Результат интеллектуальной деятельности: Фитосредство, обладающее мембраностабилизирующим действием при гипоксии головного мозга

Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической фармакологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции нарушений ЦНС, и касается лекарственных средств, обладающих мембраностабилизирующим действием при гипоксии головного мозга, получаемых из растительного сырья.

Коррекция нарушений функций головного мозга представляет актуальную проблему для медицины. Эффективное функционирование нейронов и глиальных клеток возможно только при условии полноценного обеспечения тканей мозга кислородом, что является важнейшим условием нормальной жизнедеятельности человека. Гипоксические нарушения вызывают каскад биохимических процессов, включающих нарушения мембранной целостности и ионного транспорта, прогрессирующий протеолиз, расстройства функционального взаимодействия нейромедиаторов, индукцию апоптоза, что приводит к гибели нервных клеток. Современную стратегию терапии подобных изменений невозможно представить без мембранопротекции [1-4].

Несмотря на разнообразие средств, обладающих мембраностабилизирующим действием при гипоксии головного мозга, существующие лекарственные препараты этого класса имеют недостаточную эффективность, вызывают побочные эффекты. Известным средством с мембраностабилизирующим действием при гипоксии головного мозга является пирацетам, для которого характерна невысокая эффективность и побочные эффекты (нарушение сна, повышение судорожной готовности, общее стимулирующее действие) [4-6].

Особый интерес в терапии нарушений функциональной активности головного мозга представляют средства растительного происхождения, обладающие выраженным фармакотерапевтическим действием и низкой токсичностью.

Адекватного прототипа в литературе не обнаружено.

Техническим результатом данного изобретения является расширение арсенала средств растительного происхождения, обладающих мембраностабилизирующим действием при гипоксии головного мозга.

Технический результат достигается благодаря применению настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., полученного обработкой измельченной до 1-3 мм надземной части манжетки водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:20 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 45 мин, процеживанием и отжиманием сырья, доведением объема полученного настоя до 200 мл, при этом настой в качестве активных веществ содержит 7,7% эллаготанинов и 7,1% полисахаридов, в качестве средства с мембраностабилизирующим действием при гипоксии головного мозга.

Новым является то, что впервые в качестве фитосредства, обладающего мембраностабилизирующим действием при гипоксии головного мозга, используют настой манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., полученный обработкой измельченной до 1-3 мм надземной части манжетки водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:20 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением при: комнатной температуре в течение 45 мин, процеживанием и отжиманием сырья, доведением объема полученного настоя до 200 мл, при этом настой в качестве активных веществ содержит 7,7% эллаготанинов и 7,1% полисахаридов.

В народной медицине надземную часть манжетки обыкновенной используют в качестве отхаркивающего. противовоспалительного, противодиабетического, диуретического, ангиопротекторного средства, а также для улучшения обмена веществ, при атеросклерозе, малокровии, кровотечениях и заболеваниях женской половой сферы [7]. В экспериментах показано ноотропное (патент РФ №2568843. МПК A61K 36/73, A61P 25/28, опубл. 2015 г.), лимфотропное [8], гиполипидемическое [8, 9], гипогликемическое, иммунокорригирующее [9], антиметастатическое действие [10] настоя и экстракта из травы манжетки сухого, гемореологическая активность спиртовой вытяжки, полифенольных соединений и флавоноидов из надземной части растения [11]. Кроме того, манжетка обыкновенная входит в состав средства для лечения бесплодия и сохранения беременности (заявка на патент РФ №94024627, МПК A61K 35/78, опубл. 1997 г.) и гомеопатического средства для лечения паразитарного холецистита, вызванного возбудителем «Opistorehis telineus» (патент РФ №2144372, МПК A61K 35/78, опубл. 2000 г.). В литературе отсутствуют данные о фитосредстве. обладающим мембраностабилизирующим действием при гипоксии головного мозга и представляющим собой настой манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., полученный обработкой измельченной до 1-3 мм надземной части манжетки водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:20 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 45 мин, процеживанием и отжиманием сырья, доведением объема полученного настоя до 200 мл, при этом настой в качестве активных веществ содержит 7,7% эллаготанинов и 7,1% полисахаридов.

