СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИАГРЕГАНТНОЙ, УМЕНЬШАЮЩЕЙ ПОВЫШЕННУЮ ВЯЗКОСТЬ КРОВИ И АНТИТРОМБОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, обладающих антирадикальной, гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью.

Известны средства, обладающие антиоксидантной активностью - аскорбиновая кислота, токоферола ацетат, β-каротин [1], эмоксипин [2] и ионол [3]. Наиболее близким соединением (прототипом) является ионол (4-метил-2,6-диизобутилфенол), который относится к пространственно-затрудненным фенолам и обладает выраженной антиоксидантной активностью.

Известны средства, обладающие гемореологической активностью - пентоксифиллин, дигидрокверцетин, танакан [2, 4, 5, 6]. Известны средства, обладающие антитромбоцитарной активностью - пентоксифилин, ацетилсалициловая кислота, тиклопидин, дипиридамол [4, 7]. Известны средства, обладающие антитромбогенной активностью, - пентоксифиллин, ингибиторы циклооксигеназы и аскорбиновая кислота [8, 9, 10].

По этим трем видам активности наиболее близким (прототипом) является пентоксифиллин, обладающий гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью [4, 11, 12].

Задачей изобретения является расширение номенклатуры средств, обладающих антиоксидантной, гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью.

Поставленная задача решается использованием (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан в качестве антиоксидантного, гемореологического, антитромбоцитарного и антитромбогенного средства.

Использование (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана в качестве антиоксидантных, гемореологических, антитромбоцитарных и антитромбогенных средств в литературе не описано.

Ранее данное вещество не использовалось.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является то, что в качестве антиоксидантного, гемореологического, антитромбоцитарного и антитромбогенного средства используется (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан. Данные виды активности соединения явным образом не вытекают для специалиста из уровня техники. (3,5-Диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан можно использовать для лечения больных с сердечно-сосудистыми и другими заболеваниями для уменьшения повышенной вязкости крови, спонтанной агрегации эритроцитов, а также снижения агрегационной способности тромбоцитов и внутрисосудистого тромбообразования.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".

Новые свойства (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям.

Одной из главных характеристик антиоксидантной активности соединения является константа скорости его взаимодействия с пероксидными радикалами k₇ (антирадикальная активность). Антирадикальную активность (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана в сравнении с ионолом изучали в модельной реакции инициированного азо-бмс-изобутиронитрилом (АИБН, Acros Organics) окисления стирола в хлорбензоле при 50°С с использованием методики, описанной ранее в работах [13, 14, 15].

Скорость окисления стирола измеряли по поглощению кислорода с помощью высокочувствительного капиллярного волюмометра. Период индукции определяли как точку пересечения двух касательных к кинетической кривой, тангенсы углов наклона которых составляют 0.5 и 0.75 от тангенса угла наклона прямой неингибированной реакции [14].

Проводили окисление стирола в присутствии добавки (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана или ионола. По экспериментально полученным данным строили кривую зависимости количества поглощенного кислорода [O₂] от времени t, по которой графически определяли величину периода индукции. Затем строили анаморфозу начального участка кинетической кривой в координатах зависимости [O₂]/[RH] от -ln(1-t/τ), из тангенса угла наклона которой (tgβ) определяли отношение k₂/k₇. Абсолютное значение константы скорости k₇ вычисляли, принимая, что при окислении стирола константа скорости продолжения цепей окисления k₂ равна 107.7 М^-1·с^-1 [15]. Измерения проводили в 3-5-кратной повторности.

Среднее значение величины константы скорости k₇ приводится со среднеквадратичной ошибкой.

Рабочие концентрации компонентов в пробе составляли: исследуемого соединения 2.8·10^-4 моль/л, ионола 4.8·10^-4 моль/л, стирола 4.1-6.2 моль/л, [АИБН]=0.07-0.12 моль/л, объем пробы - 0.7 и 2.1 мл.

Эксперименты по изучению гемореологической, антитробоцитарной и антитромбогенной активностей проводили на крысах Вистар.

