Результат интеллектуальной деятельности: Анальгезирующее и противовирусное средство на основе 2,2'-[(6-метилпиримидин-2,4-диил)бис(3-(4-нитрофенил)-1H-1,2,4-триазол-1,5-диил)]дипропановой кислоты

Изобретение относится к медицине и фармации и касается нового анальгезирующего и противовирусного средства на основе 2,2'-[(6-метилпиримидин-2,4-диил)бис(3-(4-нитрофенил)-1H-1,2,4-триазол-1,5-диил)]дипропановой кислоты формулы I.

Замещенные соединения 2,2'-[(6-метилпиримидин-2,4-диил)бис(3-фенил)-1H-1,2,4-триазол-1,5-диил)]дипропановой кислоты, их строение, физико-химические свойства и способ получения предложены [заявка на изобретение РФ №2016151576 от 26.12.2016]. Однако не изучена была токсичность этих соединений, анальгезирующая и противовирусная активности не были известны, что не позволяло говорить о лекарственных средствах на их основе.

Наиболее близким по структуре и фармакологическим свойствам к заявляемому средству является обладающий анальгезирующей и противовоспалительной активностью ибупрофен (II)

К недостаткам данного соединения можно отнести более высокую токсичность, чем у предлагаемого соединения, а также отсутствие каких-либо данных по его противовирусной активности.

Задачей предполагаемого изобретения является расширение арсенала анальгезирующих и противовирусных средств, поиск нового на основе замещенной 2,2'-[(6-метилпиримидин-2,4-диил)бис(3-фенил-1H-1,2,4-триазол-1,5-диил)]дипропановой кислоты средства, имеющего низкую токсичность, обладающего анальгезирующей и противовирусной активностью, превышающих указанные активности применяющихся в медицинской практике раздельно препаратов.

Указанная задача достигается созданием анальгезирующего и противовирусного средства на основе 2,2'-[(6-метилпиримидин-2,4-диил)бис(3-(4-нитрофенил)-1Н-1,2,4-триазол-1,5-диил)]дипропановой кислоты.

Изобретение иллюстрируется способом получения и примерами исследования фармакологических свойств.

Замещенные соединения 2,2'-[(6-метилпиримидин-2,4-диил)бис(3-фенил-1H-1,2,4-триазол-1,5-диил)]дипропановой кислоты получали путем взаимодействия 2,5-замещенного-4-гидрокси-6H-1,3-оксазин-6-она с 2,4-дигидразинил-6-метилпиримидином в мольном соотношении 2:1 в среде безводного полярного органического растворителя (метанол), причем смесь перемешивали в течение 45-50 часов при комнатной температуре, полученный осадок отфильтровывали и промывали небольшими порциями этилацетата.

Способ получения 2,2'-[(6-метилпиримидин-2,4-диил)бис(3-(4-нитрофенил)-1Н-1,2,4-триазол-1,5-диил)]дипропановой кислоты (I) осуществлен в лабораторных условиях на стандартном товарном сырье.

В плоскодонную колбу емкостью 100 мл загружают 5,0 г (0,02 моль) 4-гидрокси-5-метил-2-(4-нитрофенил)-6H-1,3-оксазин-6-она и 25 мл абсолютного метанола в качестве среды, а затем к суспензии добавляют 1,54 г (0,01 моль) 2,4-дигидразинил-6-метилпиримидина.

Данные элементного анализа, выход продукта реакции, температура плавления и величина R_f приведены в табл. 1, спектральные характеристики - в табл. 2.

Пример 1. Определение острой токсичности.

Острую токсичность синтезируемого соединения определяли на нелинейных белых мышах самцах массой тела 18-20 г. Животных распределяли на равные по численности и массе тела группы, по 10 животных в каждой. Суспензии соединения в воде, стабилизированные твином-80, вводили однократно внутрибрюшинно в интервале доз 50 мг/кг - 2000 мг/кг. Выживаемость животных определяли, наблюдая через 24 часа и через 48 часов от момента введения исследуемого соединения. Наблюдение за животными осуществляли в течение 72 часов. Регистрировали развитие основных симптомов и время гибели животных.

