Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER-2/neu

Изобретение относится к медицине, онкологии и фармакологии и может быть использовано для получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER-2/neu.

Основным радиоизотопом в диагностике с применением радиофармацевтических препаратов является изотоп технеция-99м, имеющий оптимальные период полураспада (6 часов) и тип излучения (γ-излучение, энергия 140 кэВ). Одним из наиболее изученных и часто упоминаемых в литературе опухолевых антигенов является поверхностный рецептор HER2/neu, который гиперэкспрессирован во многих человеческих карциномах (рак молочной железы, легких, желудка, яичников, простаты). К этому антигену разработан ряд моноклональных антител, пригодных для применения в диагностических и терапевтических целях. Альтернативой адресным антителам и их фрагментам являются рекомбинантные адресные молекулы белковой природы с антикириновыми повторами (DARPin), являющиеся специфичными к раковоассоциированному антигену HER2/neu [1-3].

Известны некоторые методы мечения адресных молекул белковой природы (в том числе антител, их фрагментов, аффибоди и DARPin) радионуклидом технецием-99м. Наиболее эффективным считается мечение при получение высокостабильных комплексов технеция-99м с адресными молекулами, содержащими хелатные центры для связывания металлов, которые способны образовывать достаточно прочные координационные связи. Поэтому главным в разработке таких радиофармпрепаратов является подбор условий радиохимического синтеза для образования прочного комплекса с технецием-99м, устойчивого к диссоциации в крови и имеющего высокий выход. Перспективным комплексом для радиомечения белковых молекул является аквакарбонильный технеций [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺, способный образовывать прочные, стабильные комплексы с высокими выходами с белковыми молекулами, имеющими хелатные центры для ^99mTc(СО)₃- кора [4, 5].

Адресные молекулы DARPin имеют в своей структуре гексагистидиновый фрагмент, способный прочно связывать аквакарбонильный технеций, а также в структуру DARPin возможно успешное введение тридентантного хелатирующего агента на основе ω-бис(пиридин-2-илметил)амино)алифатических кислот, прочно связывающих авкакарбонильный технеций [6].

Таким образом, разработка способа получения стабильного комплекса на основе аквакарбонильного технеция-99м и адресных молекул DARPin для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER-2/neu является актуальной.

Известен способ получения карбонильных комплексов короткоживущих технеция (I) и рения (I). Карбонильные комплексы короткоживущих технеция (I) и рения (I) общей формулы [Ме(СО)₃(H₂O)₃]⁺, где Me=^99mTc или ¹⁸⁶Re, получают в одну стадию. Пертехнетат или перренат калия обрабатывают карбонилирующим агентом в присутствии галогенводородной кислоты при температуре 200-220°С и давлении 100-160 атм. Недостатком данного способа является применении высокой температуры и высокого давления, что делает его недоступным для применения в клиниках. И в способе не предложены условия для мечения адресных молекул белковой природы [7].

Известен способ получения водорастворимого карбонильного комплекса короткоживущего технеция-99м, включающего обработку пертехнетата калия K^99mTcO₄ карбонилирующим агентом в водном растворе при температуре 140-180°С и давлении 90-170 атм в течение 30-40 мин. Карбонилирование осуществляют в присутствии иодида натрия или иодида калия и хлорной или серной кислот, а образующийся газообразный пентакарбонилиодид технеция-99м улавливают водным или водно-спиртовым раствором в приемную емкость. Данный способ также отличается применением условий (температура и давление), непригодных для рутинного получения РФП в клинике, и также способ не затрагивает условия для мечения адресных молекул белковой природы [8].

Описан способ получения комплекса [^99mTc(CO)₃]⁺-G3DARPin-His₆, который характеризуется в 3,5 раза выше уровнем поглощения в опухолевых клетках с гиперэкспрессией HER2/neu по сравнению с HER2/neu- отрицательными клетками in vivo [9]. Однако, недостатком этого комплекса является то, что комплекс [^99mTc(СО)₃]⁺-G3DARPin-His₆ в организме не показал оптимальное соотношение опухоль-печень и опухоль-кровь. В данном способе получения используют прямое связывание аквакарбонильного комплекса технеция-99м ([^99mTc(СО)₃]⁺) с G3DARPin-His₆, используя наборы IsoLinc (Mallinckrodt- Tyco Med), являющиеся труднодоступными на территории России.

