Биологический микрочип для обнаружения опухолевых экзосом в сыворотке крови человека для диагностики колоректального рака

Область техники, к которой относится изобретение (Technical Field)

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и биохимии, в частности, к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу. Предлагаемое изобретение может найти применение в иммунологии, клинической лабораторной диагностике, в диагностике онкологических заболеваний, в том числе колоректального рака.

Уровень техники (Background Art)

Экзосомы это небольшие (40-100 нм) внеклеточные мембранные везикулы, секретируемые практически всеми типами клеток. Образование экзосом является необходимым условием жизнедеятельности многоклеточного организма, т.к. они принимают участие в межклеточных коммуникациях (везикулярный транспорт), позволяющих скоординировать биохимические процессы, протекающие в клетке. В настоящее время определение экзосом в биологических жидкостях (кровь, моча, слюна и т.д.) имеет огромное значение, поскольку они являются носителями маркеров различных заболеваний, в том числе онкологических. Кроме того, экзосомы являются перспективной системой доставки терапевтических агентов [ В. et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. 2011 Cell Mol. Life Sci. 68, 2667-2688].

Формирование экзосом происходит в цитоплазме в составе мультивезикулярных телец. Экзосомы высвобождаются во внеклеточное пространство после слияния мембраны мультивезикулярного тельца и клеточной мембраны [Colombo М, Raposo G, Gery С. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. 2014 Annu Rev Cell Dev Biol. N 30. P. 255-289]. Поскольку опухолевые экзосомы формируются из эндоплазматической мембраны раковой клетки, репертуар имеющихся на их поверхности мембранных белков хорошо коррелирует с репертуаром мембранных белков экспортирующих их опухолевых клеток. Мембрана экзосомы состоит из липидов и содержит трансмембранные белки. Липидная оболочка защищает экзосомы от агрессивных ферментов, поэтому возможность их разрушения при транспортировке и хранении образцов невелика.

Главными белками-маркерами экзосом являются трансмембранные белки-тетраспанины CD9, CD63, CD81 [ ZA, М. Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function. 2014 Front Immunol. 5:442]. Знания о структуре белков экзосом постоянно пополняются и депонируются в базе данных ExoCarta (www.exocarta.org); на сегодняшний день известно о существовании более 9000 экзосомальных белков.

Все большее количество публикаций, свидетельствующих о роли экзосом в органоспецифическом метастазировании рака, подтверждают острую необходимость в создании простых инструментальных методов определения экзосомальных мембранных белковых маркеров в биологических жидкостях [Hoshino A., Costa-Silva В., Shen T.-L., Rodrigues G., Hashimoto A., Mark M.T., Molina H., Kohsaka S., Di Giannatale A., Ceder S., Singh S., Williams C, Soplop N., Uryu K., Pharmer L., King Т., Bojmar L., Davies A. E., Ararso Y., Zhang Т., Zhang H., Hernandez J., Weiss J.a M., Dumont-Cole V. D., Kramer K. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. 2015 Nature 527, 329-335].

Таким образом, анализ белкового состава сывороточных экзосом позволяет заметно увеличить чувствительность диагностики, прогнозирования и мониторинга лечения различных видов опухолей. Дополнительное преимущество in vitro диагностики экзосом - отсутствие болезненной и небезопасной хирургической биопсии тканей, что особенно важно при диагностике сложнодоступных опухолей.

Обобщая вышесказанное, можно утверждать, что создание методов мультиплексного in vitro определения экзосом в биологических жидкостях, в том числе в сыворотке крови, имеет огромную практическую значимость.

В области клинической диагностики разработаны несколько подходов, связанных с анализом содержимого экзосом. Самый распространенный из них - осаждение экзосом при помощи магнитных частиц и выделение микроРНК из содержимого экзосом.