В результате изучения химического состава надземной части манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. с помощью химических реакций, хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента, высокоэффективной жидкостной хроматографии, спектральных методов анализа обнаружены простые фенолы (арбутин), флавоноиды (кверцетин, кемпферол, лютеолин, апигенин, астрагалин, гиперозид, рутин, лютеолин-7-глюкозид, апигенин-7-глюкозид. другие гликозиды кверцетина и кемпферола; антоцианы; до 6%), фенолкарбоновые кислоты (n-кумаровая, синаповая, феруловая, кофейная, хлорогеновая, галловая; эллаговая), кумарины (умбеллиферон, эскулетин, скополетин, эскулин), дубильные вещества (эллаготанины, основной из которых - агримониин (3,5-3,8%) до 8%), водорастворимые полисахариды (состоящие из ксилозы, глюкозы и галактозы; 8,09±0,12%), углеводы, азотистые основания нуклеиновых кислот, аминокислоты (включая незаменимые - валин, лейцин, изолейцин, лизин, фенилаланин, треонин, метионин), высшие жирные кислоты и их производные (глицериды пальмитиновой и стеариновой кислот), витамины С (до 210 мг %) и В, макро- и микроэлементы.

Применение настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., полученного обработкой измельченной до 1-3 мм надземной части манжетки водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:20 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 45 мин, процеживанием и отжиманием сырья, доведением объема полученного настоя до 200 мл, при этом настой в качестве активных веществ содержит 7,7% эллаготанинов и 7,1% полисахаридов, по предлагаемому назначению стало возможным благодаря выявлению его новых свойств в эксперименте, а именно способности улучшать функции головного мозга за счет мембраностабилизирующего действия при его гипоксии.

Новые свойства настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., полученного обработкой измельченной до 1-3 мм надземной части манжетки водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:20 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 45 мин. процеживанием и отжиманием сырья, доведением объема полученного настоя до 200 мл, при этом настой в качестве активных веществ содержит 7,7% эллаготанинов и 7,1% полисахаридов, явным образом не вытекают из уровня техники в данной области и не являются очевидными для специалиста. Впервые установлено, что при гипоксии головного мозга в качестве фитосредства, обладающего мембраностабилизирующим действием, можно использовать настой манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., полученный обработкой измельченной до 1-3 мм надземной части манжетки водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:20 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 45 мин, процеживанием и отжиманием сырья, доведением объема полученного настоя до 200 мл, при этом настой в качестве активных веществ содержит 7,7% эллаготанинов и 7,1% полисахаридов.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемое средство с успехом может быть использовано в практическом здравоохранении для коррекции нарушений ЦНС.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания.

Получение настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., обладающего мембраностабилизирующим действием при гипоксии головного мозга, осуществляют путем обработки надземной части растения в инфундирном аппарате водой очищенной на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 45 мин и процеживании. Стандартизацию настоя осуществляют по содержанию эллаготанинов [12, 13] и полисахаридов [14] - важнейших групп соединений активного комплекса настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L.

Пример 1: Надземную часть манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L, собирали в фазу цветения. Высушенное воздушным способом сырье (влажность 6,0%) измельчали и просеивали через сито с диаметром отверстий 1-3 мм. Приготовление настоя осуществляли следующим образом: 10,0 г надземной части манжетки обыкновенной помещали в инфундирный аппарат, приливали 140 мл воды очищенной (1:10. с учетом коэффициента водопоглощения - 4,0), нагревали на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждали при комнатной температуре 45 мин. процеживали, отжимали сырье, доводили объем полученного настоя до 100 мл. Содержание эллаготанинов в настое составляет 7,7±0,12%, полисахаридов - 7,1±0,1%.

