Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве вирус вакцин.

Известен способ деконтаминации питательных сред с использованием антибиотиков - бензилпенициллина, стрептомицина и канамицина по 100 Ед/мл (см. кн. Животная клетка в культуре // Методы и применение в биотехнологии / Под общ. ред. проф. Дьяконова Л.П. - М.: Издательство "Спутник+", 2009. - с. 423).

Известен также способ деконтаминации перевиваемых линий клеток ПГ-80 и СПЭВ с использованием ПАВ (этоний) в дозе 7,5 мкг/мл с тетрациклином (50 мкг/мл) и канамицином (250 мкг/мл).

Общим недостатком указанных способов деконтаминации питательных сред и культур клеток является, во-первых, токсичность используемых деконтаминантов (антибиотиков) для культур клеток и, во-вторых, привыкание к известным антибиотикам, что ведет к снижению эффективности их применения.

Между тем из области радиационной микробиологии известно бактерицидное действие ионизирующих излучений. Последующие исследования радиобиологов показали возможность практического использования бактерицидного действия радиации для стерилизации различных изделий медицинского назначения.

Стерилизация (деконтаминация), проводимая с помощью ионизирующего излучения, получила название радиационной или лучевой стерилизации. Ввиду того, что лучевая деконтаминация проводится без высокой температуры, она была названа также холодной стерилизацией.

Благодаря высокой проникающей способности гамма - излучения радиоактивных изотопов и других видов ионизирующего излучений, оказалось возможными стерилизовать медицинскую продукцию (лекарственные средства, шприцы, кетгут, шовный материал, посуду, сыворотки крови, питательные среды и т.д.) в промышленных масштабах. Используемые для радиационной стерилизации дозы излучения рассчитаны на бактерицидной эффект, гарантирующий надежное обеспечение деконтаминации.

Действие ионизирующей радиации на живую клетку (животную, растительную, микробную) основано на разложении (радиолиз) молекул воды, содержащейся в живых клетках, на ионы H₂O⁺ и H₂O^-, которые, расщепляясь на свободные радикалы Н^- и ОН^-, обладают высокой токсичностью. Последние, взаимодействия с живой клеткой, вызывают глубокие изменения (распад ДНК, нуклеиновых кислот, ферментов, полисахаридов, пептидов, аминокислот, липидов, белков), которые приводят к разрушению и гибели клетки, что дает возможность использования их для инактивации животных, растительных и микробных клеток.

Учитывая перспективность использования ионизирующих излучений в медицине, в 1960-1970 гг. были проведены радиомикробиологические исследования в этой области, результаты которых показали, что облучение питательных сред гамма-лучами в дозах 10-30 кГр обеспечивает абсолютную стерильность питательных сред (см. кн. М.А. Туманяна и Д.А. Каушанского "Радиационная стерилизация". - М.: Медицина, 1974. - С. 66-91).

Наиболее близким к предлагаемому является способ деконтаминации сухих питательных сред (среда 199, среда Игла, гидролизата лактоальбумина-ГЛА, версена, Дульбекко, трипсина) с использованием деконтаминанта физической природы - гамма-лучей в дозах (1,5-6,5)×10⁴ Гр (см. статью И.Д. Сперанской "Радиационная стерилизация питательных сред" // Сб. научн. тр. ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. - М., 1977. С. 67-68).

Несмотря на то, что питательные среды, простерилизованные (деконтаминированные) гамма-лучами, хотя и не утрачивали биологических свойств, необходимых для культур клеток, однако используемые для деконтаминации дозы гамма лучи очень высокие, а это приводит к увеличению времени облучения. Так, если мощность экспозиционной дозы излучения используемых радиационных установок не превышает 10 Р/мин, то для полной стерилизации питательных сред в дозах 1,5-60 кГр необходимо 14 часов непрерывного облучения, а это создает довольно серьезную как техническую задачу, так и радиационную опасность для обслуживающего персонала. Поэтому возникает необходимость поиска менее жестких условий облучения стерилизуемых (деконтаминируемых) питательных сред.