Новейшей разработкой в области in vitro диагностики экзосом является «жидкая биопсия». Например, тест «Prostate Cancer Liquid Biopsy Test» (компания Exosomes Diagnostics (http://www.exosomedx.com, Cambridge, MA 02139)) подразумевает проведение анализа микроРНК экзосом, выделенных из мочи для диагностики рака простаты. Кроме того, компания Exosomes Diagnostics разработала тест для диагностики рака легких «ExoDx Lung(ALK)». Метод основан на выделении и анализе экзосомальной РНК из плазмы крови для выявления мутации EML4-ALK. Эту методику пока нельзя причислить к «рутинному анализу» в клинической практике, т.к. внедрение этого метода задерживается из-за отсутствия стандартного способа выделения экзосом. Эта технологическая проблема активно обсуждается в современной литературе [Zeringer Е, Barta Т, Li М, Vlassov AV. Strategies for isolation of exosomes. 2015 Cold Spring Harb Protoc. N4. P. 319-323]. Существование принципиально различных подходов к выделению экзосом свидетельствует об отсутствии оптимального метода [Livshits М.А., Khomyakova Е., Evtushenko E.G., Lazarev V.N., Kulemin N.A., Semina S.E., Generozov E.V. & Govorun V.M. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. 2015 Nature. Scientific Reports 5:17319]. Применяемые на сегодняшний день методы основаны на специфической характеристике физической плотности или наличии специфических белковых маркеров на поверхности экзосом.

Основной проблемой при in vitro анализе экзосом является гетерогенность их популяции в составе любой биологической жидкости. Наблюдаются различия как в плане физических, так и биохимических характеристик [Jeppesen DK, Hvam ML, Primdahl-Bengtson В, Boysen AT, Whitehead B, Dyrskjot L, Ornto TF, Howard KA, Ostenfeld MS. Comparative analysis of discrete exosome fractions obtained by differential centrifugation. 2014 J Extracell Vesicles. N 3. P. 25011; Tauro BJ, Greening DW, Mathias RA, Mathivanan S, Ji H, Simpson RJ. Two distinct populations of exosomes are released from LIM1863 colon carcinoma cell-derived organoids. 2013 Mol Cell Proteomics. Vol. 12, N 3. P. 587-598]. Кроме того, любая биологическая жидкость, в том числе сыворотка крови и моча, содержит комплексы молекул или субклеточных образований, поэтому ни один из существующих методов выделения экзосом не может гарантировать получения экзосом только определенного вида.

Готовых решений, предлагающих анализ экзосом в сыворотке крови, немного. Группа американских исследователей разработала высокочувствительный аналитический прибор для быстрого изучения микровезикул непосредственно в образцах крови пациентов [Shao Н, Chung J., Balaj L., et al., Lee H. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. 2012 Nat. Med. 18, 1835- 1840]. В основе метода лежит технология микрофлюидного биочипа. Кровь пропускают через специальный аппарат, в котором микровезикулы метят моноклональными антителами против CD63, связанными с магнитными наночастицами, а затем выявляют белковые профили с помощью миниатюрной детекторной системы, использующей ядерный магнитный резонанс.

Еще одним изобретением является патент Российской Федерации №2520741 [Новый способ количественного определения и охарактеризования микровезикул в жидкостях организма человека /WO 2009092386 A new method to measure and characterize microvesicles in the human body fluids. Дата публикации: 27.06.2014]. Описанный в данном патенте тест (ExoTest) - это анализ на базе сэндвич иммуноферментного анализа (ИФА), используемый для количественного и качественного анализа экзосом, полученных из биологических жидкостей человека (плазма крови, сыворотка, моча, слюна) или из супернатанта клеточных культур. Лунки планшета покрыты антителами, специфичными для всех экзосом или для конкретной субпопуляции экзосом. После загрузки в лунки образцов, экзосомы прикрепляются ко дну ячеек за счет иммуноаффинности. Далее они детектируются первичным антителом, которое в свою очередь, связывается с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена. При добавлении субстрата происходит изменение окраски раствора (интенсивность цвета пропорциональна количеству экзосом, находящихся в ячейке). Помимо колориметрического анализа предлагаются также флуоресцентные и люминесцентные тесты. В ExoTest используется антитело против Rab5 для связывания экзосом, присутствующих в очищенных препаратах. В качестве антитела для детекции в ExoTest используется антитело, распознающее либо антиген CD63, либо другие антигены, экспрессируемые клетками-источниками экзосом, такие как кавеолин-1 - белок, ассоциированный с метастазирующим поведением опухолей.

Недостаток данного способа - отсутствие фенотипирования экзосом, поскольку тест является однопараметрическим. Одно антитело используется для связывания экзосом, одно - для детекции. Таким образом, одновременное определение нескольких молекулярных маркеров, представленных на поверхности экзосом, невозможно. Необходимость проведения дополнительных исследований увеличивает стоимость анализа для пациента.

