АПОПТОЗИНДУЦИРУЮЩАЯ И АНТИОКСИДАНТНАЯ КОМПОЗИЦИЯ

Изобретение относится к области медицины, биологии и фармакологии, а именно к веществам, обладающим антиоксидантной и апоптозиндуцирующей активностью, и может быть использовано в фармацевтической промышленности, медицине, биологии.

Апоптоз является одним из фундаментальных процессов регуляции пролиферации клеток и роста тканей, проявляющийся в виде генетически запрограммированной гибели клеток. В отличие от некроза, апоптоз является контролируемым процессом, а фрагменты апоптотических клеток, полностью элиминируются макрофагами не оказывая токсического действия и воспалительной реакции в окружающих тканях. Также хорошо известен факт повреждающего действия свободных радикалов на клеточные мембраны и на высокомолекулярные соединения (включая, белки, липиды, ДНК). Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), являются одними из ключевых, в нарушении метаболизма клетки, что в конечном итоге нарушает функцию тканей и органа в целом. На макро уровне это проявляется синдромом оксидативного стресса. Таким образом, представляет интерес создание препаратов сочетанного действия обладающих апоптозиндуцирующим действием (способствует щадящему для ткани удалению поврежденных клеток) и антиоксидантным действием предотвращающим развитие оксидативного стресса. К настоящему времени известно большое количество индукторов апоптоза, однако все они обладают существенными недостатками, в первую очередь, низкой антиоксидантной активностью.

Известно средство, обладающее цитостатической и апоптозиндуцирующей активностью, (патент RU №2296578), представляющее собой бета-аспарагин растительного происхождения. Недостаток данного средства в том, что апоптозиндуцирующая активность невысока, сложный процесс получения и зависимость от характеристик исходного растительного сырья.

Известно средство и способ индукции апоптоза опухолевых клеток (Патент RU 2488408). В способе описано применение донора монооксида углерода - CORM-2 для индукции апоптоза опухолевых клеток. Недостатком данного изобретения является низкая антиоксидантная активность.

Известен способ лечения злокачественных опухолей (Патент RU 2271209). В основе способа применение электролизного раствора серебра в дозе 0,05-0,1 мг/кг веса тела. Использование электролизного раствора серебра в данной концентрации обеспечивает усиление апоптоза опухолевых клеток. Однако, электролизное серебро не обладает антиоксидантым действием. Это изобретение было выбрано в качестве прототипа предложенного решения.

Целью заявленного изобретения является создание композиции на основе соли серебра, обладающей сочетанным апоптозиндуцирующим и антиоксидантным действием.

Поставленная цель достигается установлением апоптозиндуцирующей и антиоксидантной активности у известной противолейкозной и антибактериальной фармацевтической композиции и применение ее по новому назначению в качестве апоптозиндуктора и антиоксиданта. Противолейкозная и антибактериальная фармацевтическая композиция (патент №2339376 опубликован 27.11.2008 г), содержащая метронидазол, нитрат гексаметилентетрамин серебра, тиосульфат натрия, воду, обладающая противолейкозными и антибактериальными свойствами, в ходе исследований проявила себя как индуктор апоптоза с выраженной антиоксидантной активностью.

Для получения описанного апоптоз-индуцирующего действия данную композицию вносят в культуру живых клеток в концентрации 10 мкг/мл и инкубируют в течение 8-24 часов, что вызывает достоверное повышение количества клеток в популяции, находящихся в процессе апоптоза. Процент клеток находящихся на разных фазах апоптоза определяют флуоресцентным методом. Метод заключается в определении фосфатидилсерина на поверхности клетки при связывании с меченным аннексином V, который обладает высоким сродством фосфатидилсерину. В норме фосфатидилсерин локализуется на внутренней стороне мембраны, но при апоптозе перемещается на внешнюю поверхность, где связывается с меченным аннексином V, флюоресценция которого детектируется при проточной цитометрии (Kaplan, A., Akalin Ciftci, G., Kutlu, H.M. Cytotoxic, anti-proliferative and apoptotic effects of silver nitrate against H-ras transformed 5RP7. Cytotechnology 2016, Volume 68 (5): 1727-1735).

Антиоксидантные свойства композиции выявляются с помощью метода катодной вольтамперометрии. Для чего используют трехэлектродную электрохимическую ячейку, в качестве фонового электролита выбирают 0.025 М фосфатный буфер (pH=6.86), в качестве рабочего электрода выбирают серебряный стержень, покрытый пленкой ртути. Процесс электровосстановления кислорода проходит в несколько стадий с образованием свободных радикалов. Степень поглощения этих радикалов присутствующим в растворе тестируемым веществом позволяет охарактеризовать антиоксидантную активность данного вещества. О величине антиоксидантной активности тестируемого вещества судят по относительному изменению тока электровосстановления кислорода в присутствии антиоксиданта от фонового уровня тока. Разница токов пересчитывается с учетом времени и концентрации кислорода в коэффициент антиоксидантной активности и выражается в мкмоль/литр в минуту (Е.И. Короткова, Ю.А. Карбаинов. Вольтамперометрический способ определения суммарной активности антиоксидантов. Патент №2224997 от 06.06.02).

Реализация изобретения показана на нижеперечисленных примерах.

Пример 1.

Для индукции апоптоза применяют композицию, следующего состава: метронидазол 0,1 г, нитрат гексаметилентетрамин серебра 0,1 г, тиосульфат натрия 0,1 г, компоненты смешивают и растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Полученный раствор добавляют в культуру клеток из расчета на конечную концентрацию в культуре 10 мкг/мл. Для этого мононуклеары человека, выделенные на градиенте фиколла, суспендируют в среде RPMI 1640, добавляют раствор композиции в объеме 1,67 мкл на лунку с объемом клеточной культуры в 500 мкл (10 мкг/мл) и инкубируют в течение 24 часов при 37°C в среде 5% углекислого газа. Уровень апоптоза фиксируют на проточном цитометре по степени включения меченого красителя апоптотическими клетками.

Результаты определения уровня апоптоза представлены в таблице 1 в процентах апоптотических клеток после 24 часов инкубации лимфоцитов с заявленной композицией и прототипом.

Пример 2

Для оценки антиоксидантной активности заявленной композиции смешивают метронидазол 0,1 г, нитрат гексаметилентетрамин серебра 0,1 г, тиосульфат натрия 0,1 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Полученный раствор в объеме 10 мкл добавляют в электрохимическую ячейку содержащую 0.025 М фосфатный буфер, и проводят измерение тока электровосстановления кислорода до и после внесения тестируемой композиции.

Из материалов таблицы №2 видно, что заявленная композиция обладает выраженной антиоксидантной активностью и превосходит таковую у прототипа. Вследствие чего можно говорить об использовании данной композиции для нейтрализации свободных радикалов и предотвращения их негативного повреждающего воздействия.