Результат интеллектуальной деятельности: Способ отбора материнских растений Picea pungens Engelm., продуцирующих семенное потомство с разным уровнем стабильности генетического материала и лучшими морфометрическими показателями

Изобретение относится к способам выращивания растений, а именно к способам селекции, и может быть использовано для отбора материнских растений Picea pungens Engelm., продуцирующих семенное потомство с высоким уровнем стабильности генетического материала и с лучшими морфометрическими показателями, в частности, для выделения растений-маточников.

Определенная скорость роста растений в раннем возрасте в значительной степени обусловлена генетически. Ранний отбор перспективных растений позволяет не только сократить время процесса акклиматизации, но и может способствовать улучшению генетического фонда растений-интродуцентов. Качество создаваемых посадок интродуцентов, их устойчивость в новом климате и продуктивность (в широком смысле слова) в конечном счете определяются посевными и наследственными свойствами семян (Шкутко Н.С. Хвойные Белоруссии: эколого-биологические исследования / Н.С. Шкутко. - Минск: Наука и техника, 1991. - 264 с.).

Высокая генетическая гетерогенность внутри популяции по каким-либо признакам способствует выживанию видов древесных в неблагоприятных условиях, что было показано у бука европейского и некоторых хвойных (сосны обыкновенной, ели красной и др.) (Geburek, Th., F. Scholz, W. Knabe and A. Vomweg. Genetic studies by isozyme gene loci on tolerance and sensitivity in an air polluted Pinus Sylvestris field trial. Silvae Genetica. - 1987. - V. 36, №2. - P. 49-53. Hertel H. Aims and results of basic research in the Institute of forest tree breeding in Waldsieversdorf, Germany. 2. The use of enzyme gene marks for practical breeding tasks / H. Hertel // Silvae Genetica. - 1992. - V. 41, №3. - P. 201-204. Коршиков И.И. Сравнительный анализ генетической изменчивости 2-х групп деревьев сосны крымской, отличающихся по степени повреждаемости поллютантами, в насаждениях г. Мариуполя / И.И. Коршиков, С.А. Бычков // Цитология и генетика. - 2001. - Т. 35. - №2. - С. 30-39.). В связи с этим для селекции на устойчивость к факторам среды необходимо выявлять наиболее резистентные экземпляры.

Основной метод селекции хвойных, в частности, ели считается отбор из-за высокой длительности получаемых результатов. Самый распространенный - массовый отбор в ходе селекционной инвентаризации естественных древостоев (Царев А.П., Погиба С.П., Тренин В.В. Селекция и репродукция лесных древесных пород: Учебник / Под ред. А.П. Царева. - М.: Логос, 2002. - 520 с.). Указывают на большую эффективность массового отбора деревьев ели, чем сосны обыкновенной, поскольку у последней такой количественный признак, как высота, наследуется слабее, чем у ели обыкновенной (Селекция лесных пород. - М.: Лесная промышленность, 1982. - 223 с.). Однако при массовом отборе невозможно выделить конкретный ценный индивид для получения от него слабомутабельного и быстрорастущего потомства. Использование индивидуального отбора и смешанных методов (индивидуально семейного и семейно-группового) позволяет устранить данный недостаток.

Индивидуальный отбор состоит в том, что отбирают растения, потомство каждого из которых размножают в дальнейшем отдельно. Исходные родоначальные особи, т.е. первоначально отобранные растения, многократно проверяют по потомству. Сущность данного метода заключается в повторяемом отборе лучших растений из лучших семей, однако высокая длительность эксперимента для лесных древесных растений (из-за поэтапной оценки потомства требуется 70-100 лет) значительно осложняет работу и не позволяют провести генетическую оценку качества семян. Чаще всего оценка качества семян осуществляется на основе исследования фенотипических показателей. Отбор в питомниках и среди семян может включать сортировку растений по величине, по массе и всхожести семян (Царев А.П., Погиба СП., Тренин В.В. Селекция и репродукция лесных древесных пород: Учебник / Под ред. А.П. Царева. - М.: Логос, 2002. - 520 с.) Отбор на быстроту роста производят, в основном, по фенотипу, а также связывают данный признак с массой семян (Селекция лесных пород. - М.: Лесная промышленность, 1982. - 223 с.).