В настоящее время задача проведения многопараметрического анализа при минимальном объеме тестируемого образца решается при использовании биологических микрочипов - массивов элементов, содержащих иммобилизованные биологические зонды (антитела, олигонуклеотиды и т.д.). Создание биочипов позволило осуществить перенос макроварианта иммунохимического анализа в формат микрочипа. Такой подход заменяет несколько индивидуальных ИФА тестов. Использование технологии микрочипов для проведения лабораторных исследований позволяет миниатюризировать и упростить процедуру анализа.

Существует изобретение, позволяющее анализировать экзосомы на микрочипе [патентная заявка WO 2015029979 Exosome analysis method, exosome analysis chip, and exosome analysis device Дата публикации: 05.03.2015]. Согласно описанию, способ состоит из нескольких стадий. На первой стадии происходит контакт образца, содержащего экзосомы, с подложкой (микрочипом), способной селективно связывать липидный бислой мембран. Подложка модифицирована соединениями, имеющими гидрофобную и гидрофильную цепи, что позволяет адсорбировать экзосомы из образца на подложке. Следующей стадией является процесс специфического связывания первой молекулы с соединениями, находящимися на поверхности экзосома. Процесс детекции бинарного комплекса первая молекула-экзосома на подложке происходит за счет специфического связывания с меченой молекулой. Меченая молекула (например, с флуоресцентной или ферментативной меткой) специфически взаимодействует с первой молекулой.

Недостатком данного изобретения является использование неспецифической сорбции для захвата экзосом из образца. Происходит неселективный захват всех экзосом. Поскольку в крови помимо экзосом содержатся различные внеклеточные везикулы, например, такие как микропузырьки или апоптозные тела, велика вероятность того, что эти внеклеточные везикулы также будут адсорбированы на подложке.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) технического решения, составляющего основу настоящего изобретения, можно привести следующее изобретение: патентная заявка WO 2012048372 Assay for disease detection (Дата публикации 19.04.2012). Согласно описанию, анализ для обнаружения заболеваний включает следующие стадии: 1) выделение экзосом из биологического образца; 2) взаимодействие выделенных экзосом с микрочипом, содержащим множество антител или связывающих фрагментов антител; 3) захват экзосом на микрочипе путем связывания экзосом с одним или несколькими из множества антител или связывающих фрагментов антител; 4) обработка захваченных экзосом меченым агентом для выбранного маркера на поверхности экзосом. указывающего на их клеточное происхождение; 5) обнаружение подмножества экзосом, имеющих выбранный маркер; 6) идентификация репертуара связавшихся белков на поверхности экзосом, который является показателем заболевания. В предпочтительной форме, белковый маркер является частью конкретной сигнатуры заболевания, например, сердечно-сосудистых заболеваний или диабета. В частном случае, для колоректального рака, опухолевый маркер выбирают из ЕрСАМ (эпителиальная молекула клеточной адгезии), CEA (раково-эмбриональный антиген) или А33.

В описанном техническом решении экзосомы выделяют из биологического образца методом ультрацентрифугирования, аффинной очистки или осаждения. Для анализа используют двумерные микрочипы DotScan™ с иммобилизоваными антителами к CD-белкам (или других поверхностным белкам), которые связываются с соответствующими CD антигенами (или другими поверхностными белками) на поверхности экзосом. Предпочтительно, массив антител включает в себя десять или более антител на твердой подложке. В качестве твердой подложки может быть использован любой подходящий материал, такой как стекло, пластик, микропористый кремний, целлюлоза, керамический материал, нитроцеллюлоза и др.

Недостатками прототипа являются: 1) необходимость предварительного выделения экзосом из биологического образца; 2) использование двумерных микрочипов.

Добавление этапа предварительного выделения экзосом из биологических жидкостей делает проведение анализа трудоемким, требует привлечения высококвалифицированного персонала, увеличивает время и стоимость анализа, при этом необходимы большие объемы биологических образцов.

Недостатками двумерных микрочипов, в которых антитела или антигены закреплены непосредственно на поверхности носителя, являются низкая и неконтролируемая эффективность иммобилизации, низкая иммобилизационная емкость, наличие контакта иммобилизованных соединений с гидрофобной поверхностью носителя, что может приводить к потере биологической активности зондов белковой природы.

