Результат интеллектуальной деятельности: Способ нормализации активности супероксиддисмутазы нейтрофилов у новорожденных телят с дефицитом железа

Изобретение относится к биологии и ветеринарии. Аналогов заявляемого способа не существует.

В литературе имеются рекомендации по назначению ферроглюкина для коррекции железодефицитной анемии (Внутренние незаразные болезни сельскохозяйственных животных. Под ред. В.М. Данилевского. М.: «Агропромиздат», 1991. - 576 с.). В качестве эффективных стимуляторов жизнедеятельности растущего организма в современной ветеринарии применяется крезацин - производное ароксиалкилкарбоновых кислот. Он представляет собой белый кристаллический порошок, хорошо растворимый в воде, со слабым специфическим запахом, сладковато-горьковатого вкуса. Крезацин проявляет эффективное стимулирующее действие на живые организмы, повышает выживаемость животных в неблагоприятных и экстремальных условиях, стимулируя или нормализуя жизненные процессы (Байматов В.Н., Латыпов М.М. Влияние крезацина на состояние птицы. Ветеринария, 2006, №11, с. 49-51). В литературе имеются рекомендации по назначению гамавита для оптимизации роста и улучшения обменных процессов (Деева А.В., Салахова З.А., Лобова Т.П. и др. Повышение сохранности и продуктивности поросят при использовании фоспренила и гамавита // Ветеринария. - 2006. - №4. - С.13-15.).

Однако, никогда ранее лечебный комплекс, состоящий из ферроглюкина, крезацина и гамавита, не применялся у новорожденных телят с дефицитом железа с целью нормализации активности супероксиддисмутазы (СОД) в нейтрофилах.

Целью изобретения является устранение нарушений активности СОД нейтрофилов у новорожденных телят с дефицитом железа.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для коррекции активности СОД нейтрофилов новорожденным телятам с дефицитом железа назначается ферроглюкин по 150 мг (2 мл) внутримышечно, двукратно с интервалом 4 суток, крезацин 5 мг/кг в сутки, начиная одновременно с первой инъекцией ферроглюкина, включив его в схему выпаивания на 4 суток и гамавит внутримышечно один раз в сутки утром 0,05 мл/кг на 4 суток, начиная одновременно с ферроглюкином и крезацином.

Способ позволяет нормализовать активность СОД нейтрофилов у новорожденных телят с дефицитом железа на следующие сутки после завершения коррекции, переводя ее на уровень соответствующий таковому для здоровых новорожденных телят. У пролеченных таким образом животных в последующем отмечается стабильно нормальное состояние активности СОД нейтрофилов, что позволяет у новорожденных телят с дефицитом железа понижать агрегационную активность нейтрофилов, тем самым способствуя стойкой оптимизации микроциркуляции и минимизации риска тромботических осложнений, увеличивая привесы, ускоряя рост и развитие животных и снижая падеж.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. После взятия крови ведется выделение из нее нейтрофилов. Суть этого выделения заключается в том, что 2 мл цельной гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) крови смешивается для снижения ее вязкости с 3 мл стерильного физиологического раствора. Смесь наслаивается на двойной градиент плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого градиента равняется 2 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе между градиентами появляется кольцо клеток, состоящее из нейтрофильных гранулоцитов на 98-100%. Эритроциты при этом осаждаются на дно пробирки. Кольцо нейтрофильных гранулоцитов аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут. Полученная клеточная суспензия используется в дальнейшем для исследования активности СОД нейтрофилов. Концентрация нейтрофилов в суспензии подсчитывается с помощью камеры Горяинова.

Принцип определения активности СОД основан на восстановлении нитротетразолия супероксидными радикалами, которые образуются при реакции между феназинметасульфатом и восстановленной формой никотинамиддинуклеотида (NAD⋅H). Образование нитроформазана, продукта восстановления нитротетразолия, блокируется наличием в пробе СОД. Это позволяет по количеству нитроформазана оценить активность СОД. В данном анализе используются следующие реагенты:

1) 0,15 М фосфатный буфер (рН 7,8) (4,48 г Na₂HPO₄, 0,25 г КН₂РO₄ растворенный в 500 мл дистиллированной воды).

2) инкубационная смесь 37 мг ЭДТА-Na₂, 330 мг нитротетразолия голубого, 55 мг феназинметасульфата смешивали с 300 мл фосфатного буфера, оставляли стоять на ночь и утром фильтровали.

3) раствор NAD⋅Н (152 мг NAD⋅H растворяли в 10 мл трис-ЭДТА-буфера).

4) трис-ЭДТА-буфер, рН 8,0 (37 мг ЭДТА-Na, 24 мг трис растворяли в 100 мл дистиллированной воды).

Схема определения СОД в суспензии нейтрофилов приведена в табл.

Смешивание проводят при комнатной температуре, измеряя экстинкцию холостой и исследуемой проб при 540 нм на спектрофотометре. Экстинкция холостой пробы составляет около 0,680. Расчет производят по формуле:

процент блокирования образования нитроформазана.