Пример 2: Надземную часть манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. собирали в фазу цветения. Высушенное воздушным способом сырье (влажность 6,0%) измельчали и просеивали через сито с диаметром отверстий 1-3 мм. Приготовление настоя осуществляли следующим образом: 10,0 г надземной части манжетки обыкновенной помещали в инфундирный аппарат, приливали 240 мл воды очищенной (1:20, с учетом коэффициента водопоглощения - 4,0), нагревали на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждали при комнатной температуре 45 мин, процеживали, отжимали сырье, доводили объем полученного настоя до 100 мл. Содержание эллаготанинов в настое составляет 6,7±0,09%. полисахаридов - 6,8±0,1%.

Фармакологические испытания проводили на 64 аутбредных мышах-самцах CD-I (I категории, согласно сертификату) массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей «Научно-исследовательского института фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга» Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук». Эксперименты осуществляли в зимний период. Работы в рамках экспериментальных методик выполняли с 9 до 15 ч. Животных содержали в стандартных условиях вивария на обычном рационе кормления (за исключением тех случаев, где иные условия оговариваются особо) в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (г. Страсбург, 1986).

О мембраностабилизирующем фармакологическом эффекте настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. судили по влиянию на структурно-функциональные нарушения в клетках головного мозга после гипоксии. В основе мембраностабилизирующего действия настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., содержащего 7,7% эллаготанинов и 7,1% полисахаридов в качестве активных веществ, лежит их способность прямо или косвенно влиять на биомембраны, что. в свою очередь, связано с ингибированием в них свободно-радикальных процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Согласно данным литературы [2-4] преобладающим механизмом повреждения мембран при гипоксии является процесс индукции ПОЛ. Процессы индукции ПОЛ под действием гипоксии оценивали по количеству свободных радикалов в реакции со стабильным свободным хромоген-радикалом 2.2-дифенил-1-пикрилгидразилом (ДФПГ) и содержанию тиобарбитурат-реактивных продуктов (ТБК-РП) в гомогенате головного мозга. Гипоксическое воздействие моделировали в условиях методики гипоксии гермообъема [15]. Животное помещали в герметически закрываемую камеру (объем 0,5 л), выдерживали до наступления атонального судорожного припадка. После этого его извлекали из камеры, регистрировали время от момента помещения в термокамеру до наступления атонального судорожного припадка (латентное время гипоксии), после чего животных выводили из эксперимента, извлекали мозг и помещали его в 2 мл физиологического раствора, содержащего трис-HCl буфер (рН 7.4). Далее мозг взвешивали и гомогенизировали в 9.0 мл среды, имеющей состав: 0,175 М KCl, 0,025 М трис-HCl буфер (pH 7,4), предварительно охлажденной до температуры 2°С. Процедуру осуществляли вручную в пластмассовом гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Стакан гомогенизатора был погружен в ледяную баню. Полученный гомогенат центрифугировали в рефрижераторной центрифуге «Biofuge Primo R» при 600 g в течение 10 мин и при температуре 2°С для осаждения фрагментов неразрушенной ткани.

Настой манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. и препарат сравнения вводили животным курсом ежедневно в течение пяти дней через зонд в желудок за час до начала экспериментальных манипуляций. Настой растения вводили в дозе 5 мл/кг. Указанная доза определена как наиболее активная в предварительных экспериментах [16]. Животные контрольных групп получали эквивалентное количество воды. В качестве препарата сравнения использовали полифенольный комплекс манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., содержащий сумму флавоноидов и обладающий антирксидантным и мембраностабилизирующим действием (препарат сравнения), в дозе 10 мг/кг [17]. Полифенольный комплекс манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. получали в соответствии с методикой (патент №2128516, МКИ A61K 35/78) экстракцией надземной части растения этиловым спиртом, после упаривания этилового спирта проводили очистку водного остатка хлороформом, а очищенный водный остаток экстрагировали этилацетатом и полученный экстракт упаривали.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически., О достоверности различий судили методом проверки вероятности нулевой гипотезы с использованием t-критерия Стьюдента и критерия Вилкоксона. Различия считали достоверными при р≤0,05.

Пример 3. Определение показателя антиоксидантной активности в реакции с ДФПГ [18] в гомогенате головного мозга у мышей после гипоксического воздействия. Стабильный свободный радикал ДФПГ восстанавливается в ходе взаимодействия с веществами с антиоксидантными свойствами, что отражается в уменьшении экстинкции раствора ДФПГ при длине волны 517±2 нм.

