СПОСОБ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ ЗОНЫ

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии и гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики заболеваний гастродуоденальной зоны.

Известен способ диагностики заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки путем проведения эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС) с биопсией [1].

Известный способ позволяет определить локализацию и размер эрозивно-язвенных дефектов, выраженность воспалительного процесса в слизистой оболочке желудка и двенадцатиперстной кишки. Но в применении ЭГДС существуют медицинские ограничения: проведение данной процедуры затруднено у пациентов с хроническими заболеваниями дыхательной, сердечно-сосудистой систем, у пожилых пациентов и у детей, а так как способ инвазивный – существует риск вирусного и бактериального инфицирования, механического повреждения слизистой оболочки.

Известен способ прогнозирования течения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter (H.) pylori, в котором по титру антител класса IgG и IgA к H. pylori прогнозируют течение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки с обострениями [2].

Однако в отличие от заявляемого изобретения известный способ не включает определение маркеров состояния мукозального иммунитета и желудочной секреции.

Известен способ прогнозирования течения язвенной болезни желудка по определению в сыворотке крови концентрации секреторного иммуноглобулина А (sIgA), пепсиногена-2 (PG-2) и ракового антигена 72-4 [3].

В отличие от заявляемого изобретения известный способ прогнозирования не учитывает секреторную активность желудочных желез по уровню пепсиногена-1 (PG-1), инфицированность H. pylori, а также локализацию патологического процесса в двенадцатиперстной кишке.

Известен способ иммунодиагностики рака желудка, в котором по количеству PG-1, васкуло-эндотелиального фактора роста и карциноэмбрионального антигена устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия [4].

Ограничением в применении является невозможность дифференциации предраковых заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ применения тестовой панели для оценки состояния и функциональной активности слизистой оболочки желудка – «Гастропанель», с помощью которой в плазме крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) определяют количество PG-1, PG-2, гастрина-17, антител (IgG) к H. pylori [5–7].

Недостатком известного решения является необходимость дорогостоящих импортных реактивов (Biochit, Финляндия), что затрудняет его использование во многих лечебных учреждениях. Кроме того, «Гастропанель» в отличие от заявляемого способа не включает определение маркеров состояния мукозального иммунитета и не позволяет выявить инфицированность высокопатогенными штаммами H. pylori, имеющими цитотоксические антигены (CagA).

Технический результат заключается в возможности определения локализации и выраженности заболеваний гастродуоденальной зоны, выявления инфицированности высокопатогенными штаммами H. pylori, а также дифференциации предраковых заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки с помощью иммунологического исследования факторов крови, которое является малоинвазивным и не требует больших материальных затрат.

Сущность изобретения заключается в том, что способ иммунодиагностики заболеваний гастродуоденальной зоны включает определение клинических показателей и иммунологическое исследование факторов крови. Определяют в сыворотке крови концентрации PG-1, PG-2, sIgA, титр суммарных антител (IgG+IgM+IgA=CAT) к CagA H. pylori. По совокупности полученных результатов определяют локализацию и выраженность заболеваний гастродуоденальной зоны. При клинических признаках, сывороточных концентрациях PG-1 90,0 мкг/л и более, PG-2 17,0 мкг/л и более, sIgA 4,0 мг/л и более, положительном титре CAT к CagA H. pylori устанавливают наличие эрозивно-язвенных дефектов в желудке. При клинических признаках, сывороточных концентрациях PG-1 64,0 мкг/л и более, PG-2 4,0 мкг/л и более, sIgA 3,9 мг/л и более, положительном титре более, PG-2 17,0 мкг/л и более, sIgA 4,0 мг/л и более, положительном титре CAT к CagA H. pylori устанавливают наличие эрозивно-язвенных дефектов в желудке и двенадцатиперстной кишке. При клинических признаках, сывороточных концентрациях PG-1 в пределах нормы, PG-2 9,0 мкг/л и более, sIgA 3,1 мг/л и более, положительном титре более, PG-2 17,0 мкг/л и более, sIgA 4,0 мг/л и более, положительном титре CAT к CagA H. pylori устанавливают наличие эрозивно-язвенных дефектов в двенадцатиперстной кишке.

В табл. 1 показаны изменения сывороточных показателей у обследованных лиц.

Способ осуществляют следующим образом. При наличии клинических признаков заболеваний гастродуоденальной зоны у больного осуществляют забор крови для исследования в утренние часы натощак из локтевой вены в объеме 5 мл в сухую стерильную пробирку. Отделяют сыворотку с помощью центрифугирования при скорости 1500 об/мин в течение 10–15 мин. Определение сывороточных концентраций PG-1, PG-2, sIgA, титра CAТ к CagA H. pylori проводят твердофазным методом ИФА с использованием соответствующих моноклональных антител (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск).

