Результат интеллектуальной деятельности: Способ включения в группу риска по развитию сахарного диабета типа 2 у больных хроническим пародонтитом

Изобретение относится к области медицины, в частности, стоматологии, медицинской микробиологии и эндокринологии, и может использоваться для прогноза развития сахарного диабета типа 2 у больных хроническим пародонтитом.

Известно, что течение сахарного диабета ассоциировано с прогрессирующим развитием хронического пародонтита, приводящего к полной потере зубов и угнетению процессов регенерации тканей [1, 2, 5]. Причинами такой ассоциации считают сопутствующие сахарному диабету метаболические и иммунологические сдвиги (изменения), включающие оксидативный стресс, изменение профиля цитокинной продукции в иммунной системе, модуляцию рецепторного аппарата клеток, нарушение обмена сфинголипидов и т.д. [8, 9, 11]. Все это в сочетании с ростом содержания глюкозы в ротовой жидкости создают условия для изменения микробиоты полости рта, появления в ее составе определенного набора пародонтопатогенных видов микроорганизмов, называемого "красным комплексом", и, как следствие - развития пародонтита [1, 3, 14]. Существует также точка зрения, что «красный комплекс» сам по себе может формировать связь с процессом ожирения вплоть до стадии развития сахарного диабета типа 2 [10, 13], индуцируя продукцию провоспалительных цитокинов, которые, в свою очередь, повышают резистентность клеток к инсулину [12]. В соответствии с последней гипотезой не только сахарный диабет способствует развитию хронического пародонтита, но и последний способен создавать предрасположенность к формированию диабетического статуса, хотя условия для этого практически не изучены [10].

Проблема прогнозирования и условий развития сахарного диабета типа 2 рассматривается и на патентном уровне. Так, в отечественной базе есть патент на способ диагностики предрасположенности к сахарному диабету типа 2 по сканированному изображению ладоней и пальцев рук [4]. Этот метод довольно прост в исполнении, но носит эмпирический характер и практически не имеет доказательной научной базы по его связи с предполагаемыми генетическими механизмами предрасположенности к сахарному диабету типа 2.

Один из зарубежных патентов предлагает, например, проводить мониторинг показателей для выявления двух аспектов патогенеза сахарного диабета - чувствительности клеток к инсулину и сохранения функциональной способности β-клеток поджелудочной железы, что можно использовать, по мнению авторов, в диагностике, прогнозировании, оценке риска заболеваний и разработке лекарственных средств [7]. Метод имеет доказательную базу, но довольно сложен по способу осуществления и оценке результатов, поскольку в его основе лежат изотопные технологии. Для осуществления этого способа нужны веские основания по включению пациентов в группу риска, что как раз и являются предметом предлагаемого изобретения.

Более близким изобретением по раскрытию возможного патогенетического механизма сахарного диабета типа 2 служит патент по определению микроРНК в сыворотке или плазме крови как маркера заболевания [6]. Этот метод пока мало доступен широкой клинической практике и более пригоден для диагностики сахарного диабета типа 2, чем для прогнозирования его развития.

В патентной базе не установлен прямой аналог предлагаемому изобретению, поскольку большинство исследователей не рассматривают хронический пародонтит в качестве маркера прогнозирования сахарного диабета типа 2, а подходят к его оценке только как к следствию названной эндокринной патологии.

В связи с этим задачей изобретения является разработка способа выявления группы риска развития сахарного диабета типа 2 среди больных хроническим пародонтитом.

Технический результат заключается в определении таких признаков, ассоциированных с хроническим пародонтитом, которые были бы патогенетически связаны с чувствительностью клеток к инсулину и позволили бы прогнозировать развитие сахарного диабета типа 2.

Технический результат достигается за счет того, что способ включения в группу риска по развитию сахарного диабета типа 2 больных хроническим пародонтитом, подтвержденным микробиологически или методом ПЦР, включающий проведение метагеномного анализа не менее 4-х образцов микробной биопленки зубодесневой борозды, и при наличии в составе образцов более 9% бактерий семейства Porphyrmonadaceae в сочетании с отсутствием бактерий семейства Sphingobacteriaceae больного хроническим пародонтитом относят к группе риска по развитию сахарного диабета типа 2.

Прогностическим маркером сахарного диабета типа 2 служит наличие у пациента хронического пародонтита при высоком содержании в биопленке зубодесневой борозды бактерий семейства Porphyrmonadaceae и отсутствии в составе микробной биопленки бактерий семейства Sphingobacteriaceae (продуцентов сфинголипидов - протекторов инсулинорезистентности), определяемых методом метагеномного анализа.

В процессе разработки способа под наблюдением находились 22 человека (11 мужчин и 11 женщин в возрасте 47-63 лет), у которых сахарный диабет типа 2 сочетался с явлениями хронического пародонтита, подтвержденного детальной характеристикой стоматологического и микробиологического статуса. Группой сопоставления служили 30 пациентов (13 мужчин и 17 женщин в возрасте 42-60 лет), у которых отмечался хронический пародонтит, не отягченный сахарным диабетом. Контрольная группа для генетических исследований включала 22 клинически здоровых человека (9 мужчин и 13 женщин в возрасте 25-28 лет) без признаков поражения десен.

У всех пациентов и здоровых людей выполнялся метагеномный анализ микрофлоры содержимого десневого кармана и ПЦР-диагностика для микробиологического подтверждения диагноза хронического пародонтита.

По данным ПЦР-диагностики частота встречаемости пародонтопатогенных бактерий Porphyromonas gingivalis и Tannerella forsythia, относящихся к семейству Porphyromonadaceae, и Fusobacterium nucleatum/periodonticum из семейства Fusobacteriaceae у больных хроническим пародонтитом в сочетании с сахарным диабетом типа 2 составляла, соответственно, 82% и 74%, а при хроническом пародонтите без эндокринной патологии - 43% и 32%, то есть при сочетании заболеваний была достоверно выше (р<0,05 по критерию χ²). У здоровых людей частота регистрации бактерий этих семейств была, соответственно, 27% и 22%.

По результатам метагеномного секвенирования, позволявшем определить долю каждого семейства в составе микробиоты зубодесневой борозды, было установлено, что статистически значимым было различие между группами по доле в составе микрофлоры представителей семейств Porphyrmonadaceae и Sphingobacteriaceae. При этом у больных хроническим пародонтитом в сочетании с сахарным диабетом типа 2, в отличие от остальных групп, доля бактерий семейства Porphyrmonadaceae была достоверно выше при величине 95% доверительного интервала >9% и прогностическом значении теста, выраженном в величине AUROC, равном 0,813. Вместе с тем, у больных хроническим пародонтитом в сочетании с сахарным диабетом типа 2 полностью отсутствовали представители семейства Sphingobacteriaceae. У здоровых людей и больных хроническим пародонтитом без сопутствующей