Результат интеллектуальной деятельности: Способ кросслинкинга роговичного коллагена с помощью фемтосекундного лазера в эксперименте

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано с целью проведения кросслинкинга роговичного коллагена в эксперименте для разработки дальнейшего лечения и профилактики кератоконуса.

Кератоконус или эктазия роговицы - дегенеративное заболевание, когда прочность коллагеновых фибрилл роговицы ослабевает примерно в половину от нормальных значений, что приводит к формированию конусовидной формы роговицы, смещению ее центра вниз, а также к возникновению миопической рефракции и астигматизма.

Этиология и патогенез кератоконуса недостаточно изучены. Это заболевание может быть первичным, генетически обусловленным, либо вторичным, являющимся одним из наиболее серьезных осложнений рефракционной хирургии.

Для стабилизации патологического процесса при кератоконусе применяется операция кросслинкинг. В химии и биоинженерии термин "кросслинкинг" (сшивка) используется для обозначения химико-физического воздействия на ткани, в результате которого происходит "уплотнение" или увеличение прочности структурных элементов данной ткани.

Ключевые подходы к лечению кератоконуса основаны на увеличении упругости, плотности роговицы.

Известен наиболее безопасный, отработанный и эффективный способ лечения кератоконуса путем кросслинкинга по Цюрихскому протоколу, созданный на основе исследований G. Wollensak, Е. Spoerl и Т. Seiler (Wollensak G., Spoerl E., Seiler T. Riboflavin/ultraviolet-a-induced collagen cross-linking for the treatment of keratoconus // Am. J. Ophthalmol. - 2003. - Vol. 135, №5. - P. 620-627).

Способ заключается в перекрестном связывании коллагена роговицы, что достигается путем фотополимеризации ее стромальных волокон при комбинированном воздействии фотосенсибилизатора - 0,1% раствора рибофлавина и ультрафиолетового (УФ) излучения с длиной волны 365 нм, выполняемый с проведением полной механической деэпителизации зоны роговицы диаметром 7-9 мм, что обеспечивает глубокое проникновение рибофлавина в строму роговицы.

Недостатками способа является отсутствие возможности его проведения у пациентов с толщиной роговицы менее 400 мкм, вследствие возможного проявления цитотоксического эффекта УФ-излучения на эндотелий роговицы, длительный болевой синдром в раннем послеоперационном периоде, риск развития инфекционных кератитов за счет нарушения эпителиального барьера роговицы, различные нарушения процесса реэпителизации, что приводит к длительному снижению работоспособности, увеличению числа случаев непереносимости контактной коррекции у данной категории пациентов в дальнейшем; резко сниженная послеоперационная острота зрения, вызванная послеоперационным отеком, а отсюда длительная реабилитация пациентов; кроме этого, для регистрации факта увеличения толщины роговицы (значения толщины роговицы более 400 мкм), требуется неоднократное проведение интраоперационной пахиметрии роговицы. Недостатками также является трудность точного регулирования облучаемой поверхности роговицы и, как следствие, нанесение повреждений здоровым участкам; невозможность провести сшивку коллагеновых волокон по всей толщине, возможность за один раз прооперировать только один глаз из-за сильного болевого синдрома после операции, длительность процедуры около 1 часа, сопровождающаяся дискомфортными ощущениями для пациента.

Авторам не известны способы кросслинкинга роговичного коллагена с помощью фемтосекундного лазера (ФС лазера) в эксперименте.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа, обеспечивающего возможность повышения биомеханических свойств роговицы в эксперименте за более короткий промежуток времени.

Техническим результатом, достигаемым в результате использования данного изобретения, является сшивка коллагеновых волокон и, соответственно, повышение плотности структуры роговицы и ее способности сопротивляться растяжению, сокращение времени выполнения операции, отсутствие этапа деэпителизации. Все это способствует, в перспективе применения данного способа стабилизации кератоконуса на людях, исключению возникновения послеоперационных осложнений, таких как длительный болевой синдром, инфекционный кератит, нарушение процесса реэпителизации.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе лечения кератоконуса в эксперименте с помощью кросслинкинга роговичного коллагена, заключающемся в обработке роговицы раствором 0,1% рибофлавина в течение 30 минут, облучении роговицы и смачивании ее поверхности в процессе облучения указанным раствором каждые 2 минуты, при этом облучение роговицы производят ФС лазером с длиной волны 525 нм, для чего размещают донорскую роговицу человека в искусственной передней камере, лазером облучают центральную зону роговицы в виде прямого кругового цилиндра, диаметром 4 мм, высотой 1 мм, верхним основанием которого является центральная зона роговицы, а продольная ось цилиндра совпадает с оптической осью глаза, при этом формируют множество одинаковых слоев с расстоянием между ними в 10 мкм, плоскость которых перпендикулярна продольной оси цилиндра; каждый слой сформирован из вокселей, расположенных в 2 мкм друг от друга в один ряд по высоте, каждый воксель - в виде эллиптического цилиндра, продольная ось которого лежит в плоскости слоя, большая ось основания перпендикулярна плоскости слоя; в каждом слое продольные оси вокселей одного слоя смещены на 90 градусов относительно продольных осей вокселей следующего слоя, что обусловлено настройкой лазерной установки, тем самым образуя структуру решетки, что способствует формированию в строме мощного каркаса, состоящего из обработанных лазером уплотненных волокон стромы, способствующего поддержанию формы роговицы и тем самым стабилизации патологического процесса., В предлагаемом способе проведения кросслинкинга роговичного коллагена с помощью ФС лазера, согласно изобретению, происходит воздействие на большую область стромы роговицы с крайне высокой скоростью перемещения лазерного луча, позволяя затрачивать на облучение всего объема цилиндрической трехмерной области роговицы, диаметром 4 мм и высотой 1 мм, не более 20 минут, благодаря использованию микроскопического объектива с малой числовой апертурой.

