СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета.

С учетом основных достижений современной диабетологии и рекомендаций Всемирной организации здравоохранения европейские страны к 2001 году завершили переход на использование человеческих инсулинов. В связи с этим разработка способов получения инсулина с использованием методов ДНК-рекомбинантной технологии является актуальной задачей.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в культивировании штамма-продуцента Е. Coli, продуцирующего проинсулин, содержащий два синтетических IgG связывающих домена стафилококкового белка А. Схема выделения заключается в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительном сульфитолизе проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией. (Nilson J. , Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. "Integrated production of human insulin and its C-peptide", Journal of biotechnology, 1996, v.48, p. 241-250).

Недостатками данного способа являются высокая себестоимость продукта и использование при получении инсулина детергента, который может присутствовать в целевом продукте.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в том, что культивируют клетки штамма-продуцента Е. Coli ДН5^а /pVK.100, разрушают бактериальные клетки дезинтеграцией, отделяют тельца включения, содержащие гибридный белок, от водорастворимых примесей при помощи центрифугирования, растворяют тельца включения в буфере, содержащем 8 М мочевину, 1мМ дитиотреитол, 0,1 М трис-HCl, рН 8,0, в течение 12-16 ч. Нерастворившиеся примеси удаляют центрифугированием, после чего увеличивают концентрацию дитиотреитола до 10 мМ и восстанавливают дисульфидные связи при 4^oС в течение 1 ч. Раствор разбавляют в 5 раз холодной водой, доводят рН до 4,5 и выдерживают 2 ч при 4^oС для формирования осадка. Осадок, содержащий гибридный белок, отделяют центрифугированием и ренатурируют, быстро растворяют в холодной воде при рН 10-12, после чего разводят 10 мМ глициновым буфером рН 10,8 и выдерживают при 4^oС в течение ночи. После ультрафильтрации раствор подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-50 и элюируют 10 мМ глициновым буфером. Собирают фракции, содержащие гибридный белок, проводят ультрафильтрацию и лиофильно высушивают. Полученный гибридный белок растворяют в 0,08 М трис НС1 буфере, рН 7,5 до концентрации 10 мг/мл и расщепляют одновременно трипсином и карбоксипептидазой Б (соотношение карбоксипептидаза Б: трипсин: гибридный белок 0,3:1:10) при 37^oС в течение 30 мин. Затем добавляют изопропанол до 40%. Смесь подвергают хроматографической очистке на колонке с ДЭАЕ-сефадексом А-25 и элюируют 0,05М трис НСl буфером, рН 7,5 с 40% изопропанола с линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,1 м. После удаления изопропанола концентрацию хлористого натрия увеличивают до 25%, сдвигают рН до 2,0 и собирают осадок инсулина (Chen J.-Q., Zhang Н.-Т., Нu М. -Н. , Tang J.-G., "Production of human insulin in an E. Coli system with met-lys-human proinsulin as the expressed precursor" Applied Biochemistry and Biotechnology, 1995, v. 55, p. 5-15).

К недостаткам известного способа относится использование гельфильтрации на начальных стадиях, что требует значительных объемов сорбента и большого количества ферментов, используемых при расщеплении гибридного белка.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка путем осаждения примесных соединений в 40%-ном изопропаноле с последующей хроматографией на КМ-сефарозе, его последовательное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером рН 5,0-6,0, содержащим 6 М мочевины, с элюцией фракций линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с последующей гель-фильтрацией. (Пат. РФ 2141531, МКИ С 12 Р 21/02, опубл. 1999 г.)
К недостаткам способа следует отнести использование значительных количеств мочевины на стадии хроматографии на SP-сефарозе (проблема последующей утилизации) и использование органических растворителей на стадии выделения рекомбинантного белка и стадии очистки инсулина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (проблема защиты окружающей среды при промышленном производстве).