Эксперименты по изучению гемореологических свойств (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана проводили на 15 крысах-самцах Вистар массой 250-300 г. Животные были разделены на 3 группы: 5 животных получили внутрижелудочно крахмальную слизь (контроль), 5 животных получали внутрижелудочно пентоксифиллин (400 мг/кг) (группа I); 5 животных получили внутрижелудочно (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан (100 мг/кг) (группа II). Соединения и эквиобъемное количество крахмальной слизи (1 мл) вводили внутрижелудочно через зонд за один час до забора крови. Влияние соединений на вязкость крови оценивали с использованием модели гипервязкости крови in vitro. Кровь забирали из общей сонной артерии под эфирным наркозом. В качестве стабилизатора использовали 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении с кровью 1:9. Вязкость крови измеряли на ротационном вискозиметре АКР-2 в диапазоне скоростей сдвига от 5 с^-1 до 300 с^-1 до и после инкубации проб крови при температуре 20,0±0,4°С в течение 60 минут.

В этой же серии экспериментов было исследовано влияние соединений на агрегацию эритроцитов. Спонтанную агрегацию эритроцитов исследовали с помощью метода [16] в нашей модификации [17]. Для установления интенсивности фотометрического сигнала использовали микроколориметр МКМФ-1, с графической регистрацией на графопостроителе Н306. Критерием агрегационной активности эритроцитов служил полупериод агрегации T_1/2 - время, за которое величина фотометрического сигнала снижается в два раза.

Эксперименты по изучению антитромбоцитарной активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана проводили на 15 крысах-самцах Вистар массой 250-280 г. Животные были разделены на 3 группы: 5 животных получили внутрижелудочно крахмальную слизь (контроль), 5 животных получили внутрижелудочно пентоксифиллин (400 мг/кг) (группа III); 5 животных получили внутрижелудочно (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан (100 мг/кг) (группа IV). Соединения и эквиобъемное количество крахмальной слизи (1 мл) вводили внутрижелудочно через зонд за один час до забора крови. Кровь забирали из общей сонной артерии под эфирным наркозом. В качестве стабилизатора использовали 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении с кровью 1:9.

Агрегацию тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме (БТП) определяли нефелометрическим методом по G.V.R. Born [18]. Получение богатой (БТП) и бедной (БеТП) тромбоцитами плазмы и подсчет числа тромбоцитов проводили по стандартному методу [19]. Из проб крови получали БТП и БеТП методом центрифугирования при 400 g и 1800 g соответственно на центрифуге РС-6. В полученной БТП подсчитывали количество тромбоцитов микроскопическим методом при фазовом контрасте в камере Горяева.

Так как в норме число тромбоцитов в крови у крысы колеблется в широких пределах - от 430000 до 1 млн в 1 мм³ - после определения числа тромбоцитов в БТП проводили стандартизацию числа тромбоцитов, для чего БПТ разводили необходимым количеством БеТП до 400±30 тыс. тромбоцитов в 1 мм³ в пробе [20, 21].

Агрегацию тромбоцитов оценивали в стандартизованной плазме на приборе АТ-02, агрегатограммы регистрировали с помощью самописца Recorder 2210.

После добавления индуктора агрегации (АДФ в конечной концентрации 4·10^-6 М) регистрировали изменение уровня оптической плотности БТП. В качестве критерия агрегационной активности тромбоцитов использовали показатель степени агрегации (в %), характеризуемый изменением оптической плотности БТП после добавления в кювету индуктора агрегации. При этом за 100% принимали величину оптической плотности БеТП, а за 0% - величину оптической плотности БТП.