Для получения хлороформного экстракта в пробирку к 0,5 мл гомогената приливали 10.0 мл хлороформа, плотно закрывали и интенсивно встряхивали в течение 10 мин. Полученную пробу центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Верхний тонкий водный слой и пленку белков удаляли. Нижнюю хлороформную фазу использовали для определения показателя антиоксидантной активности.

Содержание липидов в экстракте определяли гравиметрически. Для этого в предварительно маркированный и взвешенный на аналитических весах флакон вносили 3,0 мл хлороформного экстракта липидов и выпаривали досуха при температуре, 70°С на водяной бане. После чего флакон повторно взвешивали и по разнице масс определяли содержание липидов в экстракте.

Проба «контроль»: в пробирке смешивали 3,0 мл хлороформа и 1,0 мл раствора ДФПГ (Sigma-Aldrich. США), спустя 5 мин измеряли экстинкцию смеси при длине волны 517±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно хлороформа (Е_{КОНТРОЛЬ}). Затем в кювету добавляли 25 мкл раствора гидрохинона, быстро перемешивали стеклянной палочкой, спустя 30 мин проводили измерение (Е_ГХ).

Проба «опыт»: в кювету (толщина 10 мм) вносили 3,0 мл хлороформного экстракта липидов и 1,0 мл раствора ДФПГ, тотчас перемешивали стеклянной палочкой и через 30 мин измеряли экстинкцию при длине волны 517 нм относительно хлороформа (Е_ОПЫТ).

Для расчета принимали во внимание, что 0,1 мкэквивалент гидрохинона вызывает уменьшение экстинкции раствора ДФПГ на 0,22 ед., а 1 мкмоль гидрохинона соответствует 2 мкэквивалентам. Показатель антиоксидантной активности (АА) рассчитывали по формуле:

где АА - антиоксидантная активность, нэкв/г мозга на мг общих липидов; М_МОЗГА - масса мозга, г; МОЛ - масса общих липидов в г мозга, мг; 1231,2 - коэффициент, учитывающий разведение проб и переход от единиц экстинкции к эквивалентам восстановителя.

Перенесенное гипоксическое воздействие запускает процесс индукции ПОЛ, способствуя увеличению доступности фосфолипидов мембран к действию окислителя и проницаемости мембран для ионов, при этом фиксируется увеличение показателя антиоксидантной активности в тканях головного мозга животных в 1,6 раза в сравнении с интактным контролем (таблица).

Курсовое введение настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. оказывает защитное воздействие на мозг животных, перенесших гипоксическую травму, нормализуя дисбаланс взаимоотношений систем свободнорадикального окисления и общей антиоксидантной активности организма (таблица). Применение настоя снижает значение показателя антиоксидантной активности в реакции с ДФПГ по J. Glavind в мозге животных после воздействия в 1,4-1,5 раза по сравнению с животными группы гипоксического контроля. Использование настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. способствует восстановлению показателя антиоксидантной активности преимущественно за счет их антирадикального действия. При введении настоя (1:10) манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. отмечается более выраженное снижение указанного показателя в сравнении с группой гипоксического контроля. В Данных группах уменьшение исследуемого показателя происходит до уровня интактного контроля. Однако в сравнении с ними препарат сравнения оказывает меньшее восстанавливающее влияние на исследуемый показатель мозга животных, перенесших гипоксическую травму.

Примечание: * р≤0,05 по сравнению с гипоксическим контролем. ¹ - выражение через восстановительную активность гидрохинона.

Пример 4: Определение содержания ТБК-РП в гомогенате головного мозга мышей [19]. Об активности запущенных под воздействием гипоксии мозга деструктивных структурно-функциональных процессов судили по накоплению ТБК-РП, образующихся на конечных этапах процесса, которые взаимодействует с 2-тиобарбитуровой кислотой (2-ТБК) в кислой среде при высокой температуре, образующийся при этом тримегиновый комплекс, состоящий из двух молекул 2-ТБК и одной молекулы малонового диальдегида, окрашен в розовый цвет и имеет максимум поглощения при длине волны 532±2 нм.