Изобретение решает задачу упрощения процесса.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения генно-инженерного инсулина человека, включающем культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM 109/pPINS07, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, восстановление дисульфидных связей, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и выделением инсулина, предварительно проводят отмывку телец включения, растворение белка и восстановление дисульфидных связей проводят одновременно в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА в течение 3-7 ч, очистку регенерированного гибридного белка проводят в одну стадию ионообменной хроматографией, расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:1-2:1, очистку инсулина проводят гидрофобной хроматографией с последующей гель-фильтрацией, а выделение инсулина - кристаллизацией в присутствии солей цинка.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения генно-инженерного инсулина человека используют штамм бактерии Escherichia coli 1М109/рР1Н807-продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека. Биосинтез продуцента проводят следующим образом.

При культивировании клеток штамма-продуцента Escherichia coli JM 109/pPINS07 для получения иннокулята питательную среду на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в ферментере объемом 10 л. Полученный посевной материал используют для засева ферментера объемом 100 л. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 30 ОЕ, проводя индукцию синтеза гибридного белка изопропилтио-β-D-галактопиранозидом. После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием, разрушают на дезинтеграторе Гаулина и выделяют центрифугированием тельца включения.

Тельца включения, полученные после дезинтеграции биомассы, обрабатывают по следующей схеме:
1. Тельца включения подвергают двукратной отмывке водой и 50 мМ трис-НСl при рН 9,0.

2. Отмытые тельца включения растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис-НСl, 8,0 М мочевину, 1 мМ ЭДТА, 0,2 М NaСl, 5-10 мМ дитиотреитола, при рН 8,0. Осадок отделяют центрифугированием.

3. Супернатант, содержащий восстановленный гибридный белок, разбавляют 25 мМ трис-НСl буфером с рН 8,5-9,5 или 25 мМ Na-глициновым буфером при рН 9,5-10,5, при 4-9^oС так, чтобы концентрация общего белка составила 0,4-0,8 мг/мл. Раствор выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение 72 ч.

4. Очистку гибридного белка проводят хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе FF, ДЕАЕ-тойоперле и т.п. или на SP-сефарозе FF, SP-тойоперле и т.п.

5. К полученному раствору очищенного гибридного белка прибавляют раствор, содержащий карбоксипептидазу Б и трипсин, по окончании реакции (данные ВЭЖХ) гидролиз останавливают подкислением раствора до рН 3,0, прибавляют хлористый натрий, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют. Осадок передают на следующую стадию очистки.

6. Осадок белка, содержащий инсулин, растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, добавляют хлористый натрий до концентрации 1 М и доводят рН раствора до значения 6,1-6,5. Раствор центрифугируют и супернатант, содержащий инсулин, наносят на колонку, содержащую гидрофобный сорбент, уравновешенный исходным буферным раствором. Сорбированный материал элюируют линейным градиентом этилового спирта. Фракции, содержащие инсулин с чистотой не менее 98%, объединяют и передают на дальнейшую очистку.

7. Раствор, содержащий инсулин, смешивают с равным количеством раствора 4 М хлористого натрия в 10 мМ лимонной кислоте, выдерживают при перемешивании на холоду, центрифугируют. Полученный осадок растворяют в 0,5 М уксусной кислоте, фильтруют и передают на гель-фильтрацию. Гельфильтрацию раствора инсулина проводят на колонке, содержащей сефадекс G-50 SF SG.

8. К раствору инсулина, полученного на предыдущей стадии, добавляют ацетат цинка, доводят значение рН до 5,8-6,2 концентрированным раствором аммиака. Суспензию перемешивают в течение 2 ч, после чего центрифугируют. Полученный осадок промывают апирогенной водой, растворяют в 60 мМ лимонной кислоте, создавая концентрацию инсулина 4 мг/мл. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, добавляют этиловый спирт до концентрации 15% и раствор хлористого цинка, значение рН доводят до 6,0-6,3 концентрированным аммиаком, перемешивают при 4-6^oС в течение 4 ч и центрифугируют. Кристаллы последовательно промывают апирогенной водой, этиловым спиртом и абсолютным этиловым спиртом и высушивают в вакуумном сушильном шкафу.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Культивирование клеток штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07 проводят следующим образом:
Для получения иннокулята питательную среду на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в ферментере объемом 10 л. Полученный посевной материал используют для засева ферментера объемом 100 л. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 30 ОЕ, проводя индукцию синтеза гибридного белка изопропилтио-β-D-галактопиранозидом.