Таким образом, исходя из уровня техники, существует потребность в создании трехмерного биологического микрочипа и разработки способа детекции опухолевых экзосом непосредственно в сыворотке крови, лишенных указанных выше недостатков.

Раскрытие сущности изобретения (Disclosure of Invention)

Задачами настоящего изобретения являются: 1) создание биологического микрочипа для обнаружения экзосом в сыворотке крови человека с целью диагностики колоректального рака; 2) разработка способа детекции экзосом в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе.

Первая техническая задача решается за счет того, что создан биологический микрочип, представляющий собой массив трехмерных гидрогелевых элементов, сформированных на подложке методом фото- или химически индуцируемой полимеризации и содержащих одинаковые или различные по своей природе биологические молекулы (лиганды). Биологический микрочип может одновременно содержать элементы с иммобилизованными антителами против белков, представленных на поверхности экзосом, ассоциированных с колоректальным раком, и, при необходимости, дополнительно элементы, содержащие иммобилизованные антитела против мембранных белков тетраспанинов, относящихся к соответствующим CD антигенам, являющихся молекулярными маркерами экзосом. Также биологический микрочип содержит пустые гелевые элементы, не содержащие иммобилизованных зондов, для контроля неспецифических взаимодействий.

Существенные признаки, характеризующие биологический микрочип согласно настоящему изобретению:

1. Биологический микрочип допускает одновременное проведение различных иммунологических реакций, например, взаимодействие антител с тетраспанинами экзосом и взаимодействие антител к трансмембранному белку экзосом с детекцией образовавшихся комплексов при помощи одного или смеси конъюгатов с флуоресцентной или другой меткой.

2. Ячейки гидрогелевого биочипа обладают значительно большей иммобилизационной емкостью по сравнению с элементами планарных микрочипов, что повышает возможность образования бинарного комплекса иммобилизованное антитело-экзосома и увеличивает чувствительность анализа.

3. Иммобилизованные антитела сохраняют свою биологическую активность благодаря гидрофильным свойствам гелевой ячейки.

4. В качестве исследуемых объектов согласно настоящему изобретению предпочтительно предлагаются экзосомы, находящиеся в сыворотке крови человека.

4. Для иммуноанализа экзосом в качестве иммобилизованных лигандов используют антитела против белков, ассоциированных с колоректальным раком, представленных на поверхности экзосом (например, антигена А33 и/или семейства раково-эмбрионального антигена) и, при необходимости, дополнительно антитела против мембранных белков-маркеров экзосом (например, тетраспанинов CD9, CD63, CD 81).

5. В качестве антител, иммобилизованных в гелевых ячейках, могут выступать соединения белковой природы, такие как моноклональные антитела, поликлональные антитела, различные типы мини антител, в том числе Fab-фрагменты и одноцепочечные антитела, а также пептидные и нуклеотидные аналоги антител.

Способ изготовления биологического микрочипа описан в примере 1, фотография биологического микрочипа в проходящем свете приведена на Фиг. 1 (один из возможных вариантов схемы биочипа).

Вторая техническая задача решается за счет того, что разработанный способ детекции экзосом в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе согласно настоящему изобретению включает проведение нескольких стадий:

а) взаимодействие биологического микрочипа с образцом сыворотки крови человека с образованием специфических бинарных иммунных комплексов соединений, иммобилизованных в гидрогелевых ячейках микрочипа, с молекулами, представленными на поверхности экзосом;

б) детекция поверхностных маркеров связавшихся экзосом с образованием тройных комплексов иммобилизованное антитело-экзосома-меченое антитело;

в) регистрация результатов иммуноанализа;

г) определение фенотипа, то есть конкретного типа молекул на поверхности экзосом.

Существенные признаки, характеризующие способ детекции экзосом согласно настоящему изобретению:

1. Способ настоящего изобретения позволяет проводить множественный параллельный иммунологический анализ экзосом.

2. Определение экзосом в сыворотке крови проводят при помощи сэндвич-иммуноанализа. В этом случае биологический микрочип содержит иммобилизованные антитела против анализируемого соединения, реакционная среда на стадии а) содержит анализируемые экзосомы, и происходит образование специфического бинарного комплекса иммобилизованное антитело-экзосома. Образование комплекса обеспечивается за счет специфичного взаимодействия иммобилизованных антител с белками-мишенями, представленными на поверхности экзосом.

