Результат интеллектуальной деятельности: ПЕПТИДНЫЙ АНТИБИОТИК БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ЛАТЕРОЦИН, ПОДАВЛЯЮЩИЙ РАЗВИТИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ВОДОРОСЛЕЙ

Изобретение относится к микробиологии и биохимии, в частности к выделению биологически активных соединений - антибиотиков для борьбы с микроскопическими водорослями.

Микроскопические водоросли при интенсивном развитии представляют серьезную экономическую и социальную проблемы. Экономические аспекты связаны с загрязнением природных водоемов и водохранилищ, обеспечивающих питьевой водой население. Следствием развития энергетики и промышленности в последние десятилетия явилось создание большого числа искусственных и технологических водоемов (водохранилищ и прудов), а также систем водоснабжения промышленных предприятий. Массовое увеличение численности микроводорослей в водоемах приводит к неблагоприятным последствиям, таким как «цветение» воды [1] и зарастанию микроводорослями водных резервуаров, используемых в металлургической промышленности и энергетике, а также обрастанию технологического оборудования в водных резервуарах.

Социальные аспекты обусловлены выделением некоторыми видами микроскопических водорослей в процессе их жизнедеятельности соединений со зловонным запахом, в частности геосмина, что сильно снижает качество питьевой воды, а также рекреационную привлекательность природных водоемов [2]. Микроскопические водоросли, в частности сине-зеленые водоросли (цианобактерии), продуцируют токсины, которые при гибели цианобактерий высвобождаются в водную среду. Описаны несколько видов токсинов - эндотоксины, нейротоксины, гепатотоксины. Уровень токсичности этих веществ исключительно высок. Так, микроцистин LR токсичнее цианида в 200 раз [3]. Нейротоксины блокируют нервную и мышечную систему и могут привести к изменениям в дыхательной системе. Гепатотоксины отравляют печень и другие внутренние органы, что часто ведет к смертельному исходу. Токсины могут продуцироваться и сохраняться в воде в течение нескольких недель. Они также могут накапливаться в рыбах, моллюсках, ракообразных. Концентрация токсинов, вызывающая 50%-ную гибель животных, колеблется от 15 мг/кг до 150 мг/кг веса животных. Антидотов к токсинам цианобактерий в настоящее время не выявлено. Сине-зеленые бактерии вызывают ряд аллергических заболеваний. Поэтому при высоком уровне "цветения" воды становится нежелательным использование водоемов в рекреационных целях, т.е. нужно до минимума ограничить время нахождения человека и домашних животных в такой воде. Концентрация токсина микроцистина в рекреационной воде не должна превышать 20 мкг/л.

Избыточное развитие цианобактерий сопровождается выбросом в воду ряда токсических соединений (фенолов, индола, скатола), а также органолептическими проявлениями гниения, в частности продукцией геосмина. Высокая численность клеток микроводорослей при их отмирании может приводить к гипоксии и гибели многих гидробионтов.

Серьезные экономические и медико-социальные проблемы, вызываемые микроводорослями, определяют необходимость поиска и разработки методов подавления развития микроскопических водорослей и прогнозирования состояния водных экосистем.

В настоящее время известны различные физические, химические и биологические средства подавления развития микроводорослей. Несмотря на эффективность химических альгицидных соединений в лабораторных условиях, массовое использование их в естественных условиях лимитируется по токсикологическим и гигиеническим требованиям. Кроме того, химические препараты не обладают избирательностью действия и оказывают ряд побочных биологических эффектов (летальный, мутагенный, тератогенный и т.д.) на растительные и животные организмы. Использование химических соединений для обработки водоемов ограничено по санитарно-гигиеническим нормам в связи с опасностью для человека и животных и также неблагоприятно сказывается на жизнедеятельности других обитателей водоемов (гидробионтов).