Однако успешное вегетативное размножение ели возможно до 10-летнего возраста материнского древа, следовательно, большое значение приобретает ранняя диагностика исходного материала и отбор отдельных материнских растений, еще не вступивших в генеративную фазу (которая у хвойных наступает в 15-18 лет). Вследствие постоянного переопыления и расщепления признаков сорта у перекрестноопыляющихся растений, его нельзя вывести путем однократного индивидуального отбора.

Испытание по потомству - необходимый этап селекционной работы, поэтому диагностика цитогенетических признаков, проводимая на ранних стадиях онтогенеза, приобретает важное значение как на стадии отбора исходного материала (многолетних) древесных растений, так и на последующих стадиях селекционного процесса.

Возможность генетической оценки качества семян и ранней диагностики сеянцев предоставляет цитогенетический метод, выявляющий ростовую способность (по митотической активности) и нарушения развития (по уровню патологий митоза) на клеточном уровне. Кроме того, данный метод позволяет провести одновременно отбор определенных материнских растений по уровню стабильности генетического материала его семенного потомства и генетическую оценку (т.е. проверку) самого потомства. Таким образом, возможно осуществление отбора материнских растений и первоначальной проверки по потомству в кратчайшие сроки: в течение одного вегетационного сезона. Дальнейшее наблюдение за сеянцами в течение полутора-двух лет позволяет разделить растения на группы по быстроте роста и выявить экземпляры с лучшими морфометрическими показателями.

Известно, что интродукция древесных растений основана на фенотипической приспособительной изменчивости, ее возможности определены генотипом интродуцента, сложившимся в эколого-географических условиях его родины (Шкутко Н.С. Хвойные Белоруссии: эколого-биологические исследования / Н.С. Шкутко. - Минск: Наука и техника, 1991. - 264 с.). Определение цитогенетических характеристик в клетках корневой меристемы проростков семян (анализ начальных митотических делений) позволяет разделить семенное потомство на группы стабильности генетического материала уже на первых этапах развития организма, а впоследствии выявлять наиболее резистентные и неустойчивые по цитогенетическим показателям родительские особи.

Предлагаемый нами способ отбора отличается тем, что предусматривает оценку цитогенетических характеристик семенного потомства каждого из материнских растений Picea pungens Engelm. и отдельно каждого проростка (индивида), т.е. индивидуальный сбор данных. Это позволяет выявлять уровень нарушений генетического материала и митотическую активность клеток, прямо или косвенно свидетельствующие о цитогенетической стабильности материнских растений и их семенного потомства.

Известно использование ранее группового способа отбора проростков с разным уровнем мутабильности и выделения мутабильных и слабомутабильных групп по 16-18 цитогенетическим показателям (Артюхов В.Г., Калаев В.Н., Карпова С.С. Цитогенетический полиморфизм семенного потомства деревьев березы повислой (Betula pendula Roth.), произрастающих в различных экологических условиях // Экологическая генетика. - 2009. - Т. 7. - №1. - С. 30-40).

Задачей изобретения была разработка способа отбора материнских растений Picea pungens Engelm., продуцирующих семенное потомство с разным уровнем стабильности генетического материала и морфометрическими показателями.

Технический результат заключается в отборе материнских экземпляров Picea pungens Engelm., продуцирующих семенное потомство с разным уровнем стабильности генетического материала и морфометрическими показателями, относительно быстрым и простым способом.

Технический результат достигается тем, что в способе отбора материнских растений Picea pungens Engelm., продуцирующих семенное потомство с разным уровнем стабильности генетического материала, включающем сбор и проращивание семян фенотипически здоровых материнских растений Picea pungens Engelm., приготовление из корешка каждого проростка длиной 0,5-1 см постоянно-давленного микропрепарата, анализ следующих цитогенетических показателей каждого микропрепарата: «митотический индекс с учетом стадии профазы» как отношение числа делящихся клеток в про-, мета-, ана-, телофазе митоза к общему числу подсчитанных клеток (в %), «митотический индекс без учета стадии профазы» как отношение числа делящихся клеток в мета-, ана-, телофазе митоза к общему числу подсчитанных клеток (в %), «% клеток в профазе» как отношение числа клеток в профазе к числу делящихся клеток, «% клеток в метафазе» как отношение числа клеток в метафазе к числу делящихся клеток, «% клеток в анафазе» как отношение числа клеток в анафазе к числу делящихся клеток, «% клеток в телофазе» как отношение числа клеток в телофазе к числу делящихся клеток, «уровень патологий митоза» как отношение числа клеток с нарушениями митоза в мета-, ана-, телофазе к числу митотически делящихся клеток на стадии мета-, ана-, телофазы, в %; согласно изобретению, проводят анализ не менее 19 (нечетное количество) микропрепаратов и не менее 300 клеток каждого микропрепарата, полученные значения цитогенетических показателей сравнивают со значениями для мутабильной или слабомутабильной групп, причем показатель «митотический индекс с учетом стадии профазы» относится к слабомутабильной группе при значении 8-13%, «митотический индекс без учета стадии профазы» - при значении 5-8%, «% клеток в профазе» - при значении не более 40%, «% клеток в метафазе» - при значении не более 25%, «% клеток в анафазе» - при значении 10-40%, «% клеток в телофазе» - при значении 15-45%), «уровень патологий митоза» - при значении менее 5%, в противном случае показатели относятся к мутабильной группе; если более 3 показателей оказались в слабомутабильной группе, то и проросток относят к слабомутабильной группе, а если 3 и менее, то к мутабильной; если не менее половины проростков оказались в слабомутабильной группе, уровень стабильности генетического материала материнского растения оценивается как высокий, если менее - то как низкий.