Предложенный способ кросслинкинга роговичного коллагена, инициируемый фемтосекундным лазером позволяет проводить эффективную сшивку коллагеновых волокон роговицы за более короткое время и, тем самым, достигать повышения плотности тканей стромы роговицы, в связи с высоким коэффициентом поглощения рибофлавина на длине волны 525 нм.

Способ поясняется фигурой, где представлена схема процесса трехмерной сшивки донорской роговицы человека, инициируемой ФС лазером. Позицией 1 обозначен микроскопический объектив (4х, N.A. 0,1), 2 - луч ФС-лазера, сфокусированный во внутреннем объеме цилиндрической области роговицы, 3 - область роговицы в виде цилиндра с основанием, соответствующим передней поверхности роговицы, 4 - воксели, образующие слой при воздействии ФС лазера (каждый слой соответствует по форме и размеру основанию цилиндрической зоны роговицы). Воздействие на роговицу ФС лазером с помощью микроскопического объектива, используемого для фокусировки излучения, производится внутри стромы с высокой точностью, локально, не повреждая эндотелиального и эпителиального слоев роговицы и, как следствие, происходит снижение риска возникновения нарушений реэпителизации, возникновения инфекционных осложнений, таких как эрозия поверхности роговицы,

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:

Сначала размещают донорскую роговицу человека в искусственной передней камере, имитирующей естественную кривизну роговицы. Затем производят обработку донорской роговицы раствором 0,1% рибофлавина в течение 30 минут. В процессе эксперимента поверхность роговицы смачивают раствором упомянутого раствора каждые 2 минуты.

Производят настройку ФС лазера.

Далее ФС лазером, с длиной волны 525 нм, путем перемещения луча лазера, послойно облучают цилиндрическую область роговицы высотой 1 мм; верхнее основание цилиндра соответствует передней поверхности роговицы, диаметром 4 мм.

Излучение ФС лазера фокусируют в строму роговицы, после чего с помощью гальваносканера (на чертеже не показан) фокус перемещают в перпендикулярно оптической оси глаза со скоростью 0,5 м/с, заполняя контур каждого слоя, состоящего из множества одинаковых по размеру объемных элементов (вокселей) - цилиндров, вытянутых по своей оси, с поперечным сечением в виде эллипсов, размер которых ограничен областью перетяжки микроскопического объектива и зависит от параметров оптической системы, прежде всего от числовой апертуры микроскопического объектива (в данном случае N.A.=0.1), мощности лазерного излучения и параметров облучаемого материала. В данном эксперименте эти параметры подбирались таким образом, чтобы обеспечить максимальное заполнение облучаемой цилиндрической области роговицы. Максимальный размер поперечного сечения вокселя в данном эксперименте составлял 4 мкм по большей оси и 3 мкм - по малой. Расстояние между вокселями составляет 2 мкм. Расстояние между плоскостями - 10 мкм.

В каждом слое продольные оси вокселей ориентированы параллельно друг другу, но перпендикулярно продольным осям вокселей рядом лежащего слоя, тем самым образуя структуру решетки. Средняя мощность лазерного излучения - 100 мВт, частота следования импульсов 70 МГц, длительность импульса 200 фс. Энергия в импульсе составляет 1.4 нДж, плотность энергии за один импульс около 0.03 Дж/см2. За время облучения (20 мин.) роговицы полная доза лазерной энергии составляет 63 Дж. Таким образом, на обработку 1 мм3 роговицы уходит, в среднем не более 100 секунд.

Пример 1.

Проводили эксперимент согласно изобретению, на 5 донорских роговицах человека, взятых в роговичном банке ФГАУ "МНТК "МГ" им. акад. С.Н. Федорова МЗ РФ".

После обработки роговицы ФС лазером, согласно вышеописанному способу, ее помещали в среду для консервации с целью визуализации структуры коллагеновых волокон и определения эффективного модуля Юнга.

Эксперимент с проведением способа кросслинкинга роговичного коллагена, инициированного ФС-лазером с длиной волны 525 нм, показал очень высокую эффективность, так как в результате было получено повышение плотности структур роговицы и ее способности сопротивляться растяжению. О чем свидетельствует увеличение более чем в три раза, по сравнению с исходными значениями, модуля Юнга, в области ФС воздействия, а также уровня автофлуоресценции структуры коллагена роговицы при визуализации коллагеновых волокон при лазерной сканирующей микроскопии роговицы в обработанной лазером области по всей глубине образца, так как в процессе проведения эксперимента происходит воздействие на ткани стромы роговицы, влияя на ее морфологию, повышая коэффициент отражения внеклеточного матрикса, увеличение количества кератоцитов, внеклеточных отложений.

Необходимое время эффективной обработки значительно ниже при использовании лазерного источника с длиной волны 525 нм по причине высокого коэффициента поглощения рибофлавина на данной длине волны.