Эксперименты по изучению антитромбогенной активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана проводили на 15 крысах-самцах Вистар массой 220-240 г. Животные были разделены на 3 группы: 5 животных получили внутрижелудочно крахмальную слизь (контроль), 5 животных получили внутрижелудочно пентоксифиллин (400 мг/кг) (группа V); 5 животных получили внутрижелудочно (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан (100 мг/кг) (группа VI). Соединения и эквиобъемное количество крахмальной слизи (1 мл) вводили внутрижелудочно через зонд в течение трех суток. На третьи сутки эксперимента - через 1 час после последнего введения животных наркотизировали (тиопентал натрия в дозе 60 мг/кг внутрибрюшинно), выделяли левую общую сонную артерию и воспроизводили модель внутрисосудистого тромбоза [22]. На отпрепарированную сонную артерию накладывали манжеточные датчики и регистрировали величину кровотока по сосуду с помощью электромагнитного расходомера крови MFV-1100 (Nihon Kohden, Япония). Затем под сонную артерию подкладывали полоску фильтровальной бумаги и полоску полиэтиленовой пленки. Сверху на эту артерию накладывали полоску фильтровальной бумаги, на которую наносили 1 каплю 10% раствора FeCl₂. Измеряли величину кровотока в артерии, время от момента нанесения хлорида железа на левую сонную артерию до полной остановки кровотока в ней (время образования тромба). Кроме того, производили расчет снижения кровотока относительно исходной величины кровотока в процентах. По окончании эксперимента (90 мин) крысам ушивали рану. Через сутки под эфирным наркозом производили изъятие сонной артерии, подверженной воздействию хлорида железа, и гравиметрическим методом оценивали массу тромба.

Статистическую обработку проводили с помощью пакета программного обеспечения "Statistica 6.0". Рассчитывали среднее значение, стандартную ошибку, для выявления межгрупповых различий использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты исследований антирадикальной активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана с использованием методики, описанной выше, представлены в примерах 1-2.

Пример 1. Определение константы скорости взаимодействия (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана с пероксидными радикалами стирола. Определенная величина k₇ составила (11.2±1.3)·10⁴ M^-1·c^-1.

Пример 2. Определение константы скорости взаимодействия ионола с пероксидными радикалами стирола. Определенная величина k₇ составила (2.6±0.6)·10⁴ M^-1·c^-l.

Полученные данные свидетельствуют о наличии у (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана выраженной антирадикальной активности по отношению к пероксидным радикалам стирола, превосходящей таковую у прототипа более чем в 4 раза.

Результаты исследований гемореологической активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана представлены в примерах 3-8.

Пример 3. Инкубирование крови в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С приводило к значимому повышению вязкости крови при скоростях сдвига 5 с^-1, 10 с^-1, 50 с^-1, 100 с^-1 и 300 с^-1 на 31%, 19%, 27%, 26% и 14% соответственно (табл.1, контроль).

Таким образом, на модели гипервязкости крови in vitro в контрольной группе отмечено достоверное возрастание вязкости в широком диапазоне скоростей сдвига.

Пример 4. У опытных крыс в группе I вязкость крови до инкубации была достоверно ниже, чем в контроле, при скоростях сдвига 5, 10 и 50 с^-1 на 9%, 16% и 6% соответственно. Инкубирование крови крыс этой группы в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С приводило к повышению вязкости крови при скоростях сдвига 5 с^-1, 10 с^-1, 50 с^-1, 100 с^-1 и 300 с^-1 на 10%, 14%, 12%, 9% и 7% соответственно. После инкубации вязкость крови при скоростях сдвига 5 с^-1, 10 с^-1, 50 с^-1, 100 с^-1, 300 с^-1 была ниже, чем в контроле, на 24%, 17%, 17%, 15% и 8% соответственно (табл.1, группа I).

Таким образом, пентоксифиллин снижает вязкость крови при низких скоростях сдвига и на модели гипервязкости крови in vitro ограничивает возрастание вязкости крови в широком диапазоне скоростей сдвига.

Пример 5. У опытных крыс в группе II исходные значения вязкости крови при скоростях сдвига 5 с^-1, 10 с^-1, 50 с^-1 были ниже на 11%, 8% и 6% соответственно, чем в контроле. Инкубирование крови крыс этой группы в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С приводило к повышению вязкости крови во всем диапазоне исследуемых скоростей сдвига на 4-10%. После инкубирования вязкость крови крыс группы II была ниже, чем в контроле, при скоростях сдвига 5 с^-1, 10 с^-1, 50 с^-1, 100 с^-1 и 300 с^-1, на 29%, 16%, 18%, 15% и 6% соответственно (табл.1, группа II).

Таким образом, (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан снижает вязкость крови при низких скоростях сдвига на модели гипервязкости крови, in vitro ограничивает возрастание вязкости крови в широком диапазоне скоростей сдвига. Выраженность гемореологической активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана в дозе 100 мг/кг сопоставима с таковой у прототипа - пентоксифиллина в дозе 400 мг/кг.