На фиг. 1 приведена Таблица 1 цитогенетических характеристик семенного потомства материнских растений Picea pungens Engelm. с разной стабильностью генетического материала.

На фиг. 2-5 приведены Таблицы 2-5 цитогенетических характеристик семенного потомства материнских растений Picea pungens Engelm. №1-4, где № пр - № препарата; МИ, % - «митотический индекс с учетом стадии профазы»; МИ без П, % - «митотический индекс без учета профаз»; П, % -«% клеток в стадии профазы»; М, % - «%» клеток в стадии метафазы»; А, % - «% клеток в стадии анафазы»; Т, % - «% клеток в стадии телофазы»; ПМ, % - «уровень патологий митоза»; № гр - № группы: 1 - слабомутабильная, 2 - мутабильная.

На фиг. 6-9 приведены Таблицы 6-9 морфометрических параметров сеянцев из семян Picea pungens материнского растения 1-4 по группам.

В предлагаемом способе анализируется семенное потомство от индивидуального материнского растения и установлены исследуемые цитогенетические показатели, по которым оценивают уровень стабильности генетического материала проростков, что упрощает и ускоряет получение научных данных, а также позволяет быстрее внедрить результаты отбора в производство при выращивании посадочного материала. Таким образом, возможно осуществить отбор материнских растений и первоначальную проверку по потомству в кратчайшие сроки. Отбор материнских растений с помощью цитогенетического метода включает сбор, проращивание семян, изготовление и анализ микропрепаратов, все исследование занимает 1 вегетационный сезон (2-3 месяца), т.е. значительно сокращается время постановки эксперимента по сравнению с традиционным индивидуальным отбором по морфологическим признакам, который может длиться несколько сезонов или даже десятков лет (Царев А.П., Погиба С.П., Тренин В.В. Селекция и репродукция лесных древесных пород: Учебник / Под ред. А.П. Царева. - М.: Логос, 2002. - 520 с.).

Цитогенетические показатели проростков семян от каждого материнского определяют растения в отдельности: митотический индекс (подсчитанный с учетом и без учета стадии профазы), % клеток в про-, мета-, ана-, телофазе, уровень патологий митоза, на основании которых семенное потомство разделяют на группы по цитогенетической стабильности, после чего делают вывод по цитогенетическим характеристикам большинства проростков о том, какое семенное потомство по стабильности генетического материала продуцируют материнские растения.

Классификацию патологических митозов проводят по И.А. Алову (Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. М.: Медицина, 1972. 264 с.).

Митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы, отражает пролиферативную активность меристематической ткани проростка. Митотический индекс, подсчитанный без учета клеток на стадии профазы, является «репером» задержки клеток на стадиях митоза (Артюхов В.Г., Калаев В.Н. Цитогенетические показатели семенного потомства деревьев дуба черешчатого, подвергшихся воздействию радиоактивности в результате аварии на Чернобыльской АЭС и произрастающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения // Радиационная биология. Радиоэкология. 2005. Т. 45. №1. С. 619-628.), что, по мнению И.А. Алова, является нарушением нормального протекания процесса митоза (Алов И.А. Патология митоза (формы патологии, классификация, - количественная характеристика) / И.А. Алов // Вестник АМН СССР. 1965. - №11. - С. 58-66).

