СУХАЯ КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ВИРУСВАКЦИНА ПРОТИВ ЧУМЫ МЕЛКИХ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к разработке вирусвакцины, предназначенной для специфической профилактики чумы мелких жвачных животных.

В неблагополучных по чуме мелких жвачных животных странах для специфической профилактики болезни применяют вирусвакцины, полученные на основе аттенуированных штаммов вирусов чумы мелких жвачных животных (ЧМЖЖ) и чумы крупного рогатого скота (ЧКРС), которые имеют между собой антигенное родство и генетическое сходство [4, 7, 8, 9, 10].

Имеются также сообщения о разработке инактивированных и рекомбинантных вакцин, которые, однако, не нашли широкого применения в ветеринарной практике [1, 2].

Гетерологичные вакцины, полученные на основе вакцинного вируса ЧКРС, защищают овец и коз от клинического проявления ЧМЖЖ, но не предотвращают размножение в организме вирулентного вируса. В связи с этим авторы не рекомендуют использовать такие препараты для вакцинации мелких жвачных животных [3, 6].

Для специфической профилактики болезни в неблагополучных зонах широко применяют вирусвакцины, которые получают на основе аттенуированного штамма "Nigeria 75/1" вируса ЧМЖЖ и его вариантов [2, 5, 10].

Неблагоприятная эпизоотическая ситуация по ЧМЖЖ в 1990-2003 гг.на территории ряда государств (Индия, Турция, Иран, Ирак, Израиль и др.), имеющих торгово-экономические связи с Россией, и отсутствие в стране вакцины против этой болезни указывали на необходимость разработки средств специфической профилактики против чумы мелких жвачных животных.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению (прототип) является вирусвакцина из штамма "75/1 LK6 ВК2 Vero70", создающая напряженный иммунитет у животных через 21 день после прививки длительностью более одного года [10]. Однако недостатком указанной вирусвакцины является то, что вакцинный вирус культивируют в перевиваемой культуре клеток VERO, которую выращивают на питательной среде Игла MEM с фетальной сывороткой теленка, имеющей высокую стоимость.

Целью изобретения является сухая культуральная вирусвакцина против чумы мелких жвачных животных, обладающая высокой иммуногенностью, безвредностью, ареактогенностью для овец и коз и низкой себестоимостью.

Поставленная цель достигается использованием при конструировании вирусвакцины нового вакцинного штамма "45G37/35-К" вируса ЧМЖЖ, выращенного в первичной культуре клеток почки или тестикул ягненка на питательной среде культивирования Игла MEM или ГЛА с сывороткой крови КРС.Ее используют вместо фетальной сыворотки теленка, которая не производится в России и странах СНГ, это значительно снижает себестоимость вакцины.

Вакцинный штамм селекционирован пассированием аттенуированого штамма "45g" в первичных культурах клеток почки и тестикул ягненка и перевиваемой - почки сайги. Штамм безвреден и ареактогенен для овец и коз, обладает высокой иммуногенностью и накапливается в этих культурах клеток в титре 5,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³. Указанный штамм депонирован 14.12.04 г. в качестве производственного в Государственной коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств и кормов (ФГУ ВГНКИ), имеет регистрационый шифр "45G37/35-K".

Сухая культуральная вирусвакцина против чумы мелких жвачных животных, включающая вируссодержащий культуральный материал из аттенуированного штамма вируса чумы мелких жвачных животных и защитную среду, при этом в качестве вируссодержащего культурального материала вакцина содержит вируссодержащий культуральный материал аттенуированного штамма "45G37/35-К" с титром инфекционной активности 5,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и защитную среду при содержании компонентов 1:1. В качестве защитной среды она содержит среду следующего состава, мас.%: ферментативный пептон 9,8-10,2; лактоза 1,8-2,2; дистиллированная вода - остальное.

Авторами разработаны требования к сухой культуральной вирусвакцине против чумы мелких жвачных животных, которые включают следующие характеристики: титр вакцинного вируса в сухом препарате составляет не менее 4,5 lg ТЦД₅₀/см³; прививная доза вакцины - не менее 1000 ТЦД₅₀; длительность иммунитета - не менее 12 месяцев; срок хранения вакцины при температуре 4±4°С и -40±1°С и ниже - 12 и 24 месяцев соответственно; остаточная влажность 1-4%; в ампулах (флаконах) с вакциной должен быть вакуум.

В примерах конкретного исполнения приведены сведения по изготовлению 2-х опытных серий вирусвакцины и их физико-химические и иммунобиологические характеристики.

