2-Аминия-7-(диэтиламино)-4-(4-метоксибензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-4Н-хромен-3-карбонитрила N-ацетиламиноэтаноат, проявляющий противоопухолевую активность

Область применения

Изобретение относится к медицине, к биологически активным соединениям, конкретно к 2-аминия-7-(диэтиламино)-4-(4-метоксибензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-4Н-хромен-3-карбонитрила N-ацетиламиноэтаноату (соединение 1), проявляющему противоопухолевую активность.

Уровень техники.

На сегодняшний день практически нет совершенных противоопухолевых препаратов. Большая часть из них подавляет лишь временно деление раковых клеток. В связи с этим актуальным является создание противоопухолевых препаратов, малотоксичных, эффективно, действующих на орган-мишень, ингибирующих метастазирование.

В патенте US 20050154015 А1 (2005 г.) «Замещенные 4H-chromene и их аналоги в качестве активаторов каспаз и индукторов апоптоза и их использование». Синтезировано более 100 аналогов хроменов и изучена противоопухолевая активность на двух линиях рака (T47D, ZR-75-1 - рак молочной железы - карцинома протоков), активаторы каспаз и ускорители апоптоза.

WO 2002092594 А1 (2002 г.) «Замещенные 4Н-хромены и аналоги в качестве активаторов каспаз и индукторов апоптоза.»

Замещенных 4Н-хромены и их аналоги, являются активаторами каспаз и индукторами апоптоза, могут быть использованы для контроля за ростом и распространением опухолевых клеток.

ЕР 1230 232 В1 (2004 г.) «Синтез и исследования 2-Амино-7-(диэтиламино)-4-(7-метоксибензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-4Н-хромен-3-карбонитрила и его производных. Активаторы каспаз.» Приводятся фармацевтические композиции с противоопухолевой активностью.

Однако, в доступных публикациях соединение 1 не описано.

Раскрытие изобретения.

Целью изобретения является синтез нового соединения 2-аминия-7-(диэтиламино)-4-(4-метоксибензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-4Н-хромен-3-карбонитрила N-ацетиламиноэтаноата (соединение 1), проявляющего противоопухолевую активность, и создание на его основе лекарственного средства с противоопухолевой активностью.

Технический результат достигается тем, что предложен метод синтеза соединения 1 и проведены исследования его биологической активности

Пример 1.

Синтез 2-аминия-7-(диэтиламино)-4-(4-метоксибензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-4Н-хромен-3-карбонитрила N-ацетиламиноэтаноата (соединение 1)

В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, термометром и обратным холодильником загружают 60 мл этанола, 11,04 г (0,06 м) 3-метокси-4,5-метилен-диоксибензальдегида, 3,99 г (0,06 м) малонодинитрила, 9,9 г (0,06 м) 3-диэтиламинофенола и 2,011 г (0,015 м) триэтиламина. Смесь при перемешивании нагревают до 80°С, кипятят 10-15 минут, охлаждают при перемешивании до комнатной температуры (20-25°С, кристаллизуют при 5-8°С 6 часов. Осадок отфильтровывают, промывают этанолом, сушат до постоянного веса.

Полученный продукт перекристаллизовывают из этанола в присутствии активированного угля, фильтруют от угля и кристаллизуют 2 часа при 0+5°С.

Получают 4,93 г 2-аминохромена, кристаллический порошок желтовато-оранжевого цвета, Т_пл. 135-138°С.

В гомогенизатор загружают 9,93 г (0,025 м) 2-аминохромена, 2,93 г (0,025 м) N-ацетиламиноэтановой кислоты, массу тщательно гомогенизируют в течение 10-15 минут. В колбу, снабженную мешалкой, термометром и обратным холодильником загружают 50 мл этилового спирта и гомогенизированную смесь реагентов. Массу при перемешивании нагревают до кипения, выдерживают 5-10 минут, фильтруют, на роторном испарителе от фильтрата отгоняют этиловый спирт при 30 мм рт.ст. в количестве 2/3 от загруженного объема. Остаток кристаллизуют при 5-8°С в течение 6-8 часов. Осадок промывают охлажденным этиловым спиртом, сушат до постоянного веса.

