КОНЪЮГАТЫ ОЛИГОМЕРА ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛИ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Область техники

Настоящее изобретение относится к конъюгатам гиалуроновой кислоты или ее соли, способу их получения и их применению.

Посредством таких конъюгатов можно иммобилизировать олигомеры гиалуроновой кислоты с возможностью их высвобождения в их исходной, нативной форме.

Уровень техники

Гиалуроновая кислота представляет собой гликозаминогликан, состоящий из двух повторяющихся сахаридных циклов β-(1,3)-D-глюкуроновой кислоты и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамина.

Она характеризуется высокой молекулярной массой от 5⋅10⁴ до 5⋅10⁶ г⋅моль^-1, которая зависит от способа ее выделения и исходного материала. Этот очень гидрофильный полисахарид является водорастворимым в форме соли во всем диапазоне pH. Он образует часть соединительных тканей, кожи, синовиальной жидкости суставов, он играет важную роль в ряде биологических процессов, таких как гидратация, организация протеогликанов, клеточная дифференцировка, пролиферация и ангиогенез.

Связывание олигомеров гиалуроновой кислоты (ГК)

Как указано выше, нативная гиалуроновая кислота является линейным полисахаридом, который разлагается в организме достаточно быстро. Первые весомые попытки получения гиалуроновой кислоты с разветвленной структурой были описаны в 2008 г. Toemmeraase K. (WO 2008/014787). Этот документ относится к связыванию аминогруппы деацетилированной гиалуроновой кислоты с высокой молекулярной массой с концевым аномерным центром олигомера гиалуроновой кислоты посредством восстановительного аминирования. Авторы другого патентного документа, Hacker М., Saraf A., Mikos A.G., WO 2008/115799, действовали аналогичным образом в случае связывания концевого аномерного центра олигомера ГК с полиэтиленимином. Для обеспечения сильной связи используют восстановительное аминирование, которое превращает аминогликозиды в гидролитически очень устойчивые вторичные амины. Реакция происходит в слабоосновной среде и при повышенной температуре, и цианоборгидрид натрия используют в качестве восстанавливающего средства. Полученные конъюгаты использовали для инкапсуляции ДНК или мезенхимальных стволовых клеток, причем только гексамер указывают в качестве олигомера гиалуроновой кислоты. Другая возможность была раскрыта в статье в Eur. J. Org. Chem. 2011, 5617-25. Здесь аминогруппа образуется в положении 6 глюкозаминной части олигомера ГК, причем аминогруппа затем реагирует при умеренных условиях с NHS-сложными эфирами карбоновых кислот, связанных с углеродными нанотрубками. Связывание концевого аномерного центра гиалуроновой кислоты с низкой молекулярной массой посредством диамино- или полиаминолинкера при помощи восстановительного аминирования раскрыто Xu (WO 2007/101243). Полученные субстраты использовали для инкапсулирования активных веществ. Другая возможность была раскрыта Carter (US 2012/0277416), где фосфолипиды связывали с концевым аномерным центром олигомера ГК. На первой стадии производное олигомера с амином в положении 1 получали посредством восстановительного аминирования, затем его конъюгировали с активной карбоксильной группой фосфолипида. Полученные конъюгаты проявляли широкий диапазон биологических активностей. Аналогичная процедура связывания с олигомером ГК с аминогруппой на восстановленном аномерном конце была опубликована Siiskonen в 2013 г., где маркер 2-аминоакридон связывали. Указанный конъюгат использовали для изучения биораспределения фрагментов гиалуроновой кислоты в цитозоле.

Недостатком вышеуказанных способов является тот факт, что они обеспечивают образование конъюгатов олигомеров или полимеров ГК, которые не позволяют их дальнейшее высвобождение в нативной форме. Причиной этого является тот факт, что все известные на данный момент способы связывания аминов с концевым аномерным центром связаны с восстановлением, т.е. с необратимым изменением концевого цикла, который остается навсегда открытым и не позволяет обратное высвобождение олигомера в нативной форме. Ситуация показана на следующей схеме 1:

Объект настоящего изобретения

Вышеуказанные недостатки преодолеваются конъюгатами олигомеров ГК с общими формулами I, II, III или IV согласно настоящему изобретению, которые позволяют такое обратное высвобождение олигомеров ГК в нативной форме.