Для определения концентрации PG-1 и PG-2 в лунки планшета последовательно вносят по 10 мкл калибровочных образцов, контрольного образца, исследуемых образцов сыворотки крови. Во все лунки вносят по 200 мкл конъюгата, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37 °С в течение 60 мин при интенсивности перемешивания 650 об/мин. После инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37 °С в течение 15 мин при интенсивности перемешивания 650 об/мин. Вносят во все лунки по 100 мкл стоп-реагента, перемешивают 10–15 сек на шейкере с интенсивностью 650 об/мин, содержимое лунок окрашивается. Через 2–3 мин после остановки реакции измеряют оптическую плотность в лунках с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм. Сывороточную концентрацию PG-1, PG-2 определяют при построении калибровочного графика на прилагаемом трафарете. Достоверность результатов анализа оценивают по концентрации показателя в контрольном образце.

При определении концентрации sIgA в лунки планшета для калибровочных и контрольного образцов вносят по 80 мкл раствора для разведения сывороток (РРС), в лунки для исследуемых образцов – по 90 мкл РРС. Затем добавляют по 20 мкл калибровочных и контрольного образцов, по 10 мкл разведенных исследуемых образцов, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 30 мин. После 1-й инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором. Во все лунки вносят по 100 мкл конъюгата, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 30 мин. После 2-й инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в темном месте при температуре 18–25 °С в течение 25 мин. Вносят во все лунки по 100 мкл стоп-реагента, содержимое лунок окрашивается. Через 2–3 мин после остановки реакции измеряют оптическую плотность в лунках с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм. Сывороточную концентрацию sIgA определяют при построении калибровочного графика на прилагаемом трафарете. Достоверность результатов анализа оценивают по концентрации показателя в контрольном образце.

Перед определением титра САТ к CagA H. pylori в лунки планшета вносят по 400 мкл промывочного раствора на 5 мин, после чего раствор удаляют и в лунки планшета вносят по 80 мкл раствора для разведения сывороток. Затем в 2 лунки добавляют по 20 мкл отрицательного контрольного образца, в 1 лунку – 20 мкл положительного контрольного образца, в остальные лунки – по 20 мкл исследуемых образцов, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 30 мин. После 1-й инкубации каждую лунку планшета промывают 5 раз промывочным раствором (по 400 мкл). Во все лунки вносят по 100 мкл конъюгата в рабочем разведении, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 30 мин. После 2-й инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в темном месте при температуре 18–25 °С в течение 25 мин. Вносят во все лунки по 100 мкл стоп-реагента, содержимое лунок окрашивается. Через 2–3 мин после остановки реакции измеряют оптическую плотность в лунках с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм. Титр САТ к CagA H. pylori определяют, сравнивая с рассчитанной критической оптической плотностью.

При клинических признаках, значениях сывороточных концентраций PG-1 90,0 мкг/л и более, PG-2 17,0 мкг/л и более, sIgA 4,0 мг/л и более, положительном титре CAT к CagA H. pylori констатируют наличие эрозивно-язвенных дефектов в желудке.

При клинических признаках, значениях сывороточных концентраций PG-1 64,0 мкг/л и более, PG-2 4,0 мкг/л и более, sIgA 3,9 мг/л и более, положительном титре CAT к CagA H. pylori констатируют наличие эрозивно-язвенных дефектов в желудке и двенадцатиперстной кишке.

При клинических признаках, значениях сывороточных концентраций PG-1 в пределах нормы, PG-2 9,0 мкг/л и более, sIgA 3,1 мг/л и более, положительном титре CAT к CagA H. pylori констатируют наличие эрозивно-язвенных дефектов в двенадцатиперстной кишке.

Способ апробирован на 80 больных с эрозивно-язвенными поражениями слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. Мужчин было 23 (28,75 %), женщин – 57 (71,25 %). Обследованные пациенты имели возраст от 29 до 74 лет, наибольшее количество приходилось на возраст от 50 до 59 лет (60 %). Больные в зависимости от локализации морфологических изменений были разделены на 3 группы: 1 группа – локализация эрозивно-язвенных дефектов в желудке (n=30), 2 группа – локализация эрозивно-язвенных дефектов в желудке и двенадцатиперстной кишке (n=30), 3 группа – локализация эрозивно-язвенных дефектов в двенадцатиперстной кишке (n=20).

Диагноз устанавливали на основании клинических данных, результатов ЭГДС и гистологического исследования. ЭГДС проводили в утренние часы, натощак, с взятием биоптатов из зоны поражения слизистой оболочки.

Кровь для исследования брали при первичном обращении до начала лечения при получении информированного согласия обследуемых лиц. В качестве сравнения использовали серологические показатели, полученные в группе здоровых добровольцев (n=10).