Используемые физико-химические методы борьбы с микроводорослями - спуск воды из водоемов с последующим механическим удалением биомассы, аэрирование огромных водных пространств, применение химических препаратов и веществ коагулянтов, использование ультрафиолетового облучения и ультразвука малоэффективны и связаны с большими финансовыми затратами. Физические методы контроля микроводорослей направлены на создание условий либо препятствующих развитию водорослей либо разрушающих уже образовавшиеся сообщества микроводорослей, так называемых матов. Ультразвуковая обработка «цветущей» воды хотя и является достаточно эффективной по альгидному действию, приводит к нежелательным последствиям. Обработка «цветущей» воды ультразвуком снижает pH воды и количество общего азота и фосфора в воде, повышает температуру воды. Альтернативой химическим и физическим средствам для подавления развития микроводорослей в водной среде является применение биологических средств на основе бактерий и их метаболитов, обладающих альгицидными свойствами. Известны штаммы бактерий, подавляющие развитие микроводорослей [4-11].

В качестве ближайшего аналога заявляемого объекта рассмотрено цианолитическое (альгицидное) соединение аргимицин А, синтезируемое бактериями Sphingomonas sp. М-17 [12]. Аргимицин А вызывает подавление процессов фотосинтеза.

Задачи заявляемого изобретения:

- выделение нового цианолитического соединения, продуцируемого штаммом бактерий Brevibacillus laterosporus В-10531;

- характеристика химической структуры и физических свойств нового цианолитического соединения.

Заявляемое нами цианолитическое соединение, названное нами латероцином, не известно из источников информации. Латероцин подавляет развитие сине-зеленых водорослей. Латероцин представляет собой белое аморфное твердое вещество, имеющее формулу [cyclo-(L-Val-L-Orn-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Phe-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Met-)] и молекулярную массу 1240,6 Да. Латероцин растворяется в метаноле, этаноле, других низших спиртах, не растворяется в воде.

Заявляемое цианолитическое соединение выделено из природного штамма Brevibacillus laterosporus, полученного путем многоступенчатой селекции и депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-10531. Штамм образует округлые колонии диаметром 3-5 мм с гладкой поверхностью светлого кремового цвета и неровным краем.

Биологическое соединение латероцин заявляется как фактор, оказывающий альгицидный (антагонистический) эффект на разные виды микроскопических водорослей.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Культивирование штамма ВКПМ В-10531 - продуцента латероцина

Для культивирования штамма В-10531 используют среду NBY [13]. Среду готовят на дистиллированной воде, доводят значение pH до 7,0; разливают в колбы по 50 мл и стерилизуют при давлении 0,8 атм, температуре 120°С в течение 30 мин. После стерилизации колбы с содержащейся в них средой охлаждают до +20°С. Стерильность и pH среды контролируют путем отбора соответствующих проб. В качестве посевного материала используют 5 мл культуры ВКПМ В-10531, полученной при культивировании в среде NBY 16 часов при 30°С при встряхивании 250 об/мин. Отсутствие посторонней микрофлоры контролируют микроскопически. Продуктивность штамма определяют методом серийных разведений с последующим высевом на агаризованную среду.

Пример 2. Культивирование микроскопических водорослей

Используют штаммы азотфиксирующих нитчатых видов микроскопических водорослей цианобактерий: Anabaena sp. 5781 - получен с кафедры микробиологии Ленинградского государственного университета; Nostoc sp. A-10 - получен из коллекции IMET, Йена, ГДР. Штаммы не фиксирующих азот одноклеточных цианобактерий Microcystis aeruginosa 562 и 905 получены из Института гидробиологии Китайской Академии наук (провинции Хубей, г.Ухань).

Штаммы цианобактерий Anabaena и Nostoc выращивают в модифицированной среде BG-11 [14]. Штаммы Microcystis aeruginosa 562 и 905 выращивают в среде В-12

[15]. Микроводоросли культивируют в стеклянных плоскодонных колбах емкостью 250 мл в 100 мл среды без аэрации при температуре 20°С и круглосуточном освещении в течение двух недель. Используют люминесцентные лампы дневного белого света СВЕ ЛБУ-30, которые обеспечивают освещенность 40 мкмоль квантов·м^-2·с^-1 в области ФАР (фотосинтетически активной радиации).