Пример 6. Полупериод агрегации эритроцитов у крыс контрольной группы составил 18,6±1,1 с. Инкубирование крови в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С приводило к уменьшению полупериода агрегации эритроцитов на 35% (табл.2, контроль).

Таким образом, на модели гипервязкости крови in vitro в контрольной группе установлено уменьшение полупериода агрегации эритроцитов, что свидетельствовало об усилении агрегации эритроцитов.

Пример 7. Полупериод агрегации эритроцитов у крыс группы I составил 19,6±2,1 с. Инкубирование крови в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С не вызывало значимых сдвигов в значении полупериода агрегации эритроцитов. После инкубации полупериод агрегации эритроцитов был выше на 52% по сравнению с показателем контрольной группы (табл.2, группа I).

Таким образом, на модели гипервязкости крови in vitro пентоксифиллин предотвращает усиление агрегации эритроцитов.

Пример 8. Полупериод агрегации эритроцитов у крыс группы II составил 18,9±1,2 с. Инкубирование крови в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С не вызывало существенных сдвигов в значении полупериода агрегации эритроцитов. После инкубации полупериод агрегации эритроцитов был выше на 46% по сравнению с показателем контрольной группы (табл.2, группа II).

Таким образом, на модели гипервязкости крови in vitro (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан ограничивает усиление агрегации эритроцитов. Выраженность антиагрегационного влияния на эритроциты (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана в дозе 100 мг/кг сопоставима с таковым у прототипа - пентоксифиллина в дозе 400 мг/кг.

Результаты исследований антитробоцитарной активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана представлены в примерах 9-11.

Пример 9. В контрольной группе животных амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 28±1% (табл.3, контроль).

Пример 10. После однократного внутрижелудочного введения пентоксифиллина в дозе 400 мг/кг амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизированной плазме составила 19±1%, что на 32% ниже показателя у крыс контрольной группы (табл.3, группа III).

Таким образом, пентоксифиллин в дозе 400 мг/кг внутрижелудочно однократно обладает выраженной антиагрегантной активностью.

Пример 11. После однократного внутрижелудочного введения (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан в дозе 100 мг/кг амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 18±2% (табл.3, группа IV). Амплитуда агрегации тромбоцитов была на 36% ниже, чем в контроле, и была близка к значению показателя у крыс в группе III.

Таким образом, (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан в дозе 100 мг/кг обладает антитромбоцитарной активностью, сравнимой по выраженности с пентоксифиллином в дозе 400 мг/кг.

Результаты исследований антитромбогенной активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана представлены в примерах 12-14.

Пример 12. Значение исходного кровотока у крыс контрольной группы составило 5,0±0,4 мл/мин. После аппликации хлорида железа на поверхность сонной артерии у всех животных происходило полное прекращение кровотока по сосуду. Среднее время полной остановки кровотока до нуля составило 20±2 минуты. Масса тромба, определяемая через сутки после аппликации хлорида железа, составила 1,2±0,2 мг (табл.4, контроль).

Пример 13. У опытных крыс группы V, получавших пентоксифиллин в дозе 400 мг/кг внутрижелудочно 1 раз в день в течение 3-х суток, исходное значение кровотока составило 6,3±0,3 мл/мин. К концу периода наблюдения (90 мин с момента аппликации хлорида железа) происходило снижение кровотока в сонной артерии на 31±12%. На следующие сутки в просвете сонной артерии ни у одного животного тромбов не обнаружено (табл.4, группа V).

Таким образом, пентоксифиллин вызывает повышение кровотока по сравнению с контрольной группой и обладает выраженной антитромбогенной активностью.

Пример 14. У опытных крыс группы VI, получавших (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан в дозе 100 мг/кг внутрижелудочно 1 раз в день в течение 3-х суток, исходное значение кровотока составило 7,1±0,7 мл/мин. К концу периода наблюдения (90 мин с момента аппликации хлорида железа) происходило снижение кровотока в сонной артерии на 16±9%. На следующие сутки в просвете сонной артерии ни у одного животного тромбов не обнаружено (табл.4, группа VI).

Таким образом, (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан вызывает повышение кровотока по сравнению с группой контрольных животных и обладает выраженной антитромбогенной активностью.

