Результат интеллектуальной деятельности: Средство, обладающее апоптоз-ингибирующей активностью

Изобретение относится к области медицины и биологии и представляет собой новое средство, обладающее апоптоз-ингибирующей (антиапоптотической) активностью. Средство может быть использовано для коррекции состояний связанных с повышением уровня апоптоза клеток (окислительный стресс, ишемические повреждения), а также в качестве ингибитора апоптоза в культурах клеток in vitro.

Апоптоз является вариантом программируемой гибели клетки, как правило, вызываемой неблагоприятными внешними факторами или внутренними нарушениями в работе клетки не совместимые с нормальным функционированием. Следствием апоптоза является фрагментация клетки, а также ее ядра и ее элиминация фагоцитами без развития воспалительной реакции.

В некоторых ситуациях активация апоптоза приводит к нежелательным последствиям, в частности повышению гибели клеток при работе с клеточными культурами In vitro. При некоторых патологических состояниях также возрастает уровень апоптоза, например, при окислительном стрессе (повышении уровня свободно-радикального окисления), вызванного химическими, физическими, воспалительными или ишемическими факторами.

В настоящее время, известно средство, способствующее экспрессии белка bcl-2, средство, ингибирующее апоптоз, и средство, предотвращающее повреждение ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом [1]. Данное средство содержит растворимый в воде и этаноле экстракт солодки в качестве активного ингредиента. Однако, использование растительного компонента значительно усложняет процедуру получения и стандартизации активного вещества.

Известны композиции, ингибирующие апоптоз, способы очистки композиций и их применение [2], где в качестве основного действующего компонента применяют растительный порошок из растений семейств leguminosae, solanum, allium, семян гороха и сои. Недостатком метода является сложный процесс многостадийной обработки и экстракции с использованием различных растворителей и последующей очистки.

Для ингибирования апоптоза в популяции клеток Т-лимфоцитов используется антагонист-лиганд RAR-γ или агонист-лиганд RAR-α [3]. Данное средство предназначено для лечения заболеваний, связанных с избыточной скоростью апоптоза, в том числе, синдрома иммунодефицита, вызванного вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) или отторжения трансплантата. Также известны ингибиторы апоптоза и их применение (2247), на основе антиапоптозных фрагментов белка DAXX, которые получают из 17-24 последовательных аминокислот белка DAXX, включающих KKSRKEKKQTGSGPLG, а также их пептидомиметики и конъюгаты с проникающим в клетки пептидом. Однако, данный подход включает сложный процесс получения активного субстрата.

Целью заявленного изобретения является расширение арсенала средств, обладающих апоптоз-ингибирующей активностью.

Поставленная цель достигается применением соли лития и пировиноградной кислоты (пирувата лития) C₃H₃O₃Li в качестве ингибитора апоптоза. Различные соли лития имеют широкое применение в психиатрии в качестве нормотимиков (стабилизаторов настроения) [4]. Ранее было известно применение пирувата лития для профилактики и лечения нейродегенеративной патологии и сосудистой деменции [5], где для лечения и профилактики нейродегенеративных заболеваний и сосудистой деменции предложены средства, содержащие органические соли лития.

Однако соли лития, в частности, пируват лития до настоящего времени не использовался в качестве ингибитора апоптоза. Антиапоптотические свойства пирувата лития впервые обнаружены и доказаны экспериментально. Сочетание психостабилизирующих, нейропротекторных, антиоксидантных свойств пирувата лития с его вновь выявленными антиапоптотическими свойствами перспективно для практического применения, в частности в клеточной биологии и медицине, включая, терапию ишемических повреждений, трансплантологию.

Исследование влияния пирувата лития на процесс апоптоза в культуре мононуклеаров периферической крови было проведено с использованием набора реактивов «Annexin V & Dead Cell Assay Kit» (Merck Millipore, Германия) на проточном цитометре «Muse Cell Analyzer» (Merck Millipore, Германия). Уровень спонтанного апоптоза определяли на интактной культуре после 24 часов инкубации при 37°С, уровень индуцированного апоптоза определяли после 24 часов инкубации при 37°С при добавлении индуктора апоптоза (гидроперекиси трет-бутила в концентрации 50 мкмоль/л).