Определение сывороточной концентрации PG-1, PG-2, sIgA, титра CAТ к CagA H. pylori у здоровых добровольцев позволило установить интервал нормы (табл. 1).

Анализ полученных в процессе исследования результатов выявил, что наибольшие секреция PG-1 и PG-2, sIgA, частота положительных титров CAТ к CagA H. pylori (в 86,7 % случаев) наблюдаются при локализации эрозивно-язвенных дефектов в желудке, наименьшие – при локализации эрозивно-язвенных дефектов в двенадцатиперстной кишке.

Таким образом, проведенное исследование позволило выявить зависимость количеств PG-1 и PG-2, sIgA, частоты положительных титров CAТ к CagA H. pylori от наличия и локализации эрозивно-язвенных дефектов в слизистой оболочке желудка и/или двенадцатиперстной кишки.

Пример 1. Больной М., 56 лет, медицинская карта амбулаторного больного № 424, обратился к гастроэнтерологу ГБУЗ РМ «Поликлиника № 4» 10.04.2017 г. с жалобами на периодические ноющие боли в эпигастральной области.

Из анамнеза заболевания: больным себя считает в течение нескольких месяцев после стационарного лечения по поводу остеохондроза поясничного отдела позвоночника.

Объективный осмотр: общее состояние удовлетворительное, питание нормальное. Кожные покровы обычной окраски, высыпаний нет. Периферические лимфатические узлы не увеличены. В легких дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются, частота дыхательных движений (ЧДД) составила 17 в мин. Тоны сердца приглушены, ритм правильный, частота сердечных сокращений (ЧСС) составила 78 ударов в мин, артериальное давление (АД) составило 140/80 мм рт. ст. Язык влажный, обложен белым налетом. Живот при пальпации мягкий, умеренно болезненный в эпигастральной области. Печень, селезенка не увеличены. Мочеиспускание не нарушено. Стул регулярный, оформленный.

ЭГДС от 11.04.2017 г.: Язва средней трети тела желудка, по большой кривизне d=0,5 см.

Гистологическое исследование биоптата желудка: обрывки слизистой желудка с воспалительной инфильтрацией в строме, гиперплазией и полиморфизмом отдельных желез.

Хелпил-тест: положительный +++.

Рентгенография желудка от 12.04.2017 г.: в средней трети тела желудка, по большой кривизне, определяется «ниша» треугольной формы 6×5 мм, с воспалительным валом вокруг, с конвергенцией складок. Заключение: Язва средней трети тела желудка.

Иммунологическое исследование: количество PG-1 – 135,0 мкг/л, PG-2 – 26,0 мкг/л, sIgA – 9,6 мг/л, титр CAТ к CagA H. pylori 1:40.

Выставлен заключительный клинический диагноз: Язвенная болезнь желудка с локализацией язвы (d=5 мм) по большой кривизне средней трети тела желудка, фаза обострения. H. pylori (+++).

Характер жалоб, анамнестических, клинико-инструментальных данных, результаты иммунологического исследования указывают на локализацию эрозивно-язвенного дефекта в желудке у больного.

Пример 2. Больная А., 39 лет, медицинская карта амбулаторного больного № 386, обратилась к гастроэнтерологу ГБУЗ РМ «Поликлиника № 4» 21.03.2017 г. с жалобами на чувство тяжести, ноющую боль в эпигастральной и околопупочной областях.

Из анамнеза заболевания: больной себя считает в течение двух недель, когда на фоне нерегулярного питания, приема нестероидных противовоспалительных препаратов по поводу менструальных болей появились боли в верхней части живота.

Объективный осмотр: общее состояние удовлетворительное, питание пониженное. Кожные покровы обычной окраски, чистые. В легких дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. ЧДД 17 в мин. Верхушечный толчок в V межреберье. Тоны сердца ясные, ритм правильный, ЧСС 68 ударов в мин, АД 110/70 мм рт. ст. Язык влажный, густо обложен белым налетом. Живот при пальпации мягкий, болезненный в эпигастральной и околопупочной областях. Печень, селезенка не пальпируются. Симптом поколачивания по поясничной области отрицательный с обеих сторон. Стул полуоформленный, до 2 раз в день, без патологических примесей. Мочеиспускание не нарушено.

При ЭГДС от 22.03.2017 г. выявлено: пищевод свободно проходим, слизистая бледно-розовая. Кардия смыкается. В желудке небольшое количество жидкости и слизи, складки желудка с участками гиперемии, продольные, извитые, в нижней трети тела желудка по задней стенке две эрозии до 0,3 см с налетом фибрина. Луковица двенадцатиперстной кишки среднего объема, диффузно гиперемирована, по малой кривизне участки эрозий до 0,2 см с налетом фибрина. Постбульбарные отделы двенадцатиперстной кишки не изменены. Заключение: Поверхностный гастродуоденит. Эрозии антрального отдела желудка и луковицы двенадцатиперстной кишки.

