Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКРИЛОВЫХ МОНОМЕРОВ И ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к биотехнологии и касается биокаталитического способа получения акриловых мономеров, а именно акриламида и акрилата аммония, а также штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous, используемого в качестве биокатализатора при осуществлении этого способа.

Акриламид, акриловая кислота и ее соли являются ценными мономерами для получения водорастворимых полимеров. Значительную их долю составляют сополимеры акриламида и акриловой кислоты (или ее солей), которые широко используют в качестве флокулянтов, реагентов для нефтедобычи, диспергаторов и т.д.

Традиционно акриламид и акрилат аммония получают гидролизом акрилонитрила в присутствии серной кислоты или медного катализатора (Платэ и Сливинский. Основы химии и технологии мономеров. М.: Наука, 2002, стр.241). Основные недостатки этих способов: низкая концентрация мономеров в конечном растворе (не более 10%), а также образование побочных продуктов и большого количества отходов.

Альтернативным способом получения акриловых мономеров является биокаталитический гидролиз акрилонитрила. В этом случае в качестве катализаторов при гидролизе акрилонитрила используют микробные ферменты или микробные клетки с нитрилгидролитической активностью.

Известны способы получения акриламида, в которых в качестве биокатализатора гидролиза акрилонитрила используют различные микробные штаммы, содержащие фермент нитрилгидратазу, а именно штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ S-926 (РФ 1731814), его мутантный вариант штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-1515Д (РФ 2053300), штамм Rhodococcus rhodochrous J1 (JP 4234597/87, ЕР 0307926) и другие штаммы, при этом конечным продуктом являются 38-50% растворы одного мономера - акриламида. В настоящее время эти способы благодаря их высокой эффективности используют для промышленного производства акриламида.

Известны способы получения другого акрилового мономера - акрилата аммония путем гидролиза акрилонитрила в присутствии биокатализаторов, содержащих фермент нитрилазу, на основе штаммов Rhodococcus sp. (US 5135858, US 6361981, US 5998180) и Alcaligenes denitrificans (РФ 2177034). Согласно этим способам удается получить 30% и даже 40% растворы акрилата аммония. Главными проблемами этих процессов остаются низкий уровень активности используемых биокатализаторов и их быстрая инактивация.

Известен способ получения акрилата аммония с помощью биокатализатора Comamonas testesteroni 5-MGAM-4D (US 6670158), содержащего ферментную систему нитрилгидратаза/амидаза. В отличие от катализаторов на основе нитрилазы, превращающих акрилонитрил в акрилат аммония в одну стадию, биокатализатор на основе системы нитрилгидратаза/амидаза превращает акрилонитрил в акрилат аммония в две стадии: на первой стадии нитрилгидратаза превращает акрилонитрил в акриламид, который далее под действием амидазы превращается в акрилат аммония. Согласно этому способу конечным продуктом процесса являются растворы одного мономера - акрилата аммония. Эффективность и этого способа остается низкой, вследствие слабой активности амидазы.

Если биокаталитический способ получения акриламида уже реализован в промышленных масштабах, то разработка процессов получения акрилата аммония все еще находится на стадии опытных установок. Причина этого заключается в отсутствии эффективных катализаторов для превращения акрилонитрила в акрилат аммония.

Задача настоящего изобретения состояла в расширении арсенала способов получения акриловых мономеров.

Задача решена путем:

- получения штамма Rhodococcus rhodochrous M20, обладающего уникальной ферментной системой гидролиза нитрилов и амидов, включающей ферменты нитрилгидратазу и амидазу, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ Ас-1728, и

- разработки способа получения акриловых мономеров с использованием этого штамма в качестве биокатализатора.

Благодаря особенностям каталитической системы заявляемого штамма в результате гидролиза либо акрилонитрила, либо акриламида в его присутствии получают смешанные растворы мономеров акриламида и акрилата аммония в различных соотношениях. Эти смешанные растворы представляют интерес при получении сополимеров разных типов как непосредственно, так и после их превращения в раствор акриламид/акрилат натрия.

Штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1728 получен на селективных средах с хлорацетамидом и ацетамидом и является мутантом штамма Rhodococcus rhodochrous M8 - ВКПМ S-926 (РФ 1731814).

Характеристика заявляемого штамма.

Таксономические свойства.

Морфологические свойства. Клетки штамма ВКПМ Ac-1728 неподвижны и окрашиваются по Граму. Спор не образуют, некислотоустойчивы. В возрасте 18-20 ч на мясо-пептонном агаре - МПА (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, МГУ, 1983, стр.93) клетки образуют длинные /до 20 μм/ слабо ветвящиеся нити, которые через 48-72 часа распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. В старых культурах наблюдаются плеоморфные клетки в виде колб, груш, булав. Деление клеток происходит по раскалывающемуся и сгибающему типам.

Культуральные свойства. На плотных питательных средах, например МПА, через 48 часов роста заявляемый штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм, окрашенные в оранжевый цвет. При росте на мясо-пептонном бульоне образуются пленка и осадок. Лакмусовое молоко не изменяется.