Увеличение числа клеток в профазе свидетельствует о задержке клеток на данной стадии в связи с нарушениями митотического аппарата и работой системы checkpoint-контроля целостности генетического материала (Лебедева И.Н., Федорова С.А., Трунова С.А., Омельянчук Л.В. Митоз. Регуляция и организация деления клеточного ядра // Генетика. - 2004. - Т. 40. - №12. - С. 1589-1608).

Увеличение числа клеток на стадии метафазы, согласно И.А. Алову, можно рассматривать как патологию митоза, связанную с повреждением веретена деления клетки и неспособности клеток перейти на следующую стадию митоза (Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. М.: Медицина, 1972. 264 с.). Задержка клеток на стадии анафазы-телофазы митоза обусловлена нарушением процессов цитотомии и формирования клеточной стенки (Казанцева И.А. Патология митоза в опухолях человека / И.А. Казанцева. - Новосибирск, 1981. - 114 с.).

Использование в качестве критериев отбора материнских растений Picea pungens Engelm. цитогенетических характеристик их семенного потомства позволяет оценивать стабильность генетического материала проростков, полученных от определенных материнских растений, и выделять материнские экземпляры, продуцирующие семенное потомство с разным уровнем стабильности генетического материала.

Пример.

Для цитогенетического исследования семенного потомства Picea pungens Engelm. используют зрелые семена, собранные от каждого в отдельности фенотипически здорового материнского растения (без визуальных повреждений паразитами). Семена проращивают в чашках Петри при температуре +25°С. По достижении корешками длины 0,5-1 см их фиксируют в 9 часов утра в ацетоалкоголе - смеси 96% этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), после чего материал хранят в холодильнике при температуре +4°С. Из корешков проростков готовят постоянно-давленные микропрепараты с использованием жидкости Гойера, описанный ранее (Буторина А.К., Калаев В.Н., Вострикова Т.В., Мягкова О.Н. Цитогенетическая характеристика семенного потомства дуба черешчатого (Quercus robur L.), сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), березы повислой (Betula pendula Roth.) в условиях антропогенного загрязнения города Воронежа // Цитология. 2000. Т. 42. №2. С. 196-201.).

Корешки проростков подвергали мацерации в 18% растворе HCl при 60°С в течение 1-2 минут.Затем промывали в растворе 45% уксусной кислоты 15 минут. Корешки окрашивали ацетогематоксилином в течение 1-1,5 часов, ополаскивали дистиллированной водой и готовили давленные микропрепараты с использованием жидкости Гойера по методике: 1) отделить кончик корешка проростка (1-3 мм) препаровальной иглой; 2) поместить его на предметное стекло в каплю жидкости Гойера; 3) накрыть покровным стеклом и слегка подогреть над пламенем спиртовки (для лучшего распределения клеток); 4) придавить кончик корешка, постукивая легкими ударами ручкой препаровальной иглы.

Анализировали цитогенетические характеристики 19 проростков семян 1 и 3 экземпляра материнского растения и 21 проростка 2 и 4 экземпляра. Препараты изучали с помощью микроскопа LABOVAL-4 (Carl Zeiss, Jena) при общем увеличении 40×1,5×10. В каждом микропрепарате (1 препарат соответствует 1 корешку и одному проростку) анализировали от 300 до 500 клеток.

На микропрепаратах подсчитывают общее число клеток, число митотически делящихся клеток на стадиях профазы, метафазы, анафазы, телофазы митоза; число клеток с нарушениями деления (число делящихся клеток с патологиями митоза).

На основании проведенных подсчетов и измерений определяют цитогенетические показатели каждого проростка и сравнивают со значениями, представленными в таблице 1, и относят проросток к мутабильной или слабомутабильной группе.

Например, у материнского растения №2 Picea pungens Engelm., большая часть семенного потомства имела цитогенетические показатели, полностью соответствующие мутабильной группе согласно таблице 1. Некоторые проростки (№4, 6-7) включены в слабомутабильную группу по большинству показателей (исключение составил показатель «уровень патологий митоза», который соответствовал мутабильной группе) (табл. 3). Для проростка №20 показатели митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы, уровень патологий митоза и число клеток в профазе соответствовали мутабильной группе, однако большинство других показателей (4): митотический индекс, подсчитанный без учета стадии профазы, число клеток в метафазе, анафазе, телофазе позволили отнести проросток к слабомутабильной группе (табл. 3). К мутабильной группе отнесены проростки №8-19, 21 по большинству исследованных цитогенетических показателей в соответствии с таблицей 1.