К 2,5 мл гомогената мозга приливали 1 мл охлажденного 17% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), перемешивали и осадок коагулированных белков отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. В пробирке к 2 мл прозрачной надосадочной жидкости добавляли 1 мл 0,8% раствора ТБК и помещали в кипящую водяную баню на 15 мин. Пробу охлаждали и проводили измерения в кюветах с толщиной слоя 5 мм при длине волны 532±2 нм относительно контроля (2 мл исследуемого материала заменяли таким же объемом буфера). Содержание: ТБК-РП рассчитывали по формуле:

где ТБК-РП - содержание ТБК-реактивных продуктов, пкмоль/г мозга на мг общих липидов; Ммозга - масса мозга, г; МОЛ - масса общих липидов в г мозга, мг: 242,3 - коэффициент, учитывающий разведение проб и молярный коэффициент экетинкции триметинового комплекса.

Для расчета содержания ТБК-РП в биоматериале использовали молярный коэффициент экетинкции для триметинового комплекса (ε), равный 1,56×10⁵ моль^-1 × см^-1 × л, в значение которого учтена толщина слоя кюветы (5 мм).

У животных, перенесших гипоксическую травму, отмечали увеличение содержания ТБК-РП в головном мозге в 1,7 в сравнении с интактными животными, что свидетельствует о большей выраженности процессов ПОЛ, усилении дестабилизации клеток в условиях гипоксического воздействия (таблица).

Курсовое введение настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. снижает содержание ТБК-РП у животных, перенесших гипоксическую травму, приближаясь по значению показателя к таковому интактного контроля (таблица). При этом препарат сравнения уступает предлагаемому настою манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. по уровню снижения количества ТБК-РП в тканях головного мозга после гипоксической травмы.

Таким образом, при исследовании настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. на способность прямо или косвенно влиять на биомембраны, опосредованное ингибированием в них свободно-радикальных процессов ПОЛ, являющихся преобладающим механизмом повреждения мембран при гипоксии оценивали процессы индукции ПОЛ (количество свободных радикалов в реакции со стабильным свободным хромоген-радикалом ДФПГ, содержание ТБК-РП в гомогенате головного мозга) в условиях методики гипоксии гермообъема. После гипоксического воздействия установлено его выраженное мембраностабилизирующее действие, превосходящее эффективность препарата сравнения (полифенольный комплекс манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., содержащий сумму флавоноидов) по уровню снижения показателя антиоксидантной активности в реакции с ДФПГ по J. Glavind и количества ТБК-РП в тканях головного мозга после гипоксической травмы, которые характеризуют влияние на структурно-функциональные нарушения в клетках головного мозга после перенесенной гипоксии. Эллаготанины, являясь высокомолекулярными фенольными соединениями, способны проникать через клеточные мембраны и взаимодействовать с] мембранными компонентами, модифицируя структуру и функции мембран, а полисахариды придают им большую биодоступность в живом организме.

Таким образом, настой манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., полученный обработкой измельченной до 1-3 мм надземной части манжетки водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:20 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 45 мин, процеживанием и отжиманием сырья, доведением объема полученного настоя до 200 мл. при этом настой в качестве активных веществ содержит 7,7% эллаготанинов и 7,1% полисахаридов, проявляет выраженное мембраностабилизирующее действие при гипоксии мозга.

На основании проведенных экспериментальных исследований можно сделать вывод о том. что применение настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., полученного обработкой измельченной до 1-3 мм надземной части манжетки водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:20 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 45 мин, процеживанием и отжиманием сырья, доведением объема полученного настоя до 200 мл, при этом настой в качестве активных веществ содержит 7,7% эллаготанинов и 7,1% полисахаридов, является перспективным для получения более высокого лечебного эффекта.