Объектом настоящего изобретения является конъюгат олигомера гиалуроновой кислоты или ее соли, соответствующий любой из общих формул I, II, III или IV,

или

где

R³ представляет собой COOR⁶ или CH₂OH,

R⁴ представляет собой OH или NHCOCH₃,

R⁶ представляет собой H⁺ или выбран из группы, содержащей любой из ионов щелочных металлов или ионов щелочноземельных металлов, предпочтительно Na⁺, K⁺, Mg²⁺ или Li⁺;

R⁵ выбран из группы, содержащей C₁-C₃₀алкил, C₁-C₃₀алкиларил или C₁-C₃₀алкилгетероарил, необязательно содержащий один или несколько одинаковых или различных гетероатомов, выбранных из группы, содержащей N, O, S,

X представляет собой O или NH-группу;

когда R³ представляет собой COOR⁶, тогда R⁴ представляет собой OH, R¹ представляет собой H, R² представляет собой остаток олигомера гиалуроновой кислоты;

когда R³ представляет собой CH₂OH, тогда R⁴ представляет собой NHCOCH₃, R² представляет собой OH, R¹ представляет собой остаток олигомера гиалуроновой кислоты;

субстрат представляет собой полисахарид, предпочтительно он выбран из группы, содержащей гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль с молекулярной массой в диапазоне от 10⁴ до 10⁶ г⋅моль^-1, предпочтительно 10⁵ г⋅моль^-1.

Структура полученных конъюгатов зависит в большой степени от характера заместителя X. Если X представляет собой кислородный мостик -O-, в основном присутствует иминоформа. Если X представляет собой азотный мостик -NH-, преобладающей формой является амино с бета-конфигурацией.

Остаток олигомера гиалуроновой кислоты в конъюгате согласно настоящему изобретению имеет 1-17 сахаридных циклов, причем сахаридный цикл выбран из группы, состоящей из β-(1,3)-D-глюкуроновой кислоты и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамина.

Согласно другому варианту осуществления конъюгаты олигомера гиалуроновой кислоты с общими формулами I и II, определенными выше, можно получать способом настоящего изобретения, сущностью которого является то, что на первой стадии олигомер гиалуроновой кислоты реагирует на его концевом аномерном центре в положении 1 с избытком диаминолинкера общей формулы H₂N-X-R⁵-X-NH₂, где R⁵ выбран из группы, содержащей C₁-C₃₀алкил, C₁-C₃₀алкиларил или C₁-C₃₀алкилгетероарил, который необязательно содержит один или несколько одинаковых или различных гетероатомов, выбранных из группы, содержащей N, О, S, а X представляет собой O или NH-группу; в слабо кислой среде при pH в диапазоне от 3 до 6,99, предпочтительно при pH в диапазоне от 3 до 6, более предпочтительно от 5 до 6, после чего выделяют конъюгаты олигомера гиалуроновой кислоты-диаминолинкера с общими формулами V и VI

где заместители R¹-R⁶ являются такими, как определено выше.

Осуществление первой стадии реакции показано на схеме 2 ниже.

Схема 2:

Реакция происходит при избытке диаминолинкера, который статистически исключает в значительной мере модификацию на обоих концах линкера.

Неожиданно обнаружили, что данная реакция происходит только в присутствии некоторого количества слабой кислоты и воды. Если условия были нейтральными или основными, никакой успешной реакции не наблюдали. Если присутствовала сильная кислота, такая как HCl или H₂SO₄, происходило разложение олигомеров ГК.

Слабокислотную среду с pH в диапазоне от 3 до 6,99 обеспечивают добавлением карбоновой кислоты в реакционную среду, предпочтительно уксусной кислоты, пропановой кислоты или молочной кислоты, более предпочтительно уксусной кислоты.

Количество кислоты находится в диапазоне от 5 до 30 эквивалентов, предпочтительно в диапазоне от 10 до 15 эквивалентов, относительно мольного количества дисахарида гиалуроновой кислоты в качестве субстрата.

Кроме того, количество диаминолинкера находится в диапазоне от 5 до 30 эквивалентов, предпочтительно 10 эквивалентов, относительно мольного количества дисахарида гиалуроновой кислоты в качестве субстрата.