Предлагаемое изобретение расширяет арсенал средств, обладающих одновременно антиоксидантной, гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью.

Источники информации

1. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты - М.: Фирма «Слово», 2006. - С.193-196.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - Харьков: Торсинг, 1998. - С.196, 441.

3. Зарудий Ф. С., Гульмутдинов Г.З., Зарудий Р.Ф. и др. 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол (дибунол, ионол, тонарол) классический антиоксидант (обзор) // Хим.-фарм. журнал. - 2001. - Т.35, №3. - С.42-48.

4. Габриэлян Э.С., Акопов С.Э. Клетки крови и кровообращение. - Ереван: Айастан, 1985. - С.326-330.

5. Плотников М.Б., Алиев О.И., Маслов М.Ю. и др. Коррекция синдрома повышенной вязкости крови в условиях ишемии мозга у крыс комплексом диквертина и аскорбиновой кислоты / Эксперим. и клинич. фармакология. - 1999. - №6. - С.45-47.

6. Koltringer P., Eber O., Lind P. et al. Microzirkulationund Viscoelastizitat des Vullblutes unter Gingko biloba extrakt. Eine placebocontrollierte randomisierte Doppelblind-Studie // Perfusion. - 1989. - Bd. 1. - S.28-30.

7. Носаль Р. Современное состояние и перспективы антитромбоцитарной терапии // Словакофарма ревю. - 2000. - №1-2. - С.14-19.

8. Танашян М.М., Домашенко М.А. Трентал при ишемических цереброваскулярных заболеваниях (обзор литературы) // Нервные болезни. - 2005. - №4 - С.21-24.

9. Taddei S., Virdis A., Mattei P. et al. Hypertension causes premature again of endothelial function in humans // Hypertension. - 1997. - Vol.29. - P.736-743.

10. Taddei S., Virdis A., Ghiadoni L. et al. Age-related reduction of NO availability and oxidative stress in humans // Hypertension. - 2001. - Vol.38. - P.274-279.

11. Hedrich H., Schlichting К., Ott M. Changes in blood viscosity due to pentoxifylline // IRCS Med. Sci. - 1976. - Vol.4. - P.368-375.

12. Sinzinger H. Pentoxifylline enhances formation of prostacyclin from rat vascular and renal tissue // Prostaglandins Leucotriens Med. - 1983. - Vol.12. - P.1230-1236.

13. Цепалов В.Ф., Харитонова А.А., Гладышев Г.П., Эмануэль Н.М. Определение констант скорости и коэффициентов ингибирования фенолов-антиоксидантов с помощью модельной цепной реакции. // Кинетика и катализ. - 1977. - №5(18). - С.1261-1267.

14. Цепалов В.Ф. Метод количественного анализа антиоксидантов с помощью модельной реакции инициированного окисления. // Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vivo и in vitro: Сб. науч. статей. - M.: Наука, 1992. - С.16-26.

15. Поздеева Н.Н., Якущенко И.К., Александров А.Л., Денисов В.Т. Механизм тормозящего действия гидрохинона, краун-гидрохинона и его комплексов с солями лития и магния при окислении стирола. // Кинетика и катализ. - 1991. - №6(32). - С.1302-1309.

16. Габриэлян Э.С., Акопов С.Э. Клетки крови и кровообращение. - Ереван: Айастан, 1985. - С.71-78.

17. Плотников М.Б., Алиев О.И., Попель Ф.В. Модификация микроколориметра МКМФ-1 для регистрации агрегации эритроцитов // Клин. лаб. диагностика. - 1995. - №3. - С.457-458.

18. Воrn G.V.R. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature. - 1962. - Vol.194, №4832. - P. 927-929.

19. Баркаган З.С., Момот А.П. Основные методы лабораторной диагностики нарушений системы гемостаза - Барнаул, 1998. - С.10-16.

20. Закревская А.Л. Тромбоциты крыс как модель исследования ингибиторов агрегации // Патологическое функционирование системы гемостаза. - Л., 1990. - С.46-54.

21. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные. - Киев, 1974. - С.200.

22. Максименко А.В., Тищенко Е.Г. Антиоксидантная биотерапия для защиты сосудистой стенки производными супероксиддисмутазы и каталазы // Цитология. - 1999. - Т.41, №9. - С.821-822.