Пример 3. Выделение и очистка латероцина из штамма Brevibacillus laterosporus В-10531

Штамм Brevibacillus laterosporus В-10531 культивируют в жидкой питательной среде NBY 90 часов, как описано выше. По окончании культивирования клетки бактерии Brevibacillus laterosporus отделяют центрифугированием на высокоскоростной центрифуге со скоростью 10000 об/мин в течение 50 мин при температуре 4°С. К осадку добавляли холодный (5°С) абсолютный спирт из расчета 6 мл/г биомассы и оставляют на сутки в холодильнике. Затем спиртовой экстракт отделяют от биомассы на воронке Бюхнера, используя фильтр с размером пор 0,2 мкм, и подвергают фракционированию с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Luna 5u C5, 250×10 мм, уравновешенной раствором А (5% ацетонитрил, 60% метанол), в линейном градиенте раствора Б (22,5% ацетонитрил, 75% метанол) от 0 до 100% в течение 40 мин (2,5% мин^-1) при скорости потока 1,6 мл/мин. Детектирование ведут при длине волны 214 нм, на колонку наносят по 0,5 мл спиртового экстракта. Аликвоты полученных фракций тестируют на цианолитическую активность методом совместного инкубирования. В результате хроматографического разделения на колонке Luna 5u C5 получают активную фракцию, которая соответствует основному пику, выходящему с колонки при концентрации ацетонитрила 17,5% и метанола 70,5%. Активную фракцию дважды подвергают рехроматографии на той же колонке, уравновешенной раствором А. Первую рехроматографию проводят в линейном градиенте раствора Б от 30% до 100% в течение 40 минут (1,75% мин^-1) при скорости потока 1,6 мл/мин. Пик, содержащий активную фракцию, выходит с колонки при концентрации ацетонитрила 15,5% ацетонитрила и метанола 69%. Вторую рехроматографию проводят в изократическом режиме на колонке, уравновешенной смесью растворов А и Б в соотношении 40:60 по объему. Скорость элюции - 1,6 мл/мин. Пептид латероцин, обладающий цианолитической активностью, элюируется с колонки на 15-й минуте. Индивидуальность выделенного пептида латероцина подтверждают методами масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии.

Пример 4. Определение структуры латероцина

Для определения структуры выделенного антибиотика применяют метод ЯМР-спектроскопии. 1,0 мг пептида латероцина растворяют в 450 мкл метанола (pH 6,2). ЯМР-спектры пептида получают при температуре 33°С на спектрометре Bruker AvanceIII-600 (Германия) с рабочей частотой 600 МГц. Для измерения ЯМР-спектров используют датчик тройного резонанса (¹H, ¹³C, ¹⁵N) с криогенно охлажденной ¹Н катушкой (Bruker, Германия). На основании анализа двумерных ¹Н-ЯМР-спектров COSY, TOCSY, NOESY и ROESY при помощи стандартной процедуры [16] проводят полное отнесение сигналов ядер ¹Н исследуемого образца. На основании анализа двумерных ¹³С-ЯМР-спектров HSQC и НМВС проводят полное отнесение сигналов ¹³С ядер исследуемого образца. Полученое отнесение соответствует аминокислотной последовательности латероцина: [cyclo-(L-Val-L-Orn-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Phe-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Met-)].

После анализа баз данных по аминокислотным последовательностям выявлено, что приведенная выше структура не описана ранее, а выделенный нами циклодекапептид является новым антибиотиком. Данный пептид, названный нами латероцином и обладающий цианолитической активностью, относится к семейству тироцидиновых антибиотиков.

Пример 5. Определение молекулярной массы пептида латероцина и подтверждение его структуры методом масс-спектрометрии

Масс-спектры получают на гибридном масс-спектрометре LTQ FT (Thermo Electron, Германия), который состоит из линейной квадрупольной ионной ловушки и масс-спектрометра ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ). В качестве источника ионов используют универсальный источник ионизации Finnigan Ion Max Source (Thermo Electron, Германия) в режиме электрораспыления. Для пептида латероцина наблюдают однозарядный ион с m/z 1241,61, соответствующий протонированному молекулярному иону (М+Н)⁺ и моноизотопной молекулярной массе пептида 1240,60±0,01 Да. Полученная масса с учетом точности измерения совпадает с расчетной моноизотопной молекулярной массой пептида латероцина (1240,60 Да). Масс-спектрометрический анализ подтверждает заявляемую структуру пептида латероцина.