Расчет среднесмертельной дозы (LD₅₀) проводили с помощью экспресс-метода В.Б. Прозоровского [Прозоровский В.Б. Статистическая обработка результатов фармакологических исследований // Псохофармакол. биол. наркол. - 2007. №7, №3-4 - С. 2090-2120] и пробит-анализа по методу Миллера-Тейнтера [М.Л. Беленький. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта (2-е изд, перераб. и доп.). - Л.,: Гос. изд-во мед. лит., 1963. С. 412]. Токсичность заявляемого средства составляет 2000 мг/кг (табл 3). Согласно классификации токсичности препаратов, соединение I относятся к классу малотоксичных веществ [Измеров И.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов. - М.: Медицина, 1977. С. 196-197]. Оно более чем в 8 раз менее токсично метамизола натрия - препарата сравнения по анальгезирующей активности (табл. 3). Пример 2. Определение анальгезирующей активности. Для экспериментальной оценки анальгезирующей активности использовали модель генерации уксуснокислых «корчей» у мышей-самцов. Судороги у животных вызывали при помощи внутрибрюшинного введения 3% раствора уксусной кислоты. Эксперимент проводили на белых нелинейных мышах-самцах массой тела 15-22 г. Для эксперимента использовали 3 группы животных по 7 особей в каждой. Суспензии 2,2'-[(6-метилпиримидин-2,4-диил)бис(3-(4-нитрофенил)-1H-1,2,4-триазол-1,5-диил)]дипропановой кислоты (I) в смеси ДМСО с водой (1:5) (стабилизатор твин-80) вводили однократно, внутрибрюшинно в дозах 1/10 LD50 за 40 минут до внутрибрюшинного введения 3% раствора уксусной кислоты. Животным контрольной группы вводили смесь ДМСО: вода (1:5). В качестве препарата сравнения использовали метамизол натрия в дозе 100 мг/мл. Регистрировали время начала судорог и их количество в течение 20 минут [Харкевич Д.А. Фармакология Учебник. - 10-е изд. - М: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - С. 628-640]. Анальгетическая активность заявляемого средства выше препарата сравнения метамизола натрия, исследуемая субстанция в 8 раз менее токсична (табл 3).

Пример 3. Изучение токсичности в отношении линии нормальных эпителиальных клеток почек собак (MDCK, Sigma-Aldrich, USI).

Клетки MDCK сеяли в 96-луночные планшеты и культивировали при 36°С на минимальной поддерживающей среде (MEM) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере 5% СO₂ (в газопроточном инкубаторе Sanyo-175) до состояния монослоя. Из исследуемого соединения (I) готовили маточный раствор концентрации 10 мг/мл в диметилсульфоксиде, после чего готовили серию трехкратных разведений препаратов в среде MEM от 300 до 3 μg/ml. Растворенные препараты вносили в лунки планшетов и инкубировали 2 суток при 36°С. По истечении этого срока клетки промывали 2 раза по 5 минут фосфатно-солевым буфером, и количество живых клеток оценивали при помощи микротетразолиевого теста (МТТ). С этой целью в лунки планшетов добавляли по 100 мкл раствора (5 мг/мл) 3-(4,5-диметилтиазолил-2) 2,5-дифенилтетразолия бромида (ICN Biochemicals Inc., Aurora, Ohio) на физиологическом растворе. Клетки инкубировали при 36°С в атмосфере 5% СO₂ в течение 2 часов и промывали 5 минут фосфатно-солевым буфером. Осадок растворяли в 100 мкл на лунку ДМСО, после чего оптическую плотность в лунках планшетов измеряли на многофункциональном ридере Victor 1420 (Perkin Elmer, Finland) при длине волны 535 нм. По результатам теста для каждого продукта определяли концентрацию соединения, вызывающую гибель 50% клеток в культуре - 50% цитотоксическую дозу (СС₅₀). Для соединения I она составила 2551 мкг/мл, что лучше чем у препарата сравнения рибавирина - 2130 мкг/мл.

Пример 4. Определение противовирусной активности.

Определение противовирусной активности соединения (I) проводили на клетках MDCK в 96-луночных планшетах для клеточных культур. Соединение растворяли в поддерживающей среде для клеток, вносили в лунки панелей с клеточным монослоем и инкубировали в течение 1 часа при 36°С в атмосфере 5% СO₂.

Из вируссодержащей жидкости (штамм A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) готовили серию десятикратных разведении от 10^-1 до 10^-7, добавляли в лунки с препаратами и инкубировали при 36°С в течение 48 часов в атмосфере 5% СО₂. По окончании срока инкубации 100 мкл культуральной жидкости переносили в отдельные планшеты с круглым дном и смешивали с равным объемом 1% куриных эритроцитов. Учет результатов проводили через 60 минут инкубации при 20°С. За титр вируса принимали величину, обратную наибольшему разведению исходного вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации в лунке, и выражали титр в количестве 50% инфекционных доз (ID₅₀). Вирусингибирующее действие исследуемого соединения оценивали по снижению титра вируса в опыте по сравнению с контролем. На основании полученных данных рассчитывали концентрацию препарата, снижающую титр вируса вдвое - 50% ингибирующую концентрацию IC₅₀, для соединения (I) она составила - 9,3 мкг/мл, что лучше чем у препарата сравнения рибавирина - 21 мкг/мл. Химиотерапевтический индекс, или индекс селективности (SI), представляющий собой отношение СС₅₀ к IC₅₀, для соединения (I) составил 32, что сопоставимо с препаратом сравнения рибавирином - 67.

Таким образом, заявляемое средство является малотоксичным, обладает значительно большей анальгезирующей активностью и низкой токсичностью по сравнению с широко известным и применяемым в медицине препаратом сравнения метамизол натрия. Кроме того средство на основе 2,2'-[(6-метилпиримидин-2,4-диил)бис(3-(4-нитрофенил)-1Н-1,2,4-триазол-1,5-диил)]дипропановой кислоты (I) обладает противовирусной активностью.