Кроме того, первая стадия происходит при температуре от 10 до 40°C, предпочтительно при температуре 20°C, в течение 24-150 часов, предпочтительно 60-80 часов.

Затем происходит вторая стадия реакции, на которой конъюгаты олигомера гиалуроновой кислоты - диаминолинкера с общими формулами V и VI, как определено выше, реагируют по меньшей мере с одной альдегидной группой субстрата в воде или в смеси воды и смешиваемого с водой органического растворителя, который выбран из группы, содержащей этанол, изопропанол, метанол или диметилсульфоксид.

Кроме того, вторую стадию проводят при температуре от 10 до 40°C, а также предпочтительно при 20°C, в течение 24-150 часов, предпочтительно 60-80 часов.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления способа настоящего изобретения конъюгаты олигомера гиалуроновой кислоты - диаминолинкера, соответствующие общим формулам V и VI, как определено выше, приводят в реакцию в соответствии со способом и условиями, указанными выше, с по меньшей мере одной альдегидной группой субстрата в присутствии восстанавливающего средства, которое предпочтительно выбрано из группы, содержащей цианоборгидрид (NaBH₃CN) или пиколинборан, с образованием конъюгатов с общими формулами III и IV, где субстрат связывается гидролитически очень сильной связью.

Количество восстанавливающего средства находится в диапазоне от 0,1 до 5 эквивалентов, предпочтительно 3 эквивалентов, относительно мольного количества дисахарида гиалуроновой кислоты.

Обе вышеописанные возможности связывания субстрата путем аминирования или восстановительного аминирования показаны на схеме 3

Схема 3

Неожиданно, что при восстановительном аминировании, при котором образуются конъюгаты с общими формулами III и IV (смотрите схему выше), восстановление происходит по существу только по связи субстрат-линкер, что происходит из-за компромиссных условий, таких как температура реакции, время, количество восстанавливающего средства, и не наблюдали восстановления связи олигомер-линкер, которая также в принципе имеет характер восстановительного имина.

Попытки связывания концевого аномерного центра олигомера ГК с конъюгатом субстрата-линкера не были успешными даже при более высоких температурах, когда происходило расщепление олигомеров ГК

Таким образом, при получении конечного конъюгата необходимо связывать двухфункциональный линкер сначала с олигомером.

Из вышеуказанных фактов следует, что при получении конъюгатов согласно настоящему изобретению, было необходимо найти условия реакции, которые наконец нашли в относительно узком диапазоне (pH в области слабой кислоты, осторожное восстановление…). Конечные конъюгаты с общими формулами I, II, III, IV обеспечивают при сравнении с растворами, известными до этого, высвобождение олигомеров гиалуроновой кислоты в их исходной нативной форме, что важно в отношении их биологической активности. Необходимое условие состоит в том, чтобы субстрат содержал альдегидные группы, которые можно достаточно легко получать химической модификацией, например, окислением в случае полисахаридов, содержащих OH-группы.

Реализация решений, раскрытых в настоящем изобретении, не является сложной технологически и не требует использования дорогостоящих химических веществ, растворителей или процедур выделения.

Как уже описано выше, конъюгат согласно настоящему изобретению обеспечивает высвобождение:

Возможность обратимой иммобилизации является очень важной в случаях, где необходимо сохранять исходную структуру олигомеров ради их биологической активности или биосовместимости. Известно, что некоторые типы олигомеров ГК проявляют биологическую активность, например, к раковым клеткам. Полученные системы проявляли повышенную биологическую активность относительно выбранных линий раковых клеток.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения конъюгаты с общими формулами I-IV, как определено выше, предпочтительно используют в качестве носителей биологически активных олигомеров в фармацевтике и биомедицине, или возможно их использовать для получения материалов с противораковым действием.

Выражение «фармацевтически приемлемая соль» при использовании в настоящем документе означает соли конъюгатов ГК согласно настоящему изобретению, которые безопасны и эффективны для применения в организме и характеризуются желаемой биологической активностью. Фармацевтически приемлемые соли включают предпочтительно ионы щелочных металлов или щелочноземельных металлов, более предпочтительно Na⁺, K⁺, Mg⁺ или Li⁺.