Поскольку 8 проростков относятся к слабомутабильной группе, 13 проростков к - мутабильной, по большему количеству мутабильных проростков, материнское растение №2 можно назвать маточником, продуцирующим мутабильное семенное потомство.

Все проанализированные по цитогенетическим показателям проростки остальных материнских растений соответствовали слабомутабильной группе (табл. 2, 4-5). Анализируя цитогенетические показатели каждого проростка, выявили, что материнские растения №1, 3, 4 Picea pungens Engelm. продуцируют слабомутабильное семенное потомство.

Таким образом, исследованные растения Picea pungens №1, 3, 4 можно назвать маточниками, продуцирующими слабомутабильное семенное потомство, растение №2 - маточник, продуцирующий мутабильное семенное потомство.

Известно, что при использовании в селекции на быстроту роста двух и более признаков точность прогнозирования существенно не повышается (Царев А.П., Погиба С.П., Тренин В.В. Селекция и репродукция лесных древесных пород: Учебник / Под ред. А.П. Царева. - М.: Логос, 2002. - 520 с.). Следовательно, основным признаком, является «высота побега» или «высота растения» для оценки развития сеянцев.

Число листьев считается наиболее объективным признаком степени развития растения (Флинт В.Е., Смирнова О.В., Заугольнова Л.Б., Ханина Л.Г., Бобровский М.В., Торопова Н.А., Мелехова О.П., Сорокин А.Г. Сохранение и восстановление биоразнообразия. М.: Издательство Научного и учебно-методического центра, 2002. 286 с. Жидких О.Ю., Сорокопудов В.Н., Сорокопудова О.А., Бриндза Я. Некоторые особенности онтогенеза Mahonia aquifolium (Pursh) Nutt // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Естественные науки. - 2012. - Т. 21. -№21-1 (140). - С. 62-67), поэтому данный показатель может быть одним из главных морфометрических критериев учета ростовой активности сеянцев. У хвойных признак «число листьев» можно заменить на показатель «число хвоинок».

Результаты анализа морфометрических параметров сеянцев из семян Picea pungens по показателям длина корня, высота побега, длина хвоинок приведены фиг. 6-9. 1-й замер произведен в сентябре (через полгода после посева), 2-й замер - в сентябре следующего года. Различия показателей между группами достоверны: * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001.

По совокупности морфометрических характеристик анализируемые сеянцы каждого дерева были разделены на группы: быстрорастущие и медленнорастущие. Быстрорастущие имеют большую длину корня, высоту побега, число хвоинок по сравнению с группой медленнорастущих (табл. 6-9). У сеянцев от материнского растения №2, продуцирующего преимущественно мутабильные проростки, морфометрические характеристики были ниже (Р<0,05), чем таковые у потомства остальных деревьев (табл. 7), что указывает на существование связи между морфометрическими и цитологическими признаками семенного потомства и сеянцев, полученных из данного семенного потомства. Действительно, цитогенетические показатели показали связь с морфометрическими. Например, высокой положительной корреляцией связаны «митотический индекс, подсчитанный без учета стадии профазы» и «высота побега», где r_s=0,9-0,95 (Р<0,05); «митотический индекс, подсчитанный без учета стадии профазы» и «число хвоинок», где r_s=0,87-0,9 (Р<0,05). Отрицательной корреляцией характеризовались параметры: «уровень патологий митоза» и «высота побега», где r_s=-0,88-0,9 (Р<0,05); «уровень патологий митоза» и «число хвоинок», где r_s=-0,9-0,93 (Р<0,05).

Таким образом, выявленные корреляционные связи между морфометрическими и цитологическими признаками семенного потомства интродуцентов показывают, что из цитогенетически стабильного семенного потомства получены сеянцы с лучшими ростовыми характеристиками. Материнские экземпляры Picea pungens Engelm., могут быть использованы для получения генетически стабильного семенного потомства. Оценку качества семян по цитогенетическим показателям рекомендуется использовать в селекции древесных растений. Быстрорастущие и медленнорастущие сеянцы применимы в озеленении. Растения, продуцирующие мутабильное семенное потомство, в дальнейшем могут быть использованы в генетико-селекционных исследованиях как источники материала для выведения новых форм и сортов декоративных растений.