Известен способ получения соединения общей формулы: -[М(СО)₃(ОН₂)₃]⁺, где М представляет собой Mn, ^99mTc, ¹⁸⁶Re или ¹⁸⁸Re, путем взаимодействия металла в перметаллатной форме с монооксидом углерода и восстановителем, отличающийся смесью оснований (в т.ч. и натрия карбонат), восстанавливающего агента (в т.ч. натрия боргидрида), растворимого в воде, и, необязательно, стабилизирующего агента (в т.ч. и калия натрия тартрат или натрия цитрат), содержащей раствор металла в перманганате, пертехетате или перренате в присутствии монооксида углерода и, необязательно, в присутствии галогенида [10]. Также в этом патенте раскрыт способ получения меченого соединения с помощью соединения Fac-[М(СО)₃(ОН₂)₃]⁺, способ прямого получения меченых соединений и способ мечения субстратов, таких как аминокислоты, пептиды, белки, сахара. Способ мечения в данном патенте не предлагается для адресной молекулы DARPin непосредственно или через хелатирующий агент тридентантный лиганд. Способ получения аквакарбонильного технеция основан на применении токсичного газа монооксида углерода, что является неудобным для производства РФП в клинике.

Наиболее близким к предлагаемому можно считать способ получения комплекса [^99mTc(CO)₃]⁺-DARPin, который заключается в прямом связывании [^99mTc(СО)₃]⁺ с DARPin [11]. В патенте предложен способ получения терапевтического радиоконъюгата, специфически связывающегося вещества с короткоживущим альфа-излучающим радиоизотопом для его доставки в патологические области, при этом осуществляют мечение рекомбинантных гуманизированных мини-антител, специфичных к раковоассоциированному антигену HER2/neu, диагностическим гамма-излучающим радиоизотопом, а именно аквакарбонильным комплексом Тс-99м, проводят конъюгирование мини-антител с человеческим сывороточным альбумином, очищают полученный конъюгат, вводят в состав конъюгата хелатирующий агент DOTA (1,4,7,10-тетраазициклододекан тетрауксусной кислоты) или DTPA (диэтилен триамин пентауксусной кислоты), проводят мечение полученного конъюгата терапевтическими радиоизотопами, а именно короткоживущими альфа-излучающими радиоизотопами, и очищают полученный препарат.

В указанном способе используют для получения аквакарбонильного комплекса Тс-99m смесь 0,004 г (0,038 ммоль) Na₂CO₃ и 0,005 г (0,13 ммоль) NaBH₄ в пробирке объемом 8 мл с завинчивающейся крышкой с резиновой прокладкой насыщают в течение 10 мин СО. Затем шприцом добавляют 3 мл элюата с молибденового генератора, содержащего до 30 GBq Na[^99mTcO₄] в 0,9% водном растворе NaCl, и выдерживают при температуре 75°С в течение 30 мин. Охлаждают и добавляют 0,3 мл 1М фосфата натрия, рН 7.4.

К 50 мкл миниантител (концентрация 2 мг/мл) в буфере PBS (7 мМ NaH₂PO₄, 3 мМ Na₂HPO₄, 350 мМ NaCl, рН 7.4) добавляют 25 мкл 0,5 М MES рН 6.2 и 25 мкл полученного раствора [^99mTc(СО)₃(ОН₂)₃]⁺ (~0.25 GBq) и инкубируют 30 мин при 37°С. Аквакарбонильный комплекс Тс-99m специфически связывается с олигогистидиновым фрагментом миниантител. Для очистки миниантител, меченных аквакарбонильным комплексом Тс-99m, от несвязавшегося радиоизотопа проводят гель-фильтрацию на колонке с Superdex-75 в буфере PBS.