После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием, разрушают на дезинтеграторе Гаулин и выделяют центрифугированием тельца включения.

250 г телец включения подвергают отмывке водой и 50 мМ трис-НСl при рН 9,0. Для этого тельца включения суспендируют в воде при массовом соотношении телец и воды 1:4 при перемешивании в течение 30 мин. Затем суспензию центрифугируют при 25000 g в течение 30 мин, супернатант сливают, а осадок отмывают в 50 мМ трис-НСl.

Полученные тельца включения растворяют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl, 8,0 М мочевину, 1 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl, 10 мМ дитиотреитол, при рН 8,0. Реакцию проводят в течение 3 ч при температуре 20^oС. Нерастворившийся материал отделяют центрифугированием при 25000 g в течение 30 мин.

Суммарное содержание белка, определяемое методом Лоури, составляет 28 г, содержание гибридного белка по данным SDS электрофореза 50%.

Супернатант, содержащий восстановленный гибридный белок, разбавляют буфером 25 мМ трис-HCl, рН 9,0, охлажденным до 4^oС так, чтобы концентрация общего белка составляла 0,4 мг/мл. Раствор выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение 72 ч.

Очистку гибридного белка проводят хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе FF. Ha колонку диаметром 113 мм, содержащую 1,5 л ДЕАЕ-сефарозы FF и уравновешенную 25 мМ трис-НСl-буфером с рН 7,5, наносят раствор ренатурированного гибридного белка. Сорбированный белок элюируют с колонки градиентом соли от 0 до 0,3 М хлористого натрия в исходном буфере. Фракции, содержащие гибридный белок, объединяют и используют для получения инсулина. Выход ренатурированного гибридного белка со степенью чистоты 93-98% составляет 9 г.

Содержание гибридного белка определяют по величине оптической плотности раствора при 280 нм.

К 900 мл полученного раствора с рН 7,5, содержащего 9 г гибридного белка, прибавляют свежеприготовленный раствор 4,5 мг трипсина в соляной кислоте, раствор, содержащий 2,25 мг карбоксипептидазы Б (в массовом соотношении 4000: 2:1) и перемешивают на магнитной мешалке при температуре 37^oС в течение 1 ч. По окончании реакции гидролиз останавливают подкислением раствора соляной кислотой до рН 3,0. Степень гидролиза гибридного белка составляет не менее 95%. Содержание инсулина в реакционной среде по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,3 г.

К подкисленному раствору гидролизата гибридного белка прибавляют хлористый натрий до концентрации 2М, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют при 25000 g. Супернатант сливают, а осадок передают на следующую стадию очистки.

Осадок белка, содержащий 2,3 г инсулина, растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, прибавляют хлористый натрий до концентрации 1 М и доводят рН раствора до значения 6,1. Опалесцирующий раствор центрифугируют и супернатант наносят на колонку размером 5/60 см, содержащую 0,8 л Butyl-Toyopearl 650, предварительно уравновешенную 10 мМ нитратным буфером с 1 М хлоридом натрия, рН 6,1. Сорбент промывают исходным буферным раствором, затем этим же буфером в условиях линейно понижающейся концентрации хлористого натрия от 1 до 0 М и 10 мМ цитратным буфером с рН 6,1. Инсулин элюируют линейным градиентом этилового спирта от 0 до 25% в 10 мМ цитратном буфере. Собранные фракции белкового раствора анализируют методом ОФ ВЭЖХ. Фракции, содержащие инсулин с чистотой не менее 98% (1,05 г), объединяют и передают на дальнейшую очистку. Белковые фракции, содержащие инсулин с более высоким содержанием примесей, объединяют и направляют на дополнительную очистку.