Выражение «полисахарид» означает полисахарид, такой как гиалуроновая кислота, ее фармацевтически приемлемая соль, крахмал, гликоген, целлюлоза и пр., которые содержат по меньшей мере одну альдегидную группу после окисления их OH-групп.

Выражение «конъюгат» означает соединение, которое образуется путем связывания двух или более химических соединений посредством ковалентной связи. Конъюгат согласно настоящему изобретению образуется путем связывания олигомера ГК и линкера, давая конъюгат олигомера ГК-линкера, а затем путем их связывания с субстратом, т.е. полисахаридом, предпочтительно гиалуроновой кислотой, при этом образуя конъюгат олигомера ГК-линкера-субстрата.

Выражение «олигомер гиалуроновой кислоты» означает олигомер гиалуроновой кислоты, содержащий попеременно повторяющиеся сахаридные циклы β-(1,3)-D-глюкуроновой кислоты и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамина. Предпочтительно, число сахаридных циклов составляет от 2 до 18.

Выражение «остаток олигомера гиалуроновой кислоты» означает по меньшей мере один сахаридный цикл олигомера гиалуроновой кислоты, который представляет собой β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамин или β-(1,3)-D-глюкуроновую кислоту.

Когда концевой сахаридный цикл, связанный с линкером посредством его аномерного центра, представляет собой β-(1,3)-D-глюкуроновую кислоту, указанный сахаридный цикл представляет собой β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамин.

Когда концевой сахаридный цикл, связанный с линкером посредством его аномерного центра, представляет собой β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамин, указанный сахаридный цикл представляет собой β-(1,3)-D-глюкуроновую кислоту.

Когда остаток олигомера гиалуроновой кислоты содержит более одного сахаридного цикла, сахаридные циклы β-(1,3)-D-глюкуроновой кислоты и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамина повторяются попеременно.

Выражение «избыток» означает количество диаминолинкера, которое больше, чем один эквивалент, относительно мольного количества дисахарида гиалуроновой кислоты в качестве субстрата.

Выражение «выделяют» означает, что после окончания реакции реакционную смесь нейтрализуют и осадившийся продукт реакции отфильтровывают и сушат.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показан ход ингибирования роста иммортализованных раковых клеток в процентах относительно непораженного контроля.

Примеры

Выражение эквивалент (экв.), используемое в настоящем документе, относится к дисахариду гиалуроновой кислоты, если не указано другое. Проценты означают массовые проценты, если не указано другое.

Молекулярная масса исходной гиалуроновой кислоты (источник: CPN spol. s r.o., Долни Доброуч, Чехия) представляет собой среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 10⁴ до 10⁶ г⋅моль^-1 и была измерена SEC-MALS.

Олигомеры гиалуроновой кислоты, содержащие 2-18 сахаридных циклов, получали путем ферментативного разложения полимера с высокой молекулярной массой.

DS = степень замещения = 100% * (мольное количество связанного замещенного или модифицированного дисахарида) / (мольное количество всех дисахаридов)

Пример 1. Получение ГК-альдегида, окисленного в положении 6 глюкозаминовой части

Окисление гиалуроновой кислоты

Водный раствор NaClO (0,5 экв.) постепенно добавляли в однопроцентный водный раствор гиалуроновой кислоты (1 г, 200 кДа), содержащий 1% NaCl, TEMPO (0,01 экв.) и NaHCO₃ (5 экв.), в атмосфере азота. Смесь перемешивали в течение 12 часов при температуре 0°C, затем 0,1 г этанола добавляли и смесь перемешивали еще 1 час. Полученный раствор затем разбавляли дистиллированной водой до 0,2% и диализировали относительно смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃) 3 раза по 5 литров (раз в день) и относительно дистиллированной воды 7 раз по 5 литров (дважды в день). Затем полученный раствор выпаривали и анализировали.

DS 10% (определенный из ЯМР)

¹H-ЯМР (D₂O) 5,26 (s, 1H, полимер-CH(OH)₂)

HSQC (D₂O) перекрестный сигнал 5,26 частей на миллион (¹H) - 90 частей на миллион (¹³C) (полимер-CH(OH)₂)

Пример 2. Получение конъюгата октасахарида ГК (ГК-8) с дигидразидадипатом

Октасахарид ГК растворяли в воде в концентрации 5%. Затем добавляли дигидразидадипат (6 эквивалентов) и уксусную кислоту (15 эквивалентов) и смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 72 часов при pH 4. Полученную смесь нейтрализовали при помощи NaHCO₃ и повторно осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.