Недостатками этого способа является необходимость применение токсичного газа СО в баллоне, которым необходимо насыщать флакон в течение 10 мин, также в патенте не указаны радиохимический выход и чистота для оценки эффективности предлагаемого способа в заявленных условиях.

Новая техническая задача - повышение селективности способа, повышение выходов продуктов и повышение универсальности при упрощении способа.

Для решения поставленной задачи в способе получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER-2/neu, включающем получение комплекса с аквакарбонильным технецием-99м с адресными молекулами DARPin, на первой стадии получают аквакарбонильный технеций-99м [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺, используя лиофилизат натрия тетрабората декагидрата, натрия карбоната, динатрия боранокарбоната, который также может содержать калия натрия тартрата тетрагидрата или натрия цитрата моногидрат, далее, к лиофилизату добавляют 1-3 мл раствора натрия пертехнетата, ^99mTc с активностью 0,74-3,7 ГБк и нагревают на кипящей водяной бане 20-30 мин, охлаждают до комнатной температуры и добавляют 1М HCl до рН 7,4 или 300-900 мкл 1М раствора натрия фосфата с рН 7,4, на второй стадии проводят присоединение хелатирующего агента сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноат (DPAH) к DARPin в фосфатном буфере (рН=8,3-8,5) (DPAH-DARPin), на третьей стадии проводят связывание аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺ с DARPin или DPAH-DARPin, для чего к DARpin или DPAH-DARPin в количестве 100 мкг в фосфатно-буферном растворе при рН=7,4 добавляют 1 мл раствора аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺, далее инкубируют при 40°С в течение 30-60 мин, очистку проводят гель-фильтрацией на колонке NAP-5 или аналогичной.

Получают комплекс технеция-99м с DARpin или DPAH-DARPin с радиохимической чистотой более 99,0%.

Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не очевидные для специалиста.

Предлагаемая совокупность признаков не описана в патентной и научно-технической литературе.

Проведена апробация способа с последующей идентификацией полученных продуктов.

Далее приведены примеры конкретных способов получения

Пример 1. Получение аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺

Во флакон вместимостью около 10 мл, содержащий лиофилизат 3,0 мг натрия тетрабората декагидрата, 8,0 мг натрия карбоната, 5,0 мг динатрия боранокарбоната, добавляли 1 мл раствора натрия пертехнетата, ^99mTc с активностью 0,74-3,7 ГБк и нагревали на кипящей водяной бане 20 мин. Охлаждают и добавляли 300 мкл 1М раствора натрия фосфата (рН 7,4). Радиохимическую чистоту (РХЧ) полученного комплекса оценивали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием пластинок ПТСХ-АФ-А-УФ (Sorbfil) в системе МеОН/HCl, (95:5), R_f=0,37. РХЧ полученного комплекса составляла ≥95%.

Пример 2. Получение аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺

Получение проводили по методике, описанной в примере 1 с тем отличием, что лиофилизат содержал также 9,0 мг калия натрия тартрата тетрагидрата. РХЧ полученного комплекса составляа ≥95%.

Пример 3. Получение аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺

Получение проводили по методике, описанной в примере 1 с тем отличием, что лиофилизат содержал также 9,0 мг натрия цитрата моногидрат. РХЧ полученного комплекса составляла ≥95%.

Пример 4. Методика синтеза сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноата (DPAH-NHS-ester)

Синтез проводят как описано в патенте [6], используя циклогексанон. На последней стадии проводят активацию 6-(ди(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты. Для этого в круглодонной колбе к смеси 6-(ди(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты (в виде соли гидрохлорида) (1,200 г, 3,48 ммоль) в 6 мл тетрагидрофурана добавляют триэтиламин (0,510 мл, 3,48 ммоль) и далее смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляли N-гидроксисукцинимид (0,474 г, 4,2 ммоль) and N,N-дициклогексилкарбодиимид (0,867 г, 4,2 ммоль). Перемешивают 48 часов при комнатной температуре. Конец реакции определяют методом тонкослойной хроматографии (элюент: этилацетат - этанол = 10:3). На хроматограмме должно быть только одно основное пятно с R_f 0,35. Выпавший осадок N,N-дициклогексилмочевины отфильтровывают. В фильтрате отгоняют тетрагидрофуран, к полученному маслу добавляют 10 мл воды и экстрагировали метиленхлоридом (3×15 мл). Метиленхлоридное извлечение сушат над безводным натрия сульфатом и растворитель отгоняют.

