Результат интеллектуальной деятельности: Питательная среда для культивирования Pseudomonas fluorescens AP-33

Область техники: Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, а также к сельскому хозяйству и может быть использовано для получения высоко эффективных препаратов - средств защиты растений.

Известна питательная среда LB (являющаяся одной из основных для культивирования бактерий рода Pseudomonas) [1] состоящая, г/л:

Пептон - 10.0

Дрожжевой экстракт - 5.0

Натрий хлористый - 10.0

Вода водопроводная до 1 л.

Недостатком питательной среды является высокая стоимость, связанная с наличием в ее составе такого дорогостоящего ингредиента, каким является пептон.

Известна питательная среда Кинг В [2], принятая за прототип, также применяемая для культивирования бактерий рода Pseudomonas. В нее входят пептон, глицерин, различные минеральные соли, г/л:

Пептон - 20.0

Глицерин - 10.0

K₂НРO₄ - 1.5

MgSO₄⋅7H₂O - 1,5

Вода дистиллированная до 1 л.

Ее недостатком также является высокая стоимость, связанная с наличием в ее составе такого дорогостоящего ингредиента, каким является пептон. В процессе культивирования штамма Pseudomonas fluorescens АР-33 на среде Кинг В количество микроорганизмов составило 2×10⁹ КОЕ/ мл.

Целью настоящего исследования является создание недорогой универсальной питательной среды для культивирования Pseudomonas fluorescens АР-33 с целью увеличения количества Pseudomonas fluorescens АР-33 выше 2×10⁹ КОЕ/ мл, увеличения срока хранения на жидкой питательной среде и увеличение срока хранения на твердой питательной среде.

Поставленная цель решается тем, что в среду для культивирования в качестве дополнительно вносят горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием, янтарную кислоту [3], лапрол для жидкой питательной среды или агар для твердой питательной среды.

Сущность технического решения поясняется следующим.

Технология приготовления питательной среды. Для использования гороха шлифованного требуется его предварительная обработка. Горох шлифованный, в количестве 250 г/л промыть водопроводной водой, помесить во флакон емкостью 1 литр, и довести до литра дистиллированной водой. Закрыть флакон пробкой герметично. Затем автоклавировать в течение 1 часа при 2 Bar. После автоклавирования остудить до комнатной температуры и дважды процедить через два слоя марли. Полученный после обработки горох соединить с остальными компонентами среды и довести до 1 л дистиллированной водой. Значение рН должно соответствовать 7,5-7,6 ед. рН. Затем стерилизовать в автоклаве 40 минут 1,2-1,4 Bar. Полученная среда имеет светло-желтый цвет, «чистый» запах и незначительный осадок. Культивирование микроорганизмов производиться 20-24 часа, температура - 28±2°С, принудительная аэрация со скоростью вращения 250 об/мин. Для сохранения посевного материала на твердой питательной среда инкубирование производиться 24-48 ч, температура - 28±2°С в термостате. Затем хранение посевного материала Pseudomonas fluorescens АР-33 в течение 6 месяцев при температуре 4-8°С.

Контроль за численностью микроорганизмов осуществляют стандартным методом десятикратных разведений.

Культивирование Pseudomonas fluorescens АР-33 в жидкой среде.

Пример 1.

Предлагаемая жидкая питательная среда для культивирования Pseudomonas fluorescens АР-33 содержащая в качестве питательной основы мелассу, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный, сульфат магния семиводный, горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием, янтарную кислоту и лапрол в следующем соотношении компонентов, г/л (табл. 1).

Предлагаемая жидкая питательная среда для культивирования бактерий позволяет получить количество микроорганизмов Pseudomonas fluorescens АР-33 1.0×10¹¹ KOE/см³, которая сохраняется в течение 45 дней, при хранении в жидкой среде.

Пример 2.

Предлагаемая жидкая питательная среда для культивирования бактерий позволяет получить количество 1.6×10⁸ KOE/см³, которая сохраняется в течение 15 дней.

Пример 3.

Предлагаемая жидкая питательная среда для культивирования бактерий позволяет получить количество микроорганизмов Pseudomonas fluorescens АР-33 - 8×10⁹ KOE/см³, которая сохраняется в течение 45 дней.

Однако, среда становиться менее прозрачной, процесс мойки биореактора занимает длительное время, т.к. необходимо очистить барботер и шланги от осадка. Таким образом, в результате сравнения эффективности использования сред с рецептурами из примеров 1, 2 и 3 выявлено, что самая высокое количество микроорганизмом Pseudomonas fluorescens АР-33, длительный срок хранения на жидкой среде и хорошее качество среды достигается при использовании рецептуры жидкой среды из примера 1 (табл. 4).

Культивирование Pseudomonas fluorescens АР-33 на твердой среде

Посев микроорганизмов на твердую среду осуществляется методом простого штриха или по методу Дригальского.

Пример 4.

Предлагаемая твердая питательная среда для культивирования бактерий позволяет сохранять Pseudomonas fluorescens АР-33 на питательном агаре в течение 6 месяцев при температуре 4-8°С без пересева.

Пример 5.

Предлагаемая питательная среда для культивирования бактерий позволяет сохранять Pseudomonas fluorescens АР-33 на питательном агаре в течение 4 месяцев при температуре 4-8°С без пересева.

Пример 6.

Предлагаемая твердая питательная среда для культивирования бактерий позволяет сохранять Pseudomonas fluorescens АР-33 на питательном агаре в течение 6 месяцев при температуре 4-8°С без пересева. Однако, среда не прозрачная, что создает сложности для просмотра колоний. Таким образом, в результате сравнений эффективности использования сред, с рецептурами из примеров 4, 5 и 6 выявлено, что самое длительное время микроорганизмы Pseudomonas fluorescens АР-33, сохраняются на среде из примера 4, которая характеризуется хорошим качеством (табл. 8).

Следовательно, использование предлагаемой универсальной питательной среды для культивирования бактерий Pseudomonas fluorescens АР-33 позволяет:

- повысить количество Pseudomonas fluorescens АР-33 в процессе культивирования на жидкой среде до 1.0×10¹¹ (культивировании на среде Кинга дает количество 2×10⁹ KOE/ мл);

- сохранить количество Pseudomonas fluorescens АР-33 в жидкой среде течение 45 дней;

- сохранить количество Pseudomonas fluorescens АР-33 на твердой среде в течение 6 месяцев при температуре 4-8°С;

- компоненты среды доступные и недорогие.

Литература

1. Дашкевич В.С, Дашкевич Н.Ю., Ашмарина Л.Ф., Шушаро А.И. Способ борьбы с возбудителями заболеваний растений // Патент РФ №2130265, заявлено 29.12.97; опубл. 20.05.99. Бюл.14.

2. King Е.О., Ward М.К., Raney D.Е. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin // J. Lab and Clin. Med. - 1954. - Vol. 44 (2). - P. 301-307.

3. Котляров В.В., Сединина Н.В. Использование янтарной кислоты в биотехнологическом процессе получения препаратов Pseudomonas fluorescens // Научный журнал КубГАУ. - 2014. - №101 (07). - С. 2327-2336.