¹H-ЯМР (D₂O) 4,24 (d, J=9,7 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета), нет сигнала исходного концевого аномерного центра (-O-CH-OH альфа)

Пример 3. Получение конъюгата трисахарида ГК (ГК-3) с дигидразидадипатом

Трисахарид ГК (оканчивающийся глюкуроновой кислотой) растворяли в воде в концентрации 7%. Затем добавляли дигидразидадипат (25 эквивалентов) и уксусную кислоту (25 эквивалентов) и смесь перемешивали при температуре 10°C в течение 150 часов при pH 6. Полученную смесь нейтрализовали при помощи NaHCO₃ и повторно осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.

¹H-ЯМР (D₂O) 4,11 (d, J=8,8 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета), нет сигнала исходного концевого аномерного центра (-O-CH-OH альфа)

Пример 4. Получение конъюгата октадека ГК (ГК-18) с дигидразидадипатом

Октадекасахарид ГК (оканчивающийся глюкозамином) растворяли в воде в концентрации 5%. Затем добавляли дигидразидадипат (15 эквивалентов) и уксусную кислоту (20 эквивалентов) и смесь перемешивали при температуре 40°C в течение 24 часов при pH 5. Полученную смесь нейтрализовали при помощи NaHCO₃ и повторно осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.

¹H-ЯМР (D₂O) 4,10 (d, J=8,7 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета).

Пример 5. Получение конъюгата декасахарида ГК (ГК-10) с O,O'-1,3-пропандиилбисгидроксиламином

Декасахарид ГК растворяли в воде в концентрации 3%. Затем добавляли O,O'-1,3-пропандиилбисгидроксиламин (5 эквивалентов) и молочную кислоту (5 эквивалентов) и смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 100 часов при pH 6. Полученную смесь нейтрализовали при помощи NaHCO₃ и повторно осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.

¹H-ЯМР (D₂O) 7,53 (d, J=5,3 Гц, 1H, -O-CH=N-Z-изомер), 6,89 (d, J=6,0 Гц, 1H, -O-CH=N-Е-изомер).

Пример 6. Получение конъюгата тетрасахарида ГК (ГК-4) с терефталоилдигидразидом

Тетрасахарид ГК растворяли в воде в концентрации 3%. Затем добавляли терефталоилдигидразид (5 эквивалентов) и пропановую кислоту (6 эквивалентов) и смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 100 часов при pH 6. Полученную смесь нейтрализовали при помощи NaHCO₃ и повторно осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.

¹H-ЯМР (D₂O) 4,12 (d, J=8,8 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета).

Пример 7. Связывание конъюгата ГК-8 - дигидразидадипата (пример 2) с гиалуроновой кислотой, окисленной в положении 6 до альдегида (пример 1), восстановительным аминированием

0,01 г конъюгата, полученного согласно примеру 2, растворяли в воде в концентрации 2%. Затем добавляли 0,01 г производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегид (молекулярная масса 6×10⁵ г⋅моль^-1), и 5 эквивалентов пиколинборана. Смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 24 часов. Полученную смесь осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.

¹H-ЯМР (D₂O) 2,85, 3,12 (m,m диастереотопическая пара, 2H, -NH-CH₂-полимер)

DOSY-ЯМР (D₂O) 4,24 (d, J=9,7 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета) имел такую же подвижность, как гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой, и сигналы диастереотопических водородов 2,85 и 3,12.

Пример 8. Связывание конъюгата ГК-3 - дигидразидадипата (пример 3) с гиалуроновой кислотой, окисленной в положении 6 до альдегида (пример 1), восстановительным аминированием

0,01 г конъюгата, полученного согласно примеру 3, растворяли в воде в концентрации 2%. Затем добавляли 0,01 г производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегид (молекулярная масса 2×10⁴ г⋅моль^-1), и 0,3 эквивалента цианоборгидрида натрия. Смесь перемешивали при температуре 10°C в течение 72 часов. Полученную смесь осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.