3. После инкубации микрочипа с образцом, содержащим анализируемые экзосомы, проводится детекция образовавшихся бинарных комплексов в соответствующих ячейках микрочипа с помощью меченых антител, специфичных к экзосомальным мембранным и/или трансмембранным белкам. При этом происходит образование тройного комплекса иммобилизованное антитело-экзосома-меченое антитело. Схема сэндвич-иммуноанализа на биологическом микрочипе приведена на Фиг. 2.

4. Для сэндвич-иммуноанализа возможен также вариант когда стадии а) и б) объединены в одну. В этом случае реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит проявляющие антитела, что сокращает время проведения анализа, так как инкубации микрочипа с анализируемыми экзосомами и детекция происходят одновременно.

5. Регистрация результатов иммуноанализа проводится с использованием флуоресценции либо хемилюминесценции непосредственно с гелевых элементов микрочипа. Антитела, используемые для детекции, могут содержать флуоресцентные метки, биотин или являться конъюгатами с белками или другими соединениями, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хеми- или биолюминесценции). Кроме того, в качестве метки могут быть использованы, например, полупроводниковые нанокристаллы (квантовые точки), либо золотые наночастицы. Чем выше концентрация анализируемых экзосом в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа.

Способ детекции экзосом в сыворотке крови с помощью биологического микрочипа описан в примере 2, пример флуоресцентного изображения биологического микрочипа после проведения анализа в сыворотке крови приведен на Фиг. 3А.

Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на чертежи и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.

Краткое описание чертежей (Brief Description of Drawings)

Фиг. 1 демонстрирует вид гидрогелевого биологического микрочипа для обнаружения экзосом в проходящем свете. Каждое соединение иммобилизовано в четырех повторах. Биологический микрочип содержит следующие молекулярные зонды: антитела против CD81, антитела против А33, антитела против CD147, пустые гелевые ячейки.

Фиг. 2 демонстрирует схему сэндвич-иммуноанализа экзосом на биологическом микрочипе. Показано образование тройного комплекса иммобилизованное антитело-экзосома-меченое антитело.

Фиг. 3 представляет результаты определения экзосом в сыворотке крови человека с диагнозом колоректальный рак.

Флуоресцентные изображения гидрогелевого биологического микрочипа после проведения иммунофлуоресцентного анализа экзосом в сыворотке крови (А) и экзосом, выделенных по методу [Thery С., Amigorena S., Raposo G. & Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. 2006 Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3.22] из данной сыворотки крови (Б).

(В) Контроль неспецифических взаимодействий. Флуоресцентное изображение гидрогелевого биологического микрочипа после инкубации с «изотип контролем» (мышиные антитела изотипа IgG против IgG человека).

(Г) Диаграмма флуоресцентных сигналов, получаемых после иммунофлуоресцентного анализа экзосом на биочипе.

Фиг. 4 Анализ экзосом, выделенных из клеточной линии НТ29, на биологическом микрочипе.

(A) Флуоресцентные изображения биочипа после проведения иммунофлуоресцентного анализа экзосом, выделенных из клеточной линии НТ29.

(Б) Контроль неспецифических взаимодействий. Флуоресцентное изображение гидрогелевого биологического микрочипа после инкубации с «изотип контролем» (мышиные антитела изотипа IgG против IgG человека).

(B) Диаграмма флуоресцентных сигналов, получаемых после иммунофлуоресцентного анализа экзосом на биочипе.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает биологический микрочип для множественного параллельного иммунологического анализа поверхностных маркеров экзосом в сыворотке крови человека. Биочип представляет собой массив гидрогелевых элементов. Нанесенные на подложку гидрогелевые ячейки с иммобилизованными соединениями получают в ходе реакции радикальной сополимеризации по запатентованной технологии [Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления, Патент РФ N 2216547 (Б.И.П.М. N 32, 20.11.2003). International Application PCT/RU 01/004204, WO 03/033539]. Методика изготовления биологического микрочипа приведена в примере 1. Связывание лиганда с гидрогелевой матрицей возможно как напрямую при его иммобилизации в процессе формирования геля, так и опосредованно. В качестве примеров опосредованного связывания лиганда с гидрогелевой матрицей может служить иммобилизация через образование специфических комплексов типа авидин (стрептавидин)-биотин или иммобилизация через образование специфических комплексов типа металл-хелат, например, образование связи между иммобилизованной на гидрогелевой матрице нитрилотриуксусной кислотой со связанным с ней координационными связями атомом никеля и рекомбинантным белком, содержащим полигистидиновый фрагмент, и др.