где Е _{х. пр} и Е _{исс. пр} - экстинкция соответственно холостой и исследуемой проб. С помощью калибровочной кривой, построенной для стандартных растворов СОД (схема), оценивают активность СОД в пробе на основании рассчитанного процента разрушения перекиси водорода. Активность СОД относят к концентрации нейтрофилов (в МЕ/10⁹ нейтрофилов) в исследуемой взвеси нейтрофилов.

На схеме по оси абсцисс отложена активность СОД в МЕ/10⁹ нейтрофилов, по оси ординат - блокирование восстановления нитротетразолия в %. Нормативные значения активности СОД нейтрофилов новорожденных телят составляют 1500,0-1700,0 МЕ/10⁹ нейтрофилов.

При дефиците железа у новорожденных телят весьма часто происходит понижение активности СОД нейтрофилов. При установлении этого новорожденному теленку с дефицитом железа необходимо назначать лечение ферроглюкином по 150 мг (2 мл) внутримышечно, двукратно с интервалом 4 суток, крезацином 5 мг/кг в сутки, начиная применять его одновременно с первой инъекцией ферроглюкина, включив его в схему выпаивания на 4 суток и гамавитом внутримышечно один раз в сутки утром 0,05 мл/кг на 4 суток, начиная одновременно с ферроглюкином и крезацином.

Заявляемый способ был апробирован на более чем 120 новорожденных телятах с дефицитом железа и явлениями анемии с достижением через 4 суток проведенного лечения нормализации у них активности СОД нейтрофилов.

Пример 1. У новорожденного теленка №8 с дефицитом железа и анемией было выявлено нарушение эритропоэза за счет снижения уровня содержания железа в его организме (сывороточное железо 12,2 мкмоль/л, сидероциты 1,3%), при количестве гемоглобина у него 78,0 г/л, эритроцитов - 3,5×10¹²/л.

При обследовании у теленка было выявлено ослабление в нейтрофилах активности СОД до 1200,0 МЕ/10⁹ нейтрофилов. Теленку был назначен ферроглюкин по 150 мг (2 мл) внутримышечно, двукратно с интервалом 4 суток, крезацин 5 мг/кг в сутки, начиная одновременно с первой инъекцией ферроглюкина, включив его в схему выпаивания на 4 суток и гамавит внутримышечно один раз в сутки утром 0,05 мл/кг на 4 суток, начиная одновременно с ферроглюкином и крезацином.

Теленок находился под постоянным наблюдением с ежедневным контролем активности СОД нейтрофилов.

На следующие сутки после окончания лечения у теленка достигнута нормализация в его крови сывороточного железа 22,5 мкмоль/л, сидероцитов 8,3%, количества гемоглобина 120,0 г/л, эритроцитов - 5,1×10¹²/л при достижении нормализации активности СОД нейтрофилов (1600,0 МЕ/10⁹ нейтрофилов), что обеспечивало ослабление риска активации агрегационных свойств нейтрофилов и развития у животных тромбозов в будущем.

Пример 2. У новорожденного теленка №14 с дефицитом железа и анемией было выявлено нарушение эритропоэза за счет снижения уровня содержания железа в его организме (сывороточное железо 12,5 мкмоль/л, сидероциты 1,4%), при количестве гемоглобина у него 84,0 г/л, эритроцитов - 3,5×10¹²/л.

При обследовании у теленка было выявлено ослабление в нейтрофилах активности СОД до 1200,0 МЕ/10⁹ нейтрофилов. Теленку был назначен ферроглюкин по 150 мг (2 мл) внутримышечно, двукратно с интервалом 4 суток, крезацин 5 мг/кг в сутки, начиная одновременно с первой инъекцией ферроглюкина, включив его в схему выпаивания на 4 суток и гамавит внутримышечно один раз в сутки утром 0,05 мл/кг на 4 суток, начиная одновременно с ферроглюкином и крезацином.

Теленок находился под постоянным наблюдением с ежедневным контролем активности СОД нейтрофилов.

На следующие сутки после окончания лечения у теленка достигнута нормализация уровня в его крови сывороточного железа 23,9 мкмоль/л, сидероцитов 8,5%, количества гемоглобина 123,0 г/л, эритроцитов - 5,1×10¹²/л при нормализации активности СОД нейтрофилов (1650,0 МЕ/10⁹ нейтрофилов), что обеспечивало ослабление риска активации агрегационных свойств нейтрофилов и развития у животных тромбозов в будущем.

Использование предлагаемого способа коррекции активности СОД нейтрофилов у новорожденных телят с дефицитом железа в биологии и ветеринарии поможет избежать многих сосудистых осложнений и оптимизировать микроциркуляцию и трофику тканей у животных, оздоровить поголовье, снизить падеж, ускорить рост и развитие телят, увеличить их ежесуточные привесы.