Известно, что одним из существенных факторов повышения эффективности радиостерилизации (радиодеконтаминации) является использование комбинированного радиационно-термического воздействие на микроорганизмы.

Так, на примере спорообразующего микроорганизма - возбудителя ботулизма (Cl. botulnus) установлено, что прогревание спор возбудителя резко повышает гибель микробных клеток (см. кн. М.А. Туманяна, Д.А. Каушанского - "Радиационная стерилизация". - М.: Медицина, 1974. - С. 30-31). Эти данные подтверждают гипотезу, согласно, который низкая температура снижает образование окисленных веществ и диффузию их к чувствительным участкам клетки, а предварительный нагрев питательных сред перед облучением может существенно снизить радиорезистентность бактерий, усиливая их бактерицидное действие.

Полученные данные позволяют предположить их синергетическое действие на фоне комбинированного воздействия - температуры и ионизирующего излучения. О действии губительных доз радиации в комбинации с температурным воздействием существует несколько гипотез. Согласно одной из них, нагревание приводит молекулы в состояние возбуждения, что усиливает действие радиации, облегчая денатурацию белков клетки; согласно другой - усиление действия радиации при одновременном нагревании объясняется проявлением кислородного эффекта, при этом кислород соединяется со свободными радикалами, образуя комплексы, смертельные для клеток (см. кн. M.A. Tumanjan. - Radiosterilisation of Meniral Products - IAEA, Vienna, 1967. - P. 199). Можно предположить, что при этом имеют место изменения химических реакций, которые возникают в клетке при повышении или понижении температуры, в результате которых образуются вещества, которые повреждают или защищают важные компоненты клетки, что способствует усилению действия радиации.

Вышеизложенное явилось основанием для проведения исследований по разработке способа деконтаминации питательных сред для культивирования клеток in vitro с использованием комбинированного термо-радиационного метода обработки питательных сред.

Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего эффективную деконтаминацию питательных сред, используемых в биотехнологии для культивирования клеток животных in vitro с целью получения на них вирус - вакцин и позволяющего снизить дозы, время облучения и обеспечить радиационную безопасность обслуживающего персонала.

Поставленная задача решается тем, что в способе деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro, предусматривающим облучение их гамма-лучами, предварительно перед облучением питательные среды подвергают термической обработке путем нагрева до температуры 55-60°С в течение 25-30 мин, а облучение проводят в дозе (0,8-1,5)×10³ Гр. Способ осуществляют следующим образом.

Питательные среды различного состава (безбелковые: синтетические 199, минимальные - MEM), белковые: гидролизат лактоальбумина - ГЛА, сыворотка крупного рогатого скота - (СКРС), наиболее часто применяемые в биотехнологии для культивирования животных клеток in vitro с целью изготовления на их основе вирусвакцин, разливают во флаконы по 100-200 см³, и предварительно перед облучением подвергают термическому воздействию путем нагревания в сушильном шкафу или на водяной бане до температуры 55-60°С в течение 25-30 мин. По истечении указанной экспозиции подогретые питательные среды подвергают облучению в дозах (0,8-1,5)×10³ Гр путем облучения на гамма установке "Исследователь" с источником излучения ⁶⁰Со при мощности дозы излучения 3,45×10² А/кг. Подвергнутые комбинированному термо-радиационному воздействию питательные среды проверяют на стерильность путем высева их на бактериологические среды: мясопептонный бульон - МПБ и мясопептонный агар - МПА в количестве 0,5 мл, посевы культивируют в течение 7 сут, проводя ежедневные просмотры посевов, регистрируя количество выросших колоний на бактериологических средах.

Степень деконтаминации подвергнутых термо-радиационному воздействию питательных сред определяют по наличию или отсутствию роста микроорганизмов в бактериологических средах.

Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение оптимальной дозы гамма-лучей, обеспечивающей деконтаминацию питательных сред при спонтанной (случайной) контаминации их микроорганизмами.