Биологический микрочип может одновременно содержать ячейки с различными иммобилизованными лигандами, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано индивидуальное соединение. В качестве лигандов, иммобилизованных в гелевых ячейках, могут выступать соединения белковой природы, такие как моноклональные антитела, поликлональные антитела, различные типы мини антител, в том числе Fab-фрагменты и одноцепочечные антитела (scFv и др.), а также небелковой природы, например, нуклеотидные и пептидные аналоги антител. Тип используемых в анализе лигандов определяется рядом факторов, например, аффинностью антител, стабильностью, возможностью иммобилизации антител и введения в них метки (флуоресцентной метки, ферментной метки путем получения конъюгатов и др).

Например, в качестве иммобилизованных лигандов могут быть использованы, антитела против тетраспанинов CD9, CD63, CD81, CD147, против антигена А33, против белков семейства раково-эмбрионального антигена и др. (Фиг. 1). Биологический микрочип также содержит пустые гелевые ячейки для контроля неспецифических взаимодействий.

Биологический микрочип допускает одновременное проведение иммунологических реакций для мультиплексного определения поверхностных маркеров экзосом. Например, первой реакцией может быть взаимодействие экзосомы с антителом к тетраспанину с образованием комплекса антитело к CD антигену-экзосома. Одновременно с этим, если экзосома произошла из раковой клетки и содержит трансмембранный белок, отвечающий за метастазирование, будет происходить образование комплекса антитело к CD антигену-экзосома-антитело к трансмембранному белку, ассоциированному с колоректальным раком.

Настоящее изобретение обеспечивает также способ множественного параллельного иммуноанализа экзосом на биологическом микрочипе, включающий проведение нескольких стадий:

а) взаимодействие биологического микрочипа с образцом сыворотки крови человека с образованием специфических бинарных иммунных комплексов соединений, иммобилизованных в гидрогелевых ячейках микрочипа, с молекулами, представленными на поверхности экзосом;

б) детекция поверхностных маркеров связавшихся экзосом с образованием тройных комплексов иммобилизованное антитело-экзосома-меченое антитело;

в) регистрация результатов иммуноанализа;

г) определение фенотипа, то есть конкретного типа молекул на поверхности экзосом.

Детекцию результатов иммуноанализа осуществляют предпочтительно флуориметрически. Антитела и другие соединения, используемые для детекции, могут содержать флуоресцентные метки, биотин или являться конъюгатами с белками или другими соединениями, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хемо- или биолюминесценции). В качестве метки могут быть использованы также полупроводниковые нанокристаллы (так называемые квантовые точки), либо золотые наночастицы.

В качестве анализируемых объектов для количественного иммунологического анализа способом по изобретению предпочтительно предлагаются: экзосомы, находящиеся в сыворотке крови человека.

Дополнительно при необходимости обнаружение экзосом может быть проведено также с предварительным выделением экзосом из биологического образца или клеточных культур, например, методом ультрацентрифугирования.

Общая процедура проведения иммуноанализа с использованием биологических микрочипов описана в примере 2. Схема сэндвич-иммуноанализа на биологическом микрочипе приведена на Фиг. 2. В качестве проявляющих антител используют, например, конъюгаты антител против тетраспанинов с флуоресцентными красителями или биотином. В качестве флуоресцентных красителей используют, например, цианиновый 3 (Су3), цианиновый 5 (Су5), флуоресцеин, Texas Red, но не ограничиваясь ими. Флуоресцентные изображения микрочипов после проведения анализа показаны на Фиг. 3А, Фиг. 3Б, Фиг. 3В, Фиг. 4А, Фиг. 4Б. В случае использования флуоресцентной метки, регистрацию флуоресцентных сигналов с ячеек микрочипа проводят с помощью флуоресцентных микроскопов (Пример 2).

В качестве образцов для анализа используются разбавленная или неразбавленная сыворотка крови человека (Пример 2). Дополнительно способ позволяет использовать разбавленный или неразбавленный супернатант культуральной среды, например, в качестве препаратов сравнения (Пример 3).

