепатит воспроизводили внутрибрюшинным введением крысам D-галактозамина в дозе 0,5 г/кг массы животных 1 раз в сутки в течение 3 дней. Экстракт гипекоума в дозе 50 мг/кг вводили животным с 1-го дня эксперимента 1 раз в сутки в течение 7 дней. В качестве препарата сравнения использовали карсил в дозе 50 мг/кг. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в соответствующем объеме по аналогичной схеме. Интервал между введениями указанных средств и D-галактозамина составлял 5 часов. Исследования проводили через на 3 и 7 сутки от начала эксперимента. В каждой исследуемой группе было по 6-8 животных.

Для оценки функциональной состоятельности печени в сыворотке крови определяли активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатамино-трансферазы (ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ); концентрацию холестерина, β-липопротеидов и общего билирубина. Для оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли содержание диеновых конъюгатов (ДК) в сыворотке крови, содержание малонового диальдегида (МДА) и активность каталазы в гомогенате печени, содержание восстановленного глутатиона (ВГ) в сыворотке крови. Желчеобразовательную и желчевыделительную функцию печени оценивали по скорости секреции и общему количеству выделенной желчи. Энергообеспеченность гепатоцитов определяли по количеству АТФ, пирувата и лактата в гомогенате печени, а также по соотношению пируват/лактат. Результаты исследований представлены в таблицах 5, 6, 7, 8, 9.

Повреждение печени лабораторных животных D-галактозамином сопровождается резкой активацией процессов ПОЛ, о чем свидетельствовало повышение концентрации продуктов пероксидации липидов в тканях, а также угнетение активности эндогенной антиокислительной системы (АОС) животных контрольной группы (Табл. 5). Так, содержание МДА в гомогенате печени контрольных крыс на 3 сутки эксперимента повышалось в 2,6 раза, ДК в сыворотке крови - в 7,0 раз по сравнению с показателями крыс интактной группы. Наряду с этим, на 3 и 7 сутки опыта активность каталазы в гомогенате печени снижалась в среднем в 2,0 раза, содержание ВГ - соответственно в 3,0 и 2,0 раза по сравнению с интактом (Табл. 5).

Курсовое введение животным экстракта гипекоума оказывало выраженное антиоксидантное действие, уменьшая интенсивность процессов ПОЛ и повышая активность АОС (Табл. 5).

Примечание: * - здесь и далее означает, что различия значимы по сравнению с данными у животных контрольной группы при р<0,05.

Так, концентрация МДА в гомогенате печени животных опытной группы на 3 и 7 сутки опыта снижалась соответственно на 29% и 37%, ДК - на 32% и 22% по сравнению с аналогичными показателями крыс контрольной группы. Одновременно с этим, под влиянием испытуемого средства отмечалось повышение активности каталазы соответственно на 58% и 11%, содержание ВГ в крови на 56% и 36% по сравнению с данными крыс контрольной группы. Установлено, что введение животным D-галактозамина вызывает ухудшение энергообеспеченности гепатоцитов (Табл. 6).

Так, в гомогенате печени животных контрольной группы на 7 сутки эксперимента отмечается снижение количества АТФ на 52%, увеличение содержания молочной кислоты в 2,0 раза по сравнению с указанными показателями животных интактной группы, что свидетельствует о напряженности метаболических процессов аэробного и анаэробного гликолиза в организме.

Введение животным экстракта гипекоума и карсила нормализует энергетическое состояние тканей печени при D-галатозаминовом гепатите. Так, концентрация АТФ в гомогенате печени животных опытных групп повышается в 1,7 и 1,4 раза соответственно, содержание молочной кислоты снижается на 28% и 23% по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы. Соотношение пируват : лактат в опытных группах составляет 1:15 и 1:16, тогда как в контрольной группе - 1:24, что указывает на нормализацию углеводного обмена в гепатоцитах (Табл. 6).

На фоне введения D-галактозамина у животных отмечалось развитие синдромов цитолиза и холестаза (Табл. 7).

Так, на 3 сутки исследований у крыс контрольной группы активность трансаминаз в сыворотке крови повышалась в среднем в 4,0 раза, активность ЩФ - в 2,6 раза, концентрация β-липопротеидов и билирубина - в 1,9 и 2,4 раза соответственно по сравнению с аналогичными показателями животных интактной группы (Табл. 7). На фоне введения экстракта гипекоума у крыс опытной группы на 3 и 7 сутки эксперимента активность АЛТ снижалась соответственно на 23% и 26%, ACT - на 20% и 44%, активность ЩФ - на 12% и 30%, концентрация β-липопротеидов - на 18% и 21% и билирубина - на 14% и 29% по сравнению с указанными показателями контрольных животных. Таким образом, экстракт гипекоума оказывал выраженное гепатопротекторное действие, уменьшая выраженность нарушений функциональной состоятельности печени.

Развитие D-галактозаминового гепатита сопровождалось выраженным угнетением желчеобразовательной и желчевыделительной функций печени (Табл. 8, 9).

В частности, скорость секреции желчи у животных контрольной группы на 3 сутки опыта снижалась в среднем на 22%, а на 7 сутки - на 27% по отношению к показателям интактных крыс. Кроме этого, в контроле на 7 сутки опыта наблюдали более выраженное снижение содержания основных компонентов желчи по отношению к интакту : холаты - на 20%, билирубин - на 30% и холестерин на - 34% (Табл. 9).

Применение экстракта гипекоума ингибировало нарушения желчеобразовательной функции печени, вызванные введением животным D-галактозамина. Так, скорость секреции желчи у животных опытной группы возрастала и превышала таковую у крыс контрольной группы на 3 сутки опыта в среднем на 19%, на 7 сутки - на 45%. Кроме того, экстракт гипекоума повышал экскрецию билирубина и холестерина с желчью. Содержание их в желчи на 3 сутки опыта превышало контроль в среднем на 27%, а на 7 сутки соответственно на 19% и 41% (Табл. 9). Полученные данные свидетельствуют, что экстракт гипекоума прямого в дозе 50 мг/кг оказывает желчегонное действие.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что экстракт сухой гипекоума прямого обладает противовоспалительной, гепатопротекторной, желчегонной активностями, снижая развитие синдромов цитолиза и холестаза, повышая энергетический потенциал и ограничивая дистрофические и некротические изменения гепатоцитов, ингибируя свободно-радикальное окисление биомакромолекул и активируя антиоксидантную систему организма, и может рассматриваться как многофункциональный гепатопротектор для фармакологической коррекции повреждений печени.