Раствор, содержащий 1,05 г инсулина, смешивают с равным количеством раствора 4 М хлористого натрия в 10 мМ лимонной кислоте, выдерживают при перемешивании в холодильнике в течение 2 ч, центрифугируют 20 мин при 20 000 g. Полученный осадок растворяют в 0,5 М уксусной кислоте, фильтруют и передают на гель-фильтрацию. Гель-фильтрацию раствора инсулина проводят на колонке размером 5/100 см, содержащей 1,7 л сефадекса G-50 SF SG, предварительно уравновешенного 0,5 М раствором уксусной кислоты. Полученные фракции анализируют методом эксклюзионной ВЭЖХ и объединяют фракции, содержащие инсулин без высоко- и низкомолекулярных примесей. Выход инсулина на данной стадии составляет 0,9 г.

К 200 мл раствора инсулина в 0,5 М уксусной кислоте, содержащего 0,9 г инсулина, добавляют ацетат цинка до концентрации 0,05 М, доводят значение рН до 6,0 концентрированным раствором аммиака. Суспензию перемешивают на магнитной мешалке при 4^oС в течение 2 ч, после чего центрифугируют при 20000 g в течение 15 мин. Супернатант сливают, а осадок промывают апирогенной водой и вновь центрифугируют. Осадок инсулина растворяют в 60 мМ лимонной кислоте с концентрацией 4 мг/мл. Полученный раствор подвергают стерильной фильтрации, добавляют этиловый спирт до общей концентрации 15% и 3,5 мл 5%-ного раствора хлористого цинка, после чего значение рН доводят 6,2. Слегка опалесцирующий раствор оставляют медленно перемешиваться при 4^oС в течение 4 ч, затем центрифугируют при 5000 g в течение 15 мин. Супернатант сливают, осадок последовательно промывают апирогенной водой (дважды), этиловым спиртом и абсолютным этиловым спиртом (дважды). Кристаллы высушивают в вакуумном сушильном шкафу.

Выход кристаллического инсулина составляет 0,8 г.

Пример 2.

Культивирование клеток штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07 проводят следующим образом.

Для получения иннокулята питательную среду на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в ферментере объемом 10 л. Полученный посевной материал используют для засева ферментера объемом 100 л. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 30 ОЕ, проводя индукцию синтеза гибридного белка изопропилтио-β-D-галактопиранозидом.

После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием, разрушают на дезинтеграторе Гаулина и выделяют центрифугированием тельца включения.

250 г телец включения подвергают отмывке водой и 50 мМ трис-НСl при рН 9,0. Для этого тельца включения суспендируют в воде при массовом соотношении телец и воды 1:20 при перемешивании в течение 30 мин. Затем суспензию центрифугируют при 25000 g в течение 30 мин, супернатант сливают, а осадок отмывают в 50 мМ трис-HCl.

Полученные тельца включения растворяют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl, 8,0 М мочевину, 1 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl, 5 мМ дитиотреитол, при рН 8,0. Реакцию проводят в течение 7 ч при температуре 20^oС. Нерастворившийся материал отделяют центрифугированием при 25000 g в течение 30 мин.

Суммарное содержание белка, определяемое методом Лоури, составляет 25 г, содержание гибридного белка по данным SDS электрофореза 50%.

Супернатант, содержащий, восстановленный гибридный белок, разбавляют 25 мМ Na-глициновым буфером, рН 10,0, охлажденным до 9^oС так, чтобы концентрация общего белка составила 0,8 мг/мл. Раствор выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение 72 ч.

Очистку гибридного белка проводят хроматографией на SP-сефарозе FF.

На колонку диаметром 113 мм, содержащую 1,5 л SP-сефарозы FF, уравновешенную 25 мМ трис-НСl-буфером с рН 7,5, наносят раствор ренатурированного гибридного белка с рН 7,5. Сорбированный белок элюируют с колонки градиентом соли от 0 до 0,7 М хлористого натрия в исходном буфере. Фракции, содержащие гибридный белок, объединяют и используют для получения субстанции инсулина. Выход ренатурированного гибридного белка со степенью чистоты 93-96% составляет 8,1 г.

Содержание гибридного белка определяют по величине оптической плотности раствора при 280 нм.