¹H-ЯМР (D₂O) 2,89, 3,04 (m,m диастереотопическая пара, 2H, -NH-CH₂-полимер)

DOSY-ЯМР (D₂O) 4,11 (d, J=8,8 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета) имел такую же подвижность, как гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой, и сигналы диастереотопических водородов 2,89 и 3,04.

Пример 9. Связывание конъюгата ГК-8 - дигидразидадипата (пример 2) с гиалуроновой кислотой, окисленной в положении 6 до альдегида (пример 1), без восстановления

0,1 г конъюгата, полученного согласно примеру 2, растворяли в смеси воды / ДМСО в отношении 1/1 в концентрации 2%. Затем добавляли 0,1 г производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегид (молекулярная масса 2×10⁴ г⋅моль^-1). Смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 72 часов. Полученную смесь осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.

¹H ЯМР (D₂O) 7,48 (m, 1H, -N=CH-полимер)

DOSY-ЯМР (D₂O) 4,24 (d, J=9,7 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета) имел такую же подвижность, как гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой, и сигнал 7,48.

Пример 10. Связывание конъюгата ГК-18 - дигидразидадипата (пример 4) с гиалуроновой кислотой, окисленной в положении 6 до альдегида (пример 1), без восстановления

0,1 г конъюгата, полученного согласно примеру 4, растворяли в воде в концентрации 2%. Затем добавляли 0,1 г производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегид (молекулярная масса 2×10⁴ г⋅моль^-1). Смесь перемешивали при температуре 10°C в течение 100 часов. Полученную смесь осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.

¹H-ЯМР (D₂O) 7,47 (m, 1H, -N=CH-полимер)

DOSY-ЯМР (D₂O) 4,25 (d, J=9,7 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета) имел такую же подвижность, как гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой, и сигнал 7,47.

Пример 11. Связывание конъюгата ГК-10 - O,O'-1,3-пропандиилбисгидроксиламина (пример 5) с гиалуроновой кислотой, окисленной в положении 6 до альдегида (пример 1), без восстановления

0,01 г конъюгата, полученного согласно примеру 5, растворяли в воде в концентрации 2%. Затем добавляли 0,01 г производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегид (молекулярная масс 2×10⁴ г⋅моль^-1). Смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 48 часов. Полученную смесь осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.

DOSY-ЯМР (D₂O) 7,53 (d, J=5,3 Гц, 1H, -O-CH=N-Z-изомер), 6,89 (d, J=6,0 Гц, 1H, -O-CH=N-Е-изомер) имел такую же подвижность, как гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой.

Пример 12. Биологическое тестирование конъюгата, полученного согласно примеру 8

Определение жизнеспособности линии А2058 после обработки конъюгатом, полученным согласно примеру 8.

Клеточную линию, культивируемую при стандартных условиях (средний DMEM с 10% FBS, 37°C, 5% CO₂), высеивали в 4 96-луночных культуральных планшета с плотностью 5000 клеток на лунку и инкубировали в 200 мкл среды в течение 24 часов. Затем культуральную среду заменяли на свежую среду, содержащую конъюгат (пример 8) в концентрациях 1000, 100 и 10 мкг/мл. Среду для контрольных клеток заменяли на свежую среду без конъюгата. Сразу после обработки жизнеспособность клеток измеряли в первом планшете посредством МТТ-теста. Вкратце, 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл) добавляли к клеткам и вместе их инкубировали в течение 2,5 часов в темноте при 37°C. После инкубации культуральную среду отсасывали и монослой клеток лизировали смесью ДМСО и изопропанола (1:1) с 10% Triton Х-100. Полученный цвет в отдельных лунках планшета измеряли посредством спектрометра для планшетов (оптическая плотность при 570 нм с поправкой при 690 нм). Это измерение повторяли на других планшетах также каждые 24 часа. Конечную жизнеспособность рассчитывали как отношение оптической плотности образца в данное время и во время T0.

А2058 представляет собой иммортализованную клеточную линию, полученную из меланомы человека, она очень инвазивна, и по этой причине ее часто используют в качестве модели онкогенеза и метастазирования.

Результаты ингибирования роста клеток в процентах показаны на фиг. 1, где ясно, что ингибирование роста клеток повышается по экспоненте со временем из-за воздействия конъюгата согласно настоящему изобретению.