Получают 10.85 г соединения 1, желтый кристаллический порошок, Т_пл. 144-145°С.

Найдено, %: С 60,99; Н 5,91; N 10,91 C₂₆H₃₀N₄O₇

Ввчислено, %: С 61,17; Н 5,92; N 10,97

ИК-спектр, v см^-1 3360, 3390, 3490 (NH), 2205 (CN), 1620,1640 (С=С), 1560, 1540 (NHCO).

Исследования фармакологической активности производного аминохромена общей формулы (1) представлены в нижеследующих примерах.

Пример 2.

Острая токсичность производного аминохромена общей формулы (1) и прототипа

Острая токсичность 1 изучена в опытах на белых беспородных мышах (40 особей обоего пола весом 19-22 г, полученных из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России) при внутрижелудочном введении субстанции 1 в виде порошка и официнальной твердой лекарственной формы прототипа в крахмальном клейстере объеме 0,8-0,9 мл в возрастающих концентрациях. В случае превышения общего объема вводимого вещества 1,0 мл осуществляли кратное введение через каждые 30 мин.

Показатель ЛД₅₀ рассчитывали методом Личфилда-Уилкоксона (кн. Е.В. Арзамасцев, И.В. Березовская, О.В. Верстакова и др. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия лекарственных средств / Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 25-35; Гуськова Т.А. Токсикология лекарственных средств. - М.: Издательский дом "Русский врач". - 2003. - С. 20-24.). Результаты исследования производного аминохромена общей формулы (1), а также прототипа циклофосфамида, представлены в табл. 1.

Из предлагаемых в таблице данных хорошо видно, что заявляемое соединение более, чем в десять раз менее токсично, нежели прототип циклофосфамид при введении внутрь. При этом, производное аминохромена общей формулы (1) относится к классу 4 (нетоксичные вещества) классификации токсичности химических веществ в соответствии с ГОСТом 12.1.007 - 76 (Березовская И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения // Хим.-фарм. журнал. - 2003. -Т. 37, №3. - С. 32-34).

Пример 3.

Противоопухолевая активность производного аминохромена общей формулы (1) на модели сингенной опухоли карциномы легкого Льюис у мышей

Противоопухолевая активность производного аминохромена общей формулы (1) изучена в опытах на 30 мышах обоего пола (по 15 особей каждого пола) линии C₅₇Bl/6, полученных из питомника лабораторных животных - филиала ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (г.Пущино) при внутрижелудочном введении субстанции производного аминохромена общей формулы (1) и циклофосфамида (прототип) в дозе, составляющей 5% от показателя ЛД₅₀ при данном пути введения, объемом 0,8-1,0 мл в крахмальном клейстере, через 72 часа после перевивки опухоли в течение 5 суток.

Противоопухолевую активность изучали на сингенной опухолевой системе -карциноме легкого Льюис (LLC) из банка опухолевых штаммов ФГБУ «Национальный исследовательский медицинский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Опухоль воспроизводили перевивкой клеток опухолевого штамма (Трещалина Е.М., Жукова О.С, Герасимова Г.К. и др. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств / Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 640-654).

Противоопухолевое действие оценивали в соответствии с международными рекомендациями по изучению специфической активности противоопухолевых препаратов (Geran R.L, Greenberg N.H., MacDonald М.М., Schumacher A.M., Abbott B.J. Protocols for screening chemical agents and natural products against tumor and other biological systems // Cancer Chemother. Rep. - 1972. - Vol. 3. - P. 1-103).