Примеры осуществления настоящего изобретения.

Пример 1. Изготовление биологического микрочипа

Биологические микрочипы с иммобилизованными антителами против трансмембранных белков и белков-тетраспанинов изготавливали по запатентованному методу [Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления, Патент РФ N 2216547 (Б.И.П.М. N 32, 20.11.2003). International Application PCT/RU 01/004204, WO 03/033539]. Полимеризационную смесь, содержащую гелеобразующие мономеры на основе метакриламида, а также подлежащие иммобилизации антитела (моноклональные антитела против CD81, CD 147, А33 (BD Biosciences, США/ «HansaBioMed», Эстония)), наносили с помощью робота QArray («Genetix», Великобритания) в виде микрокапель объемом 0,1 нл на поверхность активированного Bind Silane стеклянного слайда Corning (Corning 2947 Micro Slides, США). Концентрация каждого антитела в стоковом растворе составляла 1 мг/мл. Полимеризацию гелевых ячеек проводили при UV облучении (354 нм). После завершения полимеризации биочипы отмывали в течение 40 минут (0,01 М фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl, 0,01% Твин-20, 20 мин, комнатная температура), промывали дистиллированной водой, и высушивали. Получали трехмерные гелевые элементы полусферической формы диаметром 100 мкм.

Для уменьшения неспецифических взаимодействий чипы обрабатывали блокирующим буфером (1% раствор поливинилового спирта в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 М NaCl в течение 1 ч, затем промывали дистиллированной водой и высушивали. Качество полученных чипов проверяли в проходящем свете с помощью биочип-анализатора, снабженного программным обеспечением TestChip и QualityControl (ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН), Россия). В результате проверки качества отбраковывали чипы, для которых отклонения значений радиусов гелевых элементов превышали 5% внутри каждого чипа и 8% между всеми чипами данной партии.

Фотография биологического микрочипа в проходящем свете после процедуры проверки качества представлена на Фиг. 1.

Пример 2. Иммуноанализ молекулярных маркеров экзосом с использованием гидрогелевых микрочипов

Для иммуноанализа использовали биологические микрочипы, структура которых показана на Фиг. 1, содержащие элементы с иммобилизованными антителами против белков-тетраспанинов (CD81, CD147), антитела против белка А33 И пустые гелевые ячейки для контроля неспецефической сорбции.

Для проведения сэндвич иммуноанализа, на биочипы наносили 65 мкл раствора образца. В случае анализа экзосом, содержащихся в сыворотке крови, использовали неразбавленную сыворотку крови. Инкубацию проводили при 37°С в течение 20 ч. После кратковременной (20 мин) отмывки в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 М NaCl, 0,01% Твин-20, микрочипы проявляли смесью конъюгатов проявляющих антител (anti-A33biot+anti-CD81biot+anti-CD9-biot+anti-CD63biot) (65 мкл, 0,01 мг/мл, 1 ч, 37°С). После отмывки (0,01 М фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl, 0,01% Твин-20, 20 мин, комн. температура) инкубировали с раствором стрептавидина с флуоресцентным красителем Су5 (15 мин, 37°С, 0,01 мг/мл). После отмывки (0,01 М фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl, 0,01% Твин-20, 20 мин, комн. температура) приступали к регистрации флуоресцентных сигналов. Конъюгаты антител с биотином и стрептавидин, меченный флуоресцентной меткой, получали по известным методикам (например, описанным в Hermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996). Схема сэндвич-иммуноанализа на биологическом микрочипе приведена на Фиг. 2.

Для измерения флуоресцентных сигналов использовали флуоресцентный сканер, (Genepix 4200А (Molecular Devices, США)). Величины флуоресцентных сигналов рассчитывали с помощью программного обеспечения Genepix Pro 6.0 (Molecular Devices, США). Для интерпретации результатов использовали интенсивность флуоресценции F635 median, полученную в программе Genepix Pro 6.0. В случае флуоресцентной детекции возможно использование флуоресцентного микроскопа, разработанного в ИМБ РАН, Россия [Barsky V., Perov A., Tokalov S., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E., Mirzabekov A., Fluorescence data analysis on gel-based biochips. 2002 J. Biomol. Screening 7, 247-257].