Полученный продукт подвергают очистке методом колоночной хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента смесь гексан - этилацетат (1:1) постепенно повышая градиент последнего. Полученную светло-желтую маслообразную массу сушат под вакуумом. Ориентировочная масса промежуточного продукта сукцинимид-1-ил 6-(ди(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата (DPAH-NHS-ester) составляет 0,874 г (62%).

Пример 5. Методика модификации DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом

К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 6 мг/мл) в 100 ммоль PBS, рН 8,0-8,5 добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ацетонитриле (80-100 мкг). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированного продукта DPAH-DARPin проводят гель-фильтрацией, используя колонки PD MiniTrap G-25 (GE Healthcare), калиброванные буфером, согласно инструкции производителя.

Пример 6. Методика мечения аквакарбонильным технецием-99м [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺ адресных молекул DARPin

К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (100 ммоль PBS, 350 ммоль NaCl, рН=7,4) добавляют 1 мл раствора аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺, полученного по примеру 1. Пробу перемешивают и инкубируют 30 мин при 40°С. Очистку проводят гель-фильтрацией на колонке NAP-5 согласно инструкции производителя. РХЧ полученного комплекса составляет 99,6%.

Пример 7. Методика мечения аквакарбонильным технецием-99м [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺ адресных молекул DARPin

Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 6 с тем отличием, что добавляют 1 мл раствора аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺, полученного по примеру

2. РХЧ полученного комплекса составляет 99,8%.

Пример 8. Методика мечения аквакарбонильным технецием-99м [^99mTc(H₂O)₃(СО)₃]⁺ адресных молекул DARPin

Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 6 с тем отличием, что добавляют 1 мл раствора аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃], полученного по примеру

3. РХЧ полученного комплекса составляет 99,8%.

Пример 9. Методика мечения аквакарбонильным технецием-99м [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ адресных молекул DARPin

Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 6 с тем отличием, что добавляют 1 мл раствора аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺, полученного по примеру 2. Пробу перемешивают и инкубируют 20 мин при 40°С. Очистку проводят гель-фильтрацией на колонке NAP-5 согласно инструкции производителя. РХЧ полученного комплекса составляет 99,7%.

Пример 10. Методика мечения аквакарбонильным технецием-99м [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ адресных молекул DARPin

Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 9 с тем отличием, что пробу перемешивают и инкубируют 40 мин при 40°С. РХЧ полученного комплекса составляет 99,8%.

Пример 11. Методика мечения аквакарбонильным технецием-99м [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ адресных молекул DARPin

Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 9 с тем отличием, что пробу перемешивают и инкубируют 60 мин при 40°С. РХЧ полученного комплекса составляет 99,8%.

Пример 12. Методика мечения аквакарбонильным технецием-99м [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ адресных молекул DARPin, модифицированных хелатирующим агентом DPAH-NHS-ester К 100 мкл раствора DPAH-DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (100 ммоль PBS, 350 ммоль NaCl, рН=7,4) добавляют 1 мл раствора аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺, полученного по примеру 2. Пробу перемешивают и инкубируют 30 мин при 40°С. Очистку проводят гель-фильтрацией на колонке NAP-5 согласно инструкции производителя. РХЧ полученного комплекса составляет 99,6%.

Обоснование режима

Получение аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ возможно проводить в присутствии со-лиганда, стабилизирующего [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺. В качестве со-лигандов применяли калия натрия тартрат или натрия цитрат (примеры 1-3). Во всех случаях наблюдали выходы [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ более 95%.