Учитывая, что питательные среды в технологическом процессе (при транспортировке, длительном хранении, нарушении стерильности в процессе подготовки к использовано и т.д.) могут быть контаминированы различными видами микроорганизмов: бактерии, кокки, грибы, микоплазмы, проводили опыты по определенно оптимальной стерилизирующей (деконтаминирующей) дозы гамма-лучей.

Для этой цели использовали безбелковые (синтетическую среду 199 и минимальную среду - MEM) и белковые (сыворотку крупного рогатого скота - СКРС и гидролизат лактоальбумина - ГЛА) питательные среды, которые разливали во флаконы, закупоривали резиновыми пробками и размещали в облучательную камеру гамма-установки "Исследователь" и подвергали облучению в дозах 5×10², 1×10³, 2×10³, 4×10³, 8×10³, 1×10⁴, 1,5×10⁴, 2×10⁴ Гр. Облученные в вышеуказанных дозах питательные среды подвергали бактериологическими исследованиям путем высева проб из каждой среды по 1 мл на мясо-пептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ) с последующим термостатированием бактериальных сред в течение 7 суток и с последующей регистрацией количества выросших колоний.

Степень деконтаминации облученных питательных сред определяли путем микроскопирования препаратов по наличию или отсутствию роста микроорганизмов в исследуемых пробах.

Установлено, что в пробах из безбелковых питательных, облученных в дозах 0,8×10³, 1,0×10⁴ и 1,5×10⁴ Гр роста микроорганизмов не наблюдалось, в то время как в пробах, из питательных сред, облученных в дозах 1×10³, 5×10², 2×10³, 4×10³ Гр обнаружен рост единичных колоний микроорганизмов.

Результаты параллельных микробиологических исследований по радиодеконтаминации белковых питательных сред (СКРС, ГЛА) показали, что надежная стерилизация их наступала при облучении в дозах 1,5×10⁴ - 2×10⁴ Гр.

Следовательно, надежное обеззараживание (деконтаминация) безбелковых и белковых питательных сред при случайной контаминации их микроорганизмами достигается при облучении их гамма-лучами в дозах 8×10³ - 2×10⁴ Гр.

Пример 2. Определение оптимальных деконтаминирующих доз гамма-лучей при искусственной контаминации питательных сред аспорогеными и спорогенными видами микроорганизмов.

Поскольку при спонтанной (случайной) контаминации питательных сред концентрация микробных клеток может быть весьма низкой (единичные колонии), в определенных условиях (нарушение условий хранения, нарушение стерильности при хранении, отключение холодильников, попадание влаги в емкости и т.д.), попавшие в питательные среды контаминанты, активно размножаясь в питательных средах (особенно - в белковых), могут создать высокую концентрацию микробов, что диктует необходимость подбора оптимальных режимов деконтаминации.

С учетом изложенного, были поставлены опыты радиационной деконтаминации питательных сред при их искусственной контаминации аспорогенными и спорогенными микроорганизмами, обладающими различной радиорезистентностью.

Для этой цели, питательные среды, указанные в примере 1, подвергали искусственной контаминации путем внесения в питательные среды аспорогенных (St. aureus) и спорогенных (B. subtilis) микроорганизмов, обладающих высокой и весьма высокой резистентностью по отношению к химическим (антибиотики, дезинфектанты) и физическим (ионизирующие излучения) агентам. Искусственную контаминацию питательных сред проводили путем внесения вышеуказанных микроорганизмов в питательные среды в концентрации 1×10⁷ микробных клеток на 1 мл питательной среды. Облучение искусственно контаминированных питательных сред (199, MEM, ГЛА и СКРС) проводили в дозах гамма-лучей 1,0×10⁴, 2,0×10⁴ и 3,0×10⁴ Гр. Дальнейшую обработку питательных сред, микробиологические исследования и определение степени деконтаминации питательных сред проводили согласно примеру 1.