К 800 мл полученного раствора, содержащего 8,1 г гибридного белка (рН раствора 7,5), прибавляют свежеприготовленный раствор 2,025 мг трипсина в соляной кислоте, раствор, содержащий 2,025 мг карбоксипептидазы Б (в массовом соотношении 4000:1:1). Через 2 ч гидролиз останавливают подкислением раствора соляной кислотой до рН 3,0. Степень гидролиза гибридного белка составляет не менее 95%. Содержание инсулина в реакционной среде по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,1 г.

К подкисленному раствору гидролизата гибридного белка прибавляют хлористый натрий до концентрации 2М, перемешивают в течение 30 мин при 20^oС и центрифугируют 25 мин при 25000 g. Супернатант сливают, а осадок передают на следующую стадию очистки.

Осадок белка, содержащий 2,1 г инсулина, растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, добавляют хлористый натрий до концентрации 1 М и доводят рН раствора до значения 6,5. Опалесцирующий раствор центрифугируют и супернатант наносят на колонку размером 5/60 см, содержащую 0,8 л Butyl-Toyopearl 650, предварительно уравновешенную 10 мМ цитратным буфером с 1 М хлоридом натрия, рН 6,5. Сорбент промывают исходным буферным раствором до выхода самописца на базовую линию со скоростью элюции 25 см/ч, затем этим же буфером в условиях линейно понижающейся концентрации хлористого натрия от 1 до 0 М и 10 мМ цитратным буфером, рН 6,5. Сорбированный материал элюируют линейным градиентом этилового спирта от 0 до 20% в 10 мМ цитратном буфере. Фракции белкового раствора анализируют методом ОФ ВЭЖХ. Фракции, содержащие инсулин с чистотой не менее 98%, объединяют и передают на дальнейшую очистку. Выход инсулина 0,95 г. Белковые фракции, содержащие инсулин с более высоким содержанием примесей, объединяют и направляют на дополнительную очистку.

Раствор, содержащий 0,95 г инсулина, смешивают с равным количеством раствора 4 М хлористого натрия в 10 мМ лимонной кислоте, выдерживают при перемешивании в холодильнике в течение 2 ч, центрифугируют 20 мин при 20000 g. Полученный осадок растворяют в 1,0 М растворе уксусной кислоты, фильтруют и передают на гель-фильтрацию. Гель-фильтрацию раствора инсулина проводят на колонке размером 5/100 см, содержащей 1,7 л сефадекса G-50 SF SG, предварительно уравновешенного 1,0 М раствором уксусной кислоты. Нанесение раствора инсулина и элюцию проводят со скоростью 10 см/ч. Полученные фракции анализируют методом эксклюзионной ВЭЖХ и объединяют фракции, содержащие инсулин с минимальным содержанием высоко- и низкомолекулярных примесей. Выход инсулина на данной стадии составляет 0,8 г.

К 250 мл раствора инсулина в 0,5 М уксусной кислоте, содержащего 0,8 г инсулина, добавляют ацетат цинка до концентрации 0,1 М, доводят значение рН до 6,0 концентрированным раствором аммиака. Суспензию перемешивают на магнитной мешалке при 6^oС в течение 2 ч, после чего центрифугируют при 20000 g в течение 15 мин. Супернатант сливают, а осадок промывают апирогенной водой и вновь центрифугируют. Осадок инсулина растворяют в 60 мМ лимонной кислоте с концентрацией 3,5 мг/мл. Полученный раствор подвергают стерильной фильтрации, добавляют этиловый спирт до общей концентрации 14,7% и 3,0 мл 5%-ного раствора хлористого цинка, после чего значение рН доводят до 6,4. Слегка опалесцирующий раствор оставляют медленно перемешиваться на магнитной мешалке при 6^oС в течение 4 ч, затем центрифугируют при 5000 g в течение 15 мин. Супернатант сливают, осадок последовательно промывают апирогенной водой (дважды), этиловым спиртом и абсолютным этиловым спиртом (дважды). Кристаллы высушивают в вакуумном сушильном шкафу.

Выход кристаллического инсулина составляет 0,7 г.