Мечение адресных молекул DARPin предложено проводить прямым и непрямым методом. В прямом методе мечения DARPin используют способ получения [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ без стабилизирующего со-лиганда (пример 6). РХЧ полученного комплекса [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ с DARPin составляет 99,6%. Радиохимический выход более 80% до очистки. В непрямом методе мечения DARPin используют способ получения [^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ в присутствии стабилизирующего со-лиганда (примеры 7-8). РХЧ полученного комплекса ^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ с DARPin составляет 99,8%. Радиохимический выход более 85% до очистки. Реакцию мечения ^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ с DARPin предложено проводить 20-60 мин при 40°С (примеры 6, 9, 10). Во всех случаях радиохимический выход более 80% до очистки. РХЧ полученного комплекса ^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ с DARPin составляет 99,8%. Также показана возможность применения хелатирующего агента DPAH-NHS-ester для модификации DARPin, при этом мечение модифицированных DARPin - DPAH-DARPin показало высокие выходы и РХЧ. Радиохимический выход комплекса ^99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]⁺ с DPAH-DARPin около 90% до очистки, РХЧ полученного комплекса составляет 99,6%.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:

1) DARPins: A new generation of protein Therapeutics / Michael T. Stumpp, H. Kaspar Binz and Patrick Amstutz // Drug Discovery Today. Volume 13, Numbers 15/16. August 2008. P. 695-701.

2) Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin)G3 for HER2 molecular imaging / Robert Goldstein, Jane Sosabowski, Maria Livanos, Julius Leyton, Kim Vigor, Gaurav Bhavsar, Gabriela Nagy-Davidescu, Mohammed Rashid, Enrique Miranda, Jenny Yeung, Berend Tolner, Andreas Pluckthun, Stephen Mather, Tim Meyer, Kerry Chester // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2015) 42:288-301.

3) Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения / С.М. Деев, Е.Н. Лебеденко // Acta naturae. №1 2009 С. 32-50.

4) Synthesis and Properties of Boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(Н₂О)₃(СО)₃]+ / Alberto, R. et al.,. // J. Am. Chem. Soc. 2001, 123 (13), 3135-3136.

5) Waibel, R. et al., Stable one-step technetium-99m labeling of His-tagged recombinant proteins with a novel Tc(I)- carbonyl complex. Nat. Biotechnol. 1999, 17 (9), 897-901.

6) Патент №2616974, 19.04.2017. Юсубов M.C., Ларькина M.C., Подрезова Е.В., Стасюк Е.С., Скуридин B.C. Способ получения ω-бис(пиридин-2-илметил)амино)алифатических кислот - прекурсоров с хелатными центрами для связывания металлов.

7) Патент 2125017, 02.07.1997. Способ получения водорастворимых карбонильных комплексов короткоживущих технеция (I) и рения (I) / Горшков Н.И., Лумпов А.А., Мирославов А.Е., Суглобов Д.Н.

8) Патент №2294897, 28.02.2005. Способ получения водорастворимого карбонильного комплекса короткоживущего технеция-99m / Лумпов А.А., Горшков Н.И., Суглобов Д.Н., Мирославов А.Е.

9) Hofstrom С, Altai M, Honarvar H, Strand J, Malmberg J, Hosseinimehr SJ, et al. HAHAHA, HEHEHE, HIHIHI, or HKHKHK: influence of position and composition of histidine containing tags on biodistribution of [(99m)Tc(CO)3](+)-labeled affibody molecules. J Med Chem. 2013; 56: 4966-74.

10) Patent NZ 337303 (A), 22.12.2000. Method for the preparation of facial metal tricarbonyl compounds and their use in the labelling of biologically active substrates / Alberto Roger, Schibli Roger, Egli Andre.

11) Патент 2537175. Способ получения радиоиммунного препарата для диагностики и терапии онкологических заболеваний / Чувилин Д.Ю., Загрядский В.А., Дубинкин Д.О., Бочагин Ф.С., Панченко В.Я., Деев С.М., Головаченко В.А., Решетов И.В.