Установлено, что надежная деконтаминация искусственно контаминированных питательных сред, контаминированных St. aureus, достигалась при облучении их гамма-лучами в дозах 1×10⁴ - 2×10⁴ Гр (среда 199, MEM, ГЛА и СКРС) и 3×10⁴ Гр (все среды контаминированные B. subtilis.

Следовательно, надежное обеззараживание (деконтаминация) питательных сред, контаминированных аспорогенной микрофлорой (St. aureus) достигается при облучении гамма-лучами в дозах (1-2)×10⁴ Гр, а контаминированных радиорезистентными спорогенными микроорганизмами (B. subtilis) - при облучении в дозах (2-3,0)×10⁴ Гр.

Пример 3. Изучение комбинированного действия повышенной температуры и ионизирующего излучения на наиболее вероятные контаминанты питательных сред.

Учитывая, что наиболее часто встречающимися контаминантами питательных сред являются стафилококки, кишечная палочка и сенная палочка, проводили опыты с культурой стафилококков, обладающих значительной термо-, химио-, радиорезистентностью.

Для этой цели готовили взвесь клеток St. aureus на физиологическом растворе, содержащую 1×10⁷ стафилококков в 1 мл. Облучение клеток производили гамма-излучением ⁶⁰Со в дозах 0,8×10³ Гр, 1,0×10³ Гр, 1,5×10³ Гр. Одновременно флаконы с бактериями нагревали в сушильном шкафу при 45°, 50°, 55° и 60°С в течение 15, 20 и 30 мин. Эффективность комбинированного терморадиационного метода воздействия на испытуемые микробы определяли по выживаемости стафилококков путем учета выросших на питательном агаре в чашках Петри колоний.

Установлено, что полный бактерицидный эффект для 100% микробов наступал при предварительном нагревании питательных сред в течение 20-30 мин при температуре 55-60°С и облучении в дозе 1,5×10³ Гр.

Полученные данные позволяют предположить синергетическое действие двух агентов физической природы (температуры и ионизирующего излучения), которые послужили основанием для проведения опытов по использованию комбинированного радиационно-термического метода стерилизации (деконтаминации) питательных сред, используемых в биотехнологии для культивирования на них животных клеток in vitro и выращивания на них вирусов с целью изготовления вирус - вакцин.

Пример 4. Проверка эффективности комбинированного терморадиационного метода деконтаминации питательных сред, используемых в биотехнологии для выращивания культур клеток животных in vitro.

Для этого питательные среды (199, MEM, ГЛА и СКРС), разлитые во флаконы емкостью 100 см³, перед облучением нагревали в сушильном шкафу при температуре 40°, 45°, 50°, 55°, и 60°С в течение 15, 20, 25, 30 мин, а затем подвергали облучению гамма-лучами ⁶⁰Со в дозах 1×10², 2×10³, 4×10², 8×10², 0,8×10³, 1×10³, 1,5×10³, 2×10³, 4×10³, 8×10³, 1×10⁴ Гр.

Подвергнутые комбинированному терморадиационному воздействию питательные среды проверяли на стерильность (степень деконтаминации) путем высева проб из этих сред на бактериологические среды (МПА, МПБ) в количестве 0,5 мл, посевы культивировали в течение 7 сут, проводя ежедневные просмотры, регистрируя количество выросших колоний на бактериологических средах.

Установлено, что питательные среды, нагретые перед облучением до температуры 55-60°С в течение 25-30 мин, а затем облученные гамма-лучами в дозах (0,8-1,5)×10³ Гр, оказались стерильными, поскольку в бактериологических средах роста микроорганизмов не обнаруживалось. Изменение указанных параметров терморадиационного воздействия в сторону снижения доз приводило к ослаблению степени деконтаминации, а увеличения их - к ухудшению питательных свойств деконтаминированных сред.

Таким образом, предлагаемый способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro позволяет обеспечить надежную стерилизацию питательных сред, снизить дозы облучения в 13,3 раза по сравнению с только облучением, сократить время облучения в 2 раза и обеспечить безопасность работы обслуживающего персонала.