Физиологические свойства. Облигатный аэроб. Редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра отрицательные. Образует сероводород. Штамм оксидазоотрицательный, каталазо- и фосфотазаположительный. Крахмал и целлюлозу не гидролизует, твин 60 и 80 гидролизует. Аденин не утилизирует. Клетки не выдерживают нагревания в снятом молоке при 72°С в течение 15 мин. Штамм растет при рН 6-9, температуре 5-45°С. Кислоту образует из следующих сахаров и спиртов: глюкозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, сорбита, манита и глицерина. Газообразования ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника азота использует соединения аммония, нитраты и мочевину. В качестве единственного источника углерода использует мальтозу, манитсорбит, глюкозу, глицерин, лактат, ацетат, пируват, бензоат, п- и м-гидроксибензоат, тирозин; не использует рамнозу, галактозу, инозит, а-кетоглутарат.

Биохимический анализ показал, что в клеточной стенке штамма ВКПМ Ас-1728 содержатся мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза, что характерно для накардиоподобных бактерий с IY типом клеточной стенки (Нестеренко и др, Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии, «Наукова думка», 1985, стр.90). Клетки также содержат липид A(LCN), характерный для родококков.

Нуклеотидная последовательность гена рибосомальной 16S РНК заявляемого штамма соответствует роду Rhodococcus.

На основании перечисленного выше и в соответствии с руководством Берджи (Определитель бактерий Берджи, М.: Мир, 1997) штамм ВКПМ Ас-1728 отнесен к роду Rhodococcus и виду rhodochrous.

Оптимальные условия культивирования.

Для получения клеток заявляемого штамма в больших количествах и с высокой активностью нитрилгидратазы и амидазы штамм выращивают при 25-30°С в течение 24-72 часов на синтетических средах, содержащих в качестве источника углерода пируват, ацетат или глюкозу в концентрациях 0.1-4%, а в качестве источника азота аммонийные, нитратные соли или мочевину в концентрациях 0.4-2%. Для роста штамма не требуются дорогостоящие компоненты, такие как витамины, аминокислоты или экстракты.

Отличительная особенность заявляемого штамма состоит в его способности синтезировать ферменты нитрилгидратазу и амидазу конститутивно, т.е. в отсутствии в среде известных индукторов, таких как нитрилы, амиды органических кислот (табл.1). При этом заявляемый штамм ВКПМ Ас-1728 проявляет более высокую активность обоих этих ферментов, чем родительский штамм ВКПМ S-926.

Для определения активности ферментов штаммы выращивают при 30°С с интенсивной аэрацией (200 об/мин) в колбах Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащих по 150 мл питательной среды следующего состава (мас.%): К₂HPO₄ 3Н₂O - 0.05; КН₂PO₄ - 0.05; MgSO₄ 7H₂O - 0.05; FeSO₄ 7H₂О - 0.0005; CoCl₂ 6H₂O - 0.001; пируват натрия - 0,5 и NH₄Cl - 0,2; вода - остальное. Через 24 ч полученные культуры разделяют на две части и к одной из них добавляют индуктор - ацетамид (2 г/л) и продолжают культивировать еще 20 часов. Клетки отделяют с помощью центрифугирования и используют для определения активности нитрилгидратазы и амидазы.

Ферментативную активность штамма определяют по измерению скорости гидролиза 1% раствора акрилонитрила (для нитрилгидратазы) или акриламида (для амидазы) при 20°С. За единицу активности принимают количество ферментативной активности, необходимой для превращения 1 мкм субстрата в продукт за 1 мин.

Концентрацию акрилонитрила, акриламида и акрилата аммония определяют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (Moreau et al., Analyst, 1991, р.1381-1383). Удельную активность нитрилгидратазы выражают в мкМ акриламида/мин·мг клеток по сухой массе. Удельную активность амидазы выражают в мкМ акрилата/мин·мг клеток по сухой массе.

Способ в общем виде осуществляют следующим образом.

Способ получения смешанных растворов акриламида и акрилата аммония осуществляют путем смешивания водного раствора либо акрилонитрила, либо акриламида с водной суспензией биокатализатора в термостатируемом сосуде (при температуре от 4 до 55°С, предпочтительнее от 18 до 30°С) с последующим перемешиванием (от 100 до 250 об/мин). Значение рН варьирует от 4 до 10, предпочтительнее от 6 до 8. Концентрация биокатализатора (в расчете на сухой вес) варьирует от 0.4 мг до 4 мг на 1 мл реакционной смеси и определяет соотношение компонентов получаемых смешанных растворов акриламида и акрилата аммония.

Биокатализатор, обладающий удельной нитрилгидратазной активностью не менее 60 ед/мг и амидазной активностью не менее 0,5 ед/мг, используют как в виде свободных клеток заявляемого штамма, полученных путем отделения от культуральной жидкости центрифугированием и последующим суспендированием в дистиллированной воде, так и в иммобилизованном виде, например в виде клеток, включенных в гель полиакриламида.