Метод определения уровня апоптоза в культуре заключается в дифференцировании живых клеток, клеток в состоянии апоптоза и клеток в состоянии некроза (мертвые клетки) по уровню флуоресценции и виду красителя. Клетки, экспрессирующие на внешней стороне мембраны фосфатидил-серин и связанный с ним аннексии V, меченный флуоресцентной меткой, определяются как апоптотические. При этом различают клетки в ранней стадии апоптоза (early apoptosis, аннексии V-положительные) и в поздней (late apoptosis, аннексии V-положительные/пропидий иодид положительные). Клетки, содержащие только интерколирующий флуоресцентный краситель пропидий иодид, определяются как мертвые (некротические).

На фиг. 1 представлены: (а) интактная культура, (б) культура в присутствии гидроперекиси трет-бутила, (в) культура в присутствии пирувата лития, (г) культура в присутствии пируваат лития и гидроперекиси трет-бутила

Пример 1

Для оценки уровня антиапоптотической активности готовили рабочий раствор для чего 100 мг пирувата лития растворяли в 10 мл дистиллированной воды. Полученный раствор исследовали in vitro на клеточной суспензии мононуклеаров периферической крови человека. Клеточную суспензию мононуклеаров выделяют из периферической крови здоровых доноров центрифугированием на градиенте фиколла. Далее отмывают и ресуспендируют в среде RPMI 1640 и вносят в соответствующие лунки планшета. Для оценки уровня спонтанного апоптоза добавляют раствор пирувата лития в суспензию мононуклеаров с расчетом на конечную концентрацию в лунке 1,2 ммоль/л. Для оценки уровня индуцированного апоптоза добавляют в лунки с пируватом лития раствор гидроперекиси трет-бутила с расчетом на конечную концентрацию в лунке 50 мкмоль/л. В качестве отрицательного контроля используют интактную суспензию клеток, в качестве положительного контроля суспензию клеток с добавлением гидроперекиси трет-бутила с расчетом на конечную концентрацию в лунке 50 мкмоль/л. Клетки инкубируют в течение 24 часов при 37°С в среде 5% углекислого газа. Уровень апоптоза в культуре рассчитывался как количество клеток в раннем апоптозе (early apoptosis) и в позднем (late apoptosis) в процентах к общему количеству клеток.

Результаты определения уровня апоптоза представлены в таблице 1 в процентах апоптотических клеток после 24 часов инкубации мононуклеаров при воздействии пируватом лития и без него.

*р<0,001 по сравнению с интакной культурой

**р=0,007 по сравнению с культурой в присутствии гидроперекиси трет-бутила

Как видно из таблицы 1 и фиг. 1, при добавлении пирувата лития достигалось выраженное ингибирование индуцированного апоптоза и сохранение основного пула живых клеток: процент индуцированного апоптоза мононуклеаров периферической крови при инкубации с пируватом лития был статистически значимо ниже по сравнению с культурой, инкубированной с гидроперекисью трет-бутила (t=2,944, df=24, р=0,007).

Список литературы

1. Пат. 2448723 Российская Федерация, МПК А61К, А61Р. Средство, способствующее экспрессии белка BCL-2, средство, ингибирующее апоптоз, и средство, предотвращающее повреждение ДНК эпидермальных клеток ультрафиолетом / Такита Macao (JP); заявитель и патентообладатель НИСИХАРА КО, ЛТД (JP). - №2010152636; заявл. 23.05.2008; опубл. 27.04.2012, Бюл. №12 - 6 с.

2. Заявка №96115127 (RU).

3. Пат. 2191008 Российская Федерация, МПК А61К, А61Р. Антагонист-лиганд RAR-γ или агонист-лиганд RAR-α в качестве ингибитора апоптоза / ФЕШУШ Ласло (HU), СОНДИ Жужа (HU), РАЙХЕРТ Уве (FR); заявитель и патентообладатель САНТР ЭНТЕРНАСЬОНАЛЬ ДЕ РЕШЕРШ ДЕРМАТОЛОДЖИК ГАЛДЕРМА (С.И.Р.Д. ГАЛДЕРМА) (FR). - №98108534; заявл. 08.10.1996; опубл. 20.10.202, Бюл. №29.

4. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в двух частях. Ч1. - 12 изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1986. - С. 127-129).

5. Пат. 2587617 Российская Федерация, МПК А61К, А61Р. Способ профилактики и лечения нейродегенеративной патологии и сосудистой деменции / Громова О.А., Торшин И.Ю.; заявитель и патентообладатель Громова Ольга Алексеевна (RU), Трошин Иван Юрьевич (RU). - №2014152190; заявл. 23.12.2014; опубл. 20.06.2016, Бюл. №17-5 с.