На биочипы наносили образец сыворотки крови больного с КРР (колоректальный рак, IV стадия). В качестве препарата сравнения использовали препарат экзосом, выделенный из данной сыворотки. Для контроля неспецифических взаимодействий биочип инкубировали с «изотип контролем» (мышиные антитела изотипа IgG против IgG человека, Pierce, 1 мкг/мл), сравнивали с флуоресцентными сигналами, полученными после иммунофлуоресцентного определения экзосом в сыворотке.

Выделение экзосом из сыворотки проводили по методу [Thery С., Amigorena S., Raposo G. & Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. 2006 Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3.22]. Осуществляли последовательное центрифугирование сыворотки крови для осаждения разрушенных компонентов клетки, а затем ультрацентрифугирование при 100000 g в течение 70 мин. Размер частиц в препаратах экзосом оценивали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.

Результаты иммунофлуоресцентного выявления экзосом в сыворотке крови, в выделенном препарате экзосом, а также «изотип контроль» представлены на Фиг. 3. Данный эксперимент позволяет сравнить результаты анализа экзосом в составе сыворотки крови и анализа выделенной фракции экзосом и показать возможность определения экзосом на биологическом микрочипе без их выделения из биологического образца.

Пример 3. Иммунофлуоресцентный анализ на биочипах экзосом, выделенных из клеточной линии НТ29 (клетки аденокарциномы толстого кишечника)

Препарат экзосом (супернатант из клеточной линии НТ29) был предварительно проверен методом трансмиссионной электронной микроскопии. Далее препарат экзосом из клеточной линии НТ29 наносили на биочипы. Для контроля неспецифических взаимодействий биочип инкубировали с «изотип контролем» (мышиные антитела изотипа IgG против IgG человека, Pierce, 1 мкг/мл), сравнивали с флуоресцентными сигналами, полученными после иммунофлуоресцентного определения экзосом в сыворотке. Иммуноанализ проводили по методике, описанной в примере 2.

Результаты иммунофлуоресцентного выявления экзосом, полученных из клеточной культуры, представлены на Фиг. 4. Обнаружение связывания экзосом клеточной линии НТ29 (клетки аденокарциномы толстой кишки) с антителами против белка А33 закономерно. Известно, что антиген А33 - гликопротеин клеточной поверхности тонкой кишки и эпителия ободочной кишки, высокогомологичен белкам семейства иммуноглобулинов. Локализация А33 в тканях кишечника и высокий уровень экспрессии дают возможность использовать его в качестве мишени при иммунотерапии рака толстой кишки [Belov L, Zhou J, Christopherson RI. Cell surface markers in colorectal cancer prognosis. 2010 Int J MolSci. 12(1):78-113].

Несмотря на то, что антиген А33 присутствует в нормальных (не опухолевых) тканях кишечника, радиоактивно меченые антитела против А33 селективно связываются с клетками опухоли кишечника, а также с метастатически пораженными клетками [Scott, A.M.; Lee, F.T.; Jones, R.; Hopkins, W.; MacGregor, D.; Cebon, J.S.; Hannah, A.; Chong, G; Paul, U.; Papenfuss, A.; Rigopoulos, A.; Sturrock, S.; Murphy, R.; Wirth, V.; Murone, C.; Smyth, F.E.; Knight, S.; Welt, S.; Ritter, G.; Richards, E.; Nice, E.C.; Burgess, A.W.; Old, L.J. A phase I trial of humanized monoclonal antibody A33 in patients with colorectal carcinoma: Biodistribution, pharmacokinetics, and quantitative tumor uptake. 2005 Clin. Cancer Res. 11, 4810-4817]. Исследования показали, что антиген А33 является высокостабильным, полураспад комплекса с радиоактивно мечеными антителами свыше двух дней. Для того, чтобы объяснить эти свойства, авторы исследовали возможность того, что А33 является составной частью плотного белкового комплекса. Такое свойство поверхностной устойчивости может вносить свой вклад в длительное удержание диагностических антител, а также их способности проникать в солидные опухоли.

Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод о том, что на биологическом микрочипе с иммобилизованными антителами против белков, представленных на поверхности экзосом, возможно определение экзосом непосредственно в сыворотке крови без предварительного их выделения. Способ, предложенный в данном техническом решении, обеспечивает выполнение поставленных данным изобретением задач.