Пример 1. Изготовление вирусвакцины

Для приготовления двух серий вирусвакцины используют вируссодержащее сырье, полученное в стационарном монослое первичной культуры клеток почки ягненка на основе штамма "45G37/35-K". Культуру клеток выращивают в питательной среде Игла MEM с 10% сыворотки КРС. Через 72 часа матрасы с культурой клеток (по 10 матрасов на каждую серию вакцины) заражают вирусом в дозе 0,01 ТЦД₅₀/кл и культивируют в течение 7 суток до появления характерного цитопатогенного действия. Через 3-е суток культивирования проводят смену поддерживающей питательной среды. Активность полученного культурального вируса серии 1 составляет 5,7 lg ТЦД₅₀/см³ серии 2-5,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Каждую серию вируссодержащего культурального материала (1000 мл) объединяют с таким же количеством (1000 мл) защитной среды, содержащей (мас.%): ферментативного пептона - 10; лактозы - 2; дистиллированной воды - остальное.

Приготовленную технологическую жидкость тщательно перемешивают и расфасовывают в ампулы по 1 см³. Сушку вакцины проводят на сублимационном аппарате ТГ-50, предварительно заморозив смесь до -50°С. Время сушки вакцины серий 1 и 2 составляет 34 и 37 часов соответственно, ампулы с вакциной подвергают вакуумной обработке. Остаточная влажность в вакцине серии №1 и №2 составила 3,0 и 3,2% соответственно. Рост бактериальной и грибной микрофлоры в вакцине не выявлен.

Пример 2. Контроль биологических показателей вакцины.

Полученные серии вирусвакцины изучают по следующим показателям: биологическая активность, безвредность и иммуногенная активность.

Биологическая активность

Титрование вирусвакцины проводят в монослойной пробирочной культуре клеток почки сайги в 3-х повторностях по общепринятой методике. Активность вирусвакцины серии №1 составляла 5,25 ТЦД₅₀/см³, серии №2-5,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Безвредность

Безвредность каждой серии вирусвакцины изучают на 2-х ягнятах трехмесячного возраста, которым вводят подкожно с внутренней поверхности бедра неразведенную вакцину в объеме 1,0 см³. Все животные оставались клинически здоровыми в течение 21 суток наблюдения.

Иммуногенная активность

Иммуногенную активность вакцины определяют на овцах и кроликах (по 3 головы на каждую серию) по уровню накопления ВН-антител через 14 суток после прививки и по результатам контрольного заражения овец. У привитых вирусвакциной в дозе 1000 ТЦД₅₀ овец не наблюдали повышения температуры тела и признаков болезни, т.е. штамм не был реактогенным. В указанные сроки титр ВН-антител в сыворотках крови животных составил 1:8-1:16.

Привитые овцы не заболели после заражения вирулентным вирусом в дозе 1000 ИД₅₀, тогда как контрольные животные (2 головы) заболели чумой мелких жвачных с проявлением характерных клинических признаков болезни на 5-10 сутки после инфицирования.

Пример 3. Изучение стабильности физико-химических свойств и биологической активности вакцины при хранении.

Сохраняемость сухой вирусвакцины серий №1 и №2 изучают в течение 12 и 24 месяцев хранения при температурах 4±4°С и -40±1°С соответственно. Через указанное время вакцина сохраняла исходную активность, которая для серий №1 и №2 составляла 5,25 lg ТЦД₅₀/см³ и 5,0 lg ТЦД₅₀/см³ соответственно.

Остаточная влажность оставалась на исходном уровне в вакцине серии №1 - 3,0%, серии №2 - 3,2%, в ампулах сохранялся вакуум.

Таким образом, по иммунобиологическим и физико-химическим показателям испытуемые серии вирусвакцины против чумы мелких жвачных животных соответствовали разработанным требованиям.

Сухая культуральная вирусвакцина против чумы мелких жвачных с положительным результатом прошла межведомственные комиссионные испытания (с участием ФГУ ВГНКИ) и признана безвредным, высокоиммуногенным и стабильным при хранении препаратом.

Источники информации

1. Abegunde A., Ada F.D. // Bull Anim. Hith. Prod. In Africa, 1977, Vol 25, 3.

2. Berhe G. et al. // Journal of Virology, 2003, Vol.77, 2.

3. Burdin P. // Rev. Elev. Med. Vet. Paes. Trop, 1973, Vol.26, 3.

4. Diallo. A. // Dev Biol (Basel), 2003,114:113-9.

5. Diallo A. et al. // Rev. Elev. Med. Vet. Pays. Trop, 1989, Vol.42.

6. Gibbs E. P. J. et al. Intervirology, 1979, 11.

7. M.H.V. van Regenmortel et al. // Academic Press, 2000, San Diego.

8. Sarkar J. et al. // Vaccine, 2003, Dec 1;21(32).

9. Wosu L.O.I I Studies Res. Vet. Med., 1994, Vol.2

10. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines: list A and В discases of mammals, birds and bees. Office International des Epizooties (OIE) world organisation for Animal health. 2000. P. 114-122.