Результаты исследования противоопухолевого действия производного аминохромена общей формулы (1) на модели сингенной опухоли - карциномы легкого Льюис представлены в табл. 2. Из представленных в табл. 2 данных хорошо видно, что внутрижелудочное введение 1 в дозе 25 мг/кг сопровождается статистически значимыми различиями в объеме опухоли между контрольной группой и группой животных, получавших прототип в эквитоксической дозе, на 14-х и 22-х сутках наблюдения. В эти же временные интервалы статистической значимостью отличался и индекс торможения роста опухоли.

Таким образом, в отличие от прототипа, производное аминохромена общей формулы (1) отличается большей силой противоопухолевого действия в отношении первичного опухолевого узла, формирующегося в месте трансплантации опухолевых клеток в организм мышей.

Пример 4.

Антиметастатическая активность производного аминохромена общей формулы (1) на животной модели с использованием ксенографта человеческой опухоли - немелкоклеточного рака легкого

Антиметастатическую активность производного аминохромена общей формулы (1) изучена в опытах на 6-8 недельных 15 мышах-самцах линии атомических мышей nu/nu BALB/c, полученных из питомника лабораторных животных - филиала ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (г. Пущино) при внутрижелудочном введении субстанции производного аминохромена общей формулы (1) и циклофосфамида (прототип) в дозе, составляющей 5% от показателя ЛД₅₀ при данном пути введения, объемом 0,8-1,0 мл в крахмальном клейстере, через 72 часа после перевивки опухоли в течение 5 суток.

Антиметастатическую активность изучали на опухолевой системе - ксенографте немелкоклеточного рака легкого из банка опухолевых штаммов ФГБУ «Национальный исследовательский медицинский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Опухоль воспроизводили перевивкой клеток опухолевого штамма (Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств / Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 640-654).

Антиметастатическое действие оценивали в соответствии с международными рекомендациями по изучению специфической активности противоопухолевых препаратов (Geran R.I., Greenberg N.H., MacDonald М.М., Schumacher A.M., Abbott B.J. Protocols for screening chemical agents and natural products against tumor and other biological systems // Cancer Chemother. Rep. - 1972. - Vol. 3. - P. 1-103).

Результаты исследования антиметастатического действия производного аминохромена общей формулы (1) на модели немелкоклеточного рака легкого представлены в табл. 3. Из представленных в табл. 3 данных хорошо видно, что внутрижелудочное введение 1 в дозе 25 мг/кг сопровождается статистически значимыми различиями как в количестве, так и объеме метастатического поражения легких животных при сравнении с мышами контрольной группой и группы животных, получавших прототип в эквитоксической дозе, на 31-е сутки формирования опухоли.

Таким образом, в отличие от прототипа, производное аминохромена общей формулы (1) отличается большей антиметастатической активностью в отношении ксенографта немелкоклеточного рака легкого, перевитого в организм мышей.

Исследования проведены в соответствии с этическими требованиями к работе с экспериментальными животными («Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1987 г.), Федеральный закон «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г., Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 г. №199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами» (введен в действие 01.07.2016 г.) и одобрены Биоэтической комиссией.

По сравнению с известным решением применение производного аминохромена общей формулы (1) позволяет снизить острую токсичность, увеличить силу противоопухолевого эффекта при формировании сингенной модели опухоли у мышей, а также повысить антиметастатическую активность при немелкоклеточном раке легкого.

Примечание: * - различия статистически достоверны (р=0,023, одномерный дисперсионный анализ, критерий t Стьюдента).

Примечание: * - различия при сравнении с контролем с LLC статистически достоверны при р<0,05; ^а - различия при сравнении с контролем и циклофосфамидом (прототипом) статистически достоверны при р<0,05 (одномерный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса)

Примечание: * - различия при сравнении с контролем с опухолью статистически достоверны при р<0,05; ^а - различия при сравнении с контролем и циклофосфамидом (прототипом) статистически достоверны при р<0,05 (одномерный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса)