Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis

Область техники

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается питательной среды для культивирования бактерии Bacillus subtilis.

Составы питательных сред для культивирования Bacillus subtilis хорошо изучены на лабораторном и промышленном уровнях.

Известна питательная среда для стационарного культивирования Bacillus subtilis - мясопептонный бульон (МПБ). Мясопептонный бульон готовится из мясной воды, к которой добавляют 1% пептона и 0,5% натрия хлористого. Мясную воду получают путем проварки в 2-4-кратном объеме водопроводной воды мяса или фарша крупного рогатого скота или лошадей в течение 1 ч с последующей фильтрацией [1].

Недостатком данной среды является дороговизна используемых компонентов и сложная технология приготовления. Применение данной среды для промышленного производства трудновыполнимо.

В качестве прототипа для культивирования Bacillus subtilis к заявляемой питательной среде является L-бульон. Он готовится следующим образом: состав (г/л): дрожжевой экстракт - 5, пептон ферментативный - 15, хлорид натрия - 5, дистиллированная вода - до 1 л (рН 6,8-7,0). Стерилизацию проводили при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут.[2].

Недостатком данной среды является то, при культивировании Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 максимальное количество организмов не выше 5×10⁹ КОЕ/мл.

Цель работы, состоит в создании питательной среды, содержащей доступное и дешевое сырье и обеспечивающей количество Bacillus subtilis выше 5×10⁹ КОЕ/мл.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в повышении количества Bacillus subtilis выше 5×10⁹ КОЕ/мл.

Описание изобретения

Для достижения указанного технического результата для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079, Bacillus subtilis В-2896, Bacillus subtilis В-2895 Bacillus subtilis B-4828 Bacillus subtilis В-1323 Bacillus subtilis B-5449 предложено использовать питательную среду, состоящую из (г/л): дрожжевой экстракт - 5, пептон ферментативный - 15, хлорид натрия - 5, 40% спиртовой экстракт кровохлебки лекарственной - 20 мл/л и дистиллированная вода, доведенная до объема 1 л. (рН 6,8-7,0). Стерилизацию среды проводили после внесения экстракта при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут.

Приготовление экстракта включает в себя экстрагирование растительного сырья. Растительное сырье должно быть высокого качества (сбор кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) осуществлялся в июне 2017 в Алтайском крае).

В данной работе использовали аппарат Сокслета. На 1 г воздушно-сухого вещества использовали 15 мл растворителя. В качестве растворителей выбрали 96%-ый и 40%-ый растворы этанола. В патрон из белой фильтровальной бумаги добавляли по 10 г воздушно-сухого растительного сырья, после чего закрывали с обеих сторон и помещали в экстрактор Сокслета. В колбу добавляли 150 мл 96%-ного растворителя и начинали экстрагирование на водяной бане. Для 40%-ного раствора этанола экстрагирование проводили на воздушной бане. Продолжительность экстрагирования - 3 часа, количество циклов -10. На выходе получали спиртовой или водно-спиртовой экстракт растительного сырья. Опыт поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Для приготовления жидкой питательной среды в колбу Эрленмейера (объем 50 мл) добавляли компоненты среды, при соотношении г/л: дрожжевой экстракт - 5, пептон - 15, хлорид натрия - 5, определенные объемы 96%-ного спиртового экстракта кровохлебки лекарственной, дистиллированная вода -до 1 л. (рН 6,8-7,0). Закрывали ватно-марлевой пробкой и стерилизовали при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут. Затем, в остывшую жидкую питательную среду (объем 50 мл) в стерильных условиях вносили навеску 0,5 г лиофилизированно высушенных спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079.

Культивирование производили в шейкер-инкубаторе "Innova 44" (New Brunswick, США) при вращении со скоростью 250 об/мин (эксцентриситет 5 см), при температуре 37°С в течение 24 часов.

Для определения количества микроорганизмов использовали стандартный метод десятикратных разведений с пересевом на питательный агар, приготовленный при следующем соотношении компонентов (г/л): дрожжевой экстракт - 5, пептон - 15, хлорид натрия - 5, агар-агар - 18, дистиллированная вода - до 1 л. (рН 6,8-7,0). Стерилизацию проводили при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут. После чего термостатировали при температуре 37°С в течение 24 часов. В качестве контрольной пробы использовали среду, без внесения экстракта кровохлебки лекарственной. Эксперименты проведены семь раз.

Из приведенных статистических данных видно (табл. 1), что максимальное увеличение количества бактерий достигается при добавлении 20 мл 96%-ного спиртового экстракта кровохлебки в L-бульон.

Пример 2

Для приготовления жидкой питательной среды в колбу Эрленмейера (объем 50 мл) добавляли компоненты среды, при соотношении г/л: дрожжевой экстракт - 5, пептон - 15, хлорид натрия - 5, определенные объемы 40%-ного спиртового экстракта кровохлебки лекарственной, дистиллированная вода -до 1 л. (рН 6,8-7,0). Закрывали ватно-марлевой пробкой и стерилизовали при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут. Затем, в остывшую жидкую питательную среду (объем 50 мл) в стерильных условиях вносили навеску 0,5 г лиофилизированно высушенных спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079.

Культивирование производили в шейкер-инкубаторе "Innova 44" (New Brunswick, США) при вращении со скоростью 250 оборотов в минуту (эксцентриситет 5 см), температуре 37°С в течение 24 часов.

Для определения количества микроорганизмов использовали стандартный метод десятикратных разведений с пересевом на питательный агар, приготовленный при следующем соотношении компонентов (г/л): дрожжевой экстракт - 5, пептон - 15, хлорид натрия - 5, агар-агар - 18, дистиллированная вода - до 1 л. (рН 6,8-7,0). Стерилизацию проводили при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут. Затем термостатировали при температуре 37°С в течение 24 часов. В качестве контрольной пробы использовали среду, без внесения экстракта кровохлебки лекарственной. Эксперименты проведены в семикратной повторности.

Из приведенных статистических данных (табл. 2) видно, что максимальное увеличение количество бактерий достигается при добавлении 20 мл 40%-ного спиртового экстракта кровохлебки лекарственной в L-бульон. При сравнении статистиках данных стимулирующей активности экстрактов кровохлебки лекарственной выявлено, что добавление 20 мл 40%-ного спиртового экстракта кровохлебки эффективней в два раза (1210±30 КОЕ × 10¹⁰/мл и 2600±130 КОЕ × 10¹⁰/мл соответственно).

Пример 3

Из приведенных данных видно (табл. 3), что стимулирование роста количества различных штаммов бактерии Bacillus subtilis при внесении 20 мл/л в питательную среду 40%-ного спиртового экстракта кровохлебки от 2 до 8 раз.

Таким образом, предлагаемая питательная среда для культивирования различных штаммов бактерии Bacillus subtilis содержит не дорогое и доступное сырье, а его использование позволяет повысить количество микроорганизмов от 2 до 8 раз, относительно контроля.

Литература.

1. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований. / Под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. - М: Медицина, 2005. - С. 480.

2. Бойко С.С., Яценко Е.С. Влияние ультразвука на Bacillus subtilis в процессе стационарного культивирования // Технологии и оборудование химической, биотехнологический и пищевой промышленности. Материалы X Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием. - Бийск, 2017. - С. 321-324.