Как акрилонитрил, так и акриламид вводят в реактор или одномоментно, или порциями, или непрерывно. При этом концентрация акрилонитрила или акриламида в реакционной среде составляет от 0.5 до 7%, предпочтительнее от 0.5 до 2%.

Заявляемый способ позволяет получать смешанные растворы акриламид/акрилат аммония в соотношениях от 0,5:99,5 до 99,5:0,5.

Пример 1.

5 мл культуры штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1728, предварительно выращенной в течение 2 суток при 30°С на среде следующего состава (мас.%): K₂HPO₄·3Н₂О - 0.05; КН₂PO₄ - 0.05; MgSO₄·7Н₂O - 0.05; FeSO₄·7H₂О - 0.0005; CoCl₂·6H₂O - 0.001; глюкоза - 4; мочевина - 0,2, вода - остальное, вносят в колбу Эрленмейера, содержащую 150 мл питательной среды того же состава, и инкубируют в течение 72 ч при 30°С и перемешивании со скоростью (200 об/мин). Клетки отделяют с помощью центрифугирования (10000 об/мин). Часть клеток хранят в замороженном виде при - 20°С, а оставшуюся часть суспендируют в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7.0) (Рабинович и Хавин. Краткий химический справочник, М.: Химия, 1991, стр.280) до концентрации 12,0 мг клеток/мл и хранят при +4°С. Полученные таким образом клетки обладают удельной нитрилгидратазной активностью 120 ед/мг и амидазной активностью 2,5 ед/мг.

Пример 2.

2,1 мл суспензии клеток заявляемого штамма, полученной, как в примере 1, вносят в стеклянный сосуд объемом 100 мл с магнитной мешалкой и системой термостатирования. Затем туда же добавляют 17,7 мл дистиллированной воды. С помощью перистальтического насоса с постоянной скоростью 1,06 мл/ч в реакционную смесь добавляют чистый акрилонитрил. Процесс проводят при перемешивании со скоростью 200 об/мин и температуре 18-20°С. Через 5 часов процесс завершают, клетки отделяют центрифугированием (10000 об/мин), а в полученном супернатанте определяют концентрации акриламида и акрилата аммония, которые равны 20% и 10% соответственно.

Пример 3.

Процесс осуществляют, как в примере 2, но суспензию заявляемого штамма вносят в количестве 4,2 мл, дистиллированную воду добавляют в количестве 15,6 мл. В результате получают раствор, содержащий 15,3% акриламида и 16% акрилата аммония.

Пример 4.

Процесс осуществляют, как в примере 2, но суспензию заявляемого штамма вносят в количестве 6,7 мл, дистиллированную воду добавляют в количестве 13,1 мл. В результате получают раствор, содержащий 10,6% акриламида и 19,6% акрилата аммония.

Пример 5.

В стеклянный сосуд объемом 1000 мл с магнитной мешалкой и системой термостатирования вносят 238 мл 40% раствора акриламида, полученного из акрилонитрила с помощью биокатализатора М33 (патент РФ 2053300), 95,2 мл клеточной суспензии заявляемого штамма, полученной, как в примере 1, и 23,8 мл дистиллированной воды. Процесс ведут при 18-20°С и постоянном перемешивании (200 об/мин). Через пять часов реакцию останавливают, отделяя клетки с помощью центрифугирования (10000 об/мин). Полученный раствор содержит 15,2% акриламида и 15,5% акрилата аммония.

Пример 6.

Для получения иммобилизованной формы биокатализатора к 2 мл клеточной суспензии (40 мг клеток по сухой массе/мл), полученной, как в примере 1, добавляют 2,25 мл раствора, содержащего 20% акриламида и 0,8% N,N-метиленбисакриламида. Добавляют 250 мкл 1,6% раствора персульфата калия и 25 мкл N-тетраметилэтилендиамина (ТЕМЕД). Процесс гелеобразования проводят при 4°С в течение 60 мин. Блок геля механически фрагментируют, используя сито с диаметром отверстий 0,25 мм.

4,5 г полученных гранул вносят в стеклянный сосуд объемом 100 мл с магнитной мешалкой и системой термостатирования. Затем в сосуд добавляют 20,0 мл дистиллированной воды. Чистый акрилонитрил добавляют в реакционную смесь с помощью перистальтического насоса с постоянной скоростью 1,0 мл/ч при температуре 18-20°С. Через 5 ч после отделения гранул центрифугированием (5000 об/мин) получают раствор, содержащий 9,4% акриламида и 11,5% акрилата аммония.

Таким образом, получен штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1728, обладающий уникальной ферментной системой гидролиза нитрилов и амидов, включающей ферменты нитрилгидратазу и амидазу. На его основе разработан способ получения акриловых мономеров, позволяющий получать смешанные растворы двух мономеров - акриламида и акрилата аммония в различных соотношениях.

Штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1728 рекомендуется использовать для промышленного получении акриловых мономеров.