Иммунологическое исследование: количество PG-1 – 118,0 мкг/л, PG-2 – 20,0 мкг/л, sIgA – 7,4 мг/л, титр CAТ к CagA H. pylori 1:5.

Выставлен заключительный клинический диагноз: Хронический гастродуоденит, фаза обострения. Множественные эрозии антрального отдела желудка и луковицы двенадцатиперстной кишки.

Характер жалоб, анамнестических, клинико-инструментальных данных, результаты иммунологического исследования указывают на локализацию эрозивно-язвенных дефектов в желудке и двенадцатиперстной кишке у больной.

Пример 3. Больной А., 31 год, медицинская карта стационарного больного № 2881/2/227, поступил на стационарное лечение в гастроэнтерологическое отделение ГБУЗ РМ «Мордовская республиканская клиническая больница» 25.04.2017 г. с жалобами на периодические ноющие боли в эпигастральной области, усиливающиеся после приема пищи, иногда тошноту, отрыжку воздухом.

Из анамнеза заболевания: больным себя считает в течение двух недель, когда на фоне стресса и нарушения питания появились боли в эпигастральной области, изжога, которые несколько уменьшались после приема омеза.

Объективный осмотр: общее состояние удовлетворительное. Сознание ясное. Кожные покровы обычной окраски и влажности, высыпаний нет. Периферических отеков нет. Лимфатические узлы не увеличены. Грудная клетка обычной формы. Над легкими перкуторно звук легочный, при аускультации дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются, ЧДД 17 в мин. Область сердца не изменена. Верхушечный толчок в V межреберье. Границы относительной сердечной тупости не смещены. Тоны сердца ясные. Ритм сердца правильный, ЧСС 68 в мин, АД 120/80 мм рт. ст. Язык влажный, обложен у корня белым налетом. Живот мягкий, чувствительный при пальпации в области эпигастрия. Печень у края правой реберной дуги. Симптом поколачивания по поясничной области отрицательный с обеих сторон. Стул регулярный, оформленный, 1 раз в день, без слизи и крови.

При ЭГДС № 22 от 26.04.17 г.: Пищевод свободно проходим, слизистая бледно-розовая. Кардия смыкается. В желудке небольшое количество жидкости и слизи, складки продольные, извитые, слизистая розовая. Луковица двенадцатиперстной кишки среднего объема, слизистая розовая, по передней стенке эрозия до 0,3 см с налетом фибрина. Постбульбарные отделы свободно проходимы, слизистая розовая. Заключение: Поверхностный дуоденит. Единичная острая эрозия передней стенки луковицы двенадцатиперстной кишки.

Иммунологическое исследование: количество PG-1 – 62,0 мкг/л, PG-2 – 11,0 мкг/л, sIgA – 5,8 мг/л, титр CAТ к CagA H. pylori 1:10.

Выставлен заключительный клинический диагноз: Острая единичная эрозия (0,3 см) передней стенки луковицы двенадцатиперстной кишки.

Характер жалоб, анамнестических, клинико-инструментальных данных, результаты иммунологического исследования указывают на локализацию эрозивно-язвенного дефекта в двенадцатиперстной кишке у больного.

По сравнению с известными решениями предлагаемый способ позволяет определять локализацию и выраженность заболеваний гастродуоденальной зоны, выявлять инфицированность высокопатогенными штаммами H. pylori, дифференцировать предраковые заболевания желудка и двенадцатиперстной кишки с помощью иммунологического исследования факторов крови, которое является малоинвазивным и не требует больших материальных затрат, а полученные результаты сопоставимы с данными фиброэзофагогастродуоденоскопии.

Источники информации

1. Назаров В.Е. и др. Эндоскопия пищеварительного тракта. – М: Триада-Фарм, 2002. – 176 с.

2. RU 2269132, МПК G01N 33/53, опубл. 27.01.2006 г.

3. Матвеева Л.В. Способ прогнозирования течения язвенной болезни желудка // Клиническая лабораторная диагностика. – 2016. – №4. – С. 233–237.

4. RU 2580309, МПК G01N 33/50, опубл. 10.04.2016 г.

5. P. Sipponen et al., Application of blood levels of gastrin-17, pepsinogen I and H. pylory antibody for nonendoscopic diagnosis of atrophic gastritis // DDW, 20-23 May, Atlannta, USA.

6. RU 2262706, МПК G01N 33/74, G01N 33/573, G01N 33/68, опубл. 20.10.2005 г.

7. RU 2519646, МПК G01N 33/50, опубл. 20.06.2014 г.