Пример 6. Определение спектра цианолитической активности латероцина

Цианолитическую активность латероцина выявляют при смешанной инкубации пептида с двухнедельными культурами различных микроводорослей. Измеряют оптическую плотность смеси на спектрофотометре при длине волны 590 нм в нулевой момент времени и после инкубации при комнатной температуре и круглосуточном освещении. Цианолитическую активность оценивают по падению оптической плотности через 24 часа инкубации. Определяют остаточную оптическую плотность по формуле: (ОП_О), как (ОП_Т/ОП_Н)×100, где ОП_Н - начальная ОП, ОП_Т - ОП - после инкубации в течении Т часов соответственно. Латероцин вызывает падение оптической плотности в инкубационных смесях (таблица 1). При оптической микроскопии выявляется лизис клеток цианобактерий.

Пример 7. Определение минимальной цианолитической концентрации латероцина методом измерений интенсивностей флуоресценции хлорофилла на суспензиях микроводорослей

Регистрацию интенсивностей флуоресценции хлорофилла проводят на флуорометре с амплитудной модуляцией возбуждающего света «МЕГА-25». В качестве детектора флуоресценции в этом приборе используют фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) R7400U-20 фирмы «HAMAMATSU». Перед ФЭУ устанавливают граничный светофильтр КС 18, позволяющий регистрировать флуоресценцию хлорофилла с длиной волны более 680 нм. Для исключения недопустимой засветки ФЭУ прибор снабжают шторкой, автоматически закрывающей ФЭУ при открытии камеры. Интенсивность флуоресценции хлорофилла при открытых (F₀) и закрытых (Fm) реакционных центрах фотосистемы 2 проводят при возбуждении светом с плотностью мощности 0,8 мкмоль·м^-2·с^-1 и 6000 мкмоль·м^-2·с^-1 соответственно [17, 18].

Отношение (Fm-Fo)/Fm (относительная переменная флуоресценция) равно потенциально возможной эффективности использования энергии света РЦ ФС 2 и является безразмерной величиной, способной приобретать значения от 0 до 0,84 в зависимости от состояния фотосинтетического аппарата растительного объекта. Величина относительной переменной флуоресценции может быть определена для любых растительных организмов и не зависит от содержания хлорофилла в исследуемой пробе.

Для оценки минимальной цианолитической концентрации латероцина используют метод измерения эффективности использования энергии света РЦ ФС 2 по флуоресценции хлорофилла. Измерение интенсивностей флуоресценции хлорофилла проводят на флуорометре с амплитудной модуляцией возбуждающего света.

Флуоресценцию определяли фотоэлектрическим умножителем через граничный фильтр, пропускающий свет с длиной волны больше 680 нм. Интенсивность флуоресценции хлорофилла при открытых (F₀) и закрытых (Fm) реакционных центрах фотосистемы 2 проводили при возбуждении светом с плотностью мощности 0,8 мкмоль · м^-2 · с^-1 и 6000 мкмоль · м^-2 · с^-1 соответственно.

Из таблицы 2 следует, что латероцин подавляет процессы фотосинтеза цианобактерий в концентрациях выше чем 10 мкг/мл.

Пример 8. Определение минимальной цианолитической концентрации латероцина при регистрация спектров поглощения суспензий микроводорослей

Регистрацию спектров поглощения суспензий цианобактерий проводят в диапазоне от 350 до 850 нм на однолучевом спектрофотометре с интегрирующей сферой на базе спектрометра USB 2000 ("Ocean Optics", США) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см [19]. Разрушение фикобилинов цианобактерий определяют по отношению поглощения при 630 нм, соответствующему максимуму поглощения фикоцианина, к поглощению при 680 нм, соответствующему поглощению хлорофилла.

Из таблицы 3 следует, что действие латероцина приводит к разрушению фикобилинов цианобактерий в концентрациях выше, чем 10 мкг/мл.