Технический результат достигнут благодаря использованию настоя манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., полученного обработкой измельченной до 1-3 мм надземной части манжетки водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:20 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 45 мин, процеживанием и отжиманием сырья, доведением объема, полученного настоя до 200 мл, при этом настой в качестве активных веществ содержит 7,7% эллаготанинов и 7,1% полисахаридов, в качестве мембраностабилизирующего фитосредства при гипоксии мозга, что позволило расширить арсенал средств растительного происхождения, обладающих мембраностабилизирующим действием при гипоксии мозга, с повышенной терапевтической эффективностью.

Литература

1. Но С., Slater S.J., Stubbs C.D. Hydration and order in lipid bilayers // Biochem. 1995. - Vol. 34, Iss. 18. - Pp. 6188-6195.

2. Killian J.A., van Meer G. The «double life» of membrane lipids // EMBO Reports, - 2001. - Vol. 2, Iss. 2. - Pp. 91-95.

3. Simons K., Toomre D. Lipid rafts and signal transduction // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. - 2000. - Vol. 1, Iss. 1. - Pp. 31-39.

4. Воронина Т.А., Молодавкин Г.М., Островская P.У. и др. Ноотропные и анксиолитические свойства разных доз пирацетама // Экспер. и клин, фармакол. - 2000. - Т. 63. №2. - С. 9-11.

5. Машковский М.Д. Лекарственные средства - М.: Новая Волна, 2005. - С. 113-115.

6. Малин Д.И. Побочное действие психотропных средств. - М.: Вузовская книга, 2000. - С. 184-189.

7. Крылов Г.В, Казакова Н.Ф., Степанов Э.В. Зеленая аптека. - Кемерово: Современ. отеч. кн., 1993. - С. 148.

8. Зыков А.А., Головнев В.А., Белкина О.М. Изменение жирнокислотного состава крови и лимфы на фоне действия биофлавоноидами манжетки обыкновенной при инфаркте миокарда // Бюл. СО АМН СССР. - 2001. - Т. 21, №4. - С. 63-65.

9. Зорина Е.В. Фармакогностическое изучение видов рода Alchemilla Пермского края: автореф. дис.… канд. фарм. наук. - Пермь, 2009 - С. 17-20.

10. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов A.M. Оценка влияния препаратов, растительного происхождения на процесс рецидивирования злокачественных опухолей // Изыскание и создание природных лекарственных средств: Межвуз. сборн. научн. трудов с междунар. участием, посвящ. 25-лет. каф. фармакогнозии и ботаники Яросл. гос. мед. академии / под ред. проф. Н.С. Фурсы. - Ярославль: ООО «ЯрМедиаГруп». 2009. - С. 210-213.

11. Плотников М.Б., Колтунов А.А., Алиев О.И. и др. Гемореологические свойства экстрактов из некоторых растений, содержащих флавоноиды // Раст. ресурсы. - 1998. - Т. 34, вып. 1. - С. 87-90.

12. Химический анализ лекарственных растений / под ред. Н.И. Гринкевич. Л.Н. Сафронич. - М.: Высшая школа, 1983. - С. 120-121.

13. Шилова И.В., Суслов Н.И., Самылина И.А. Химический состав и ноотропная активность растений Сибири. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 2010. - С. 60.

14. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье // МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1990. - С. 307-308.

15. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / под ред. А.Н. Миронова. - Ч. первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 285.

16. Пат. РФ на изобретение №2568843 «Средство, обладающее ноотропным действием» от 20 ноября 2015 г. / Суслов Н.И., Шилова И.В., Самылина И.А., Баева В.М. - №2014148401; заявл. 01.12.2014; опубл. 20.11.2015.

17. Бородин Ю.И., Головнев В.А., Гончаров А.Б. и др. Сравнительная характеристика клеточного состава регионарных лимфатических узлов сердца при повторном экспериментальном метаболическом инфаркте миокарда в условиях его коррекции биофлавоноидами манжетки обыкновенной // Бюл. СО РАМН. - 2003. - Т. 23, №2. - С. 73-80.

18. Glavind J. Antioxidants in animal tissues // Acta Chem. Scand. - 1963. - Vol. 17. №6. - P. 1635-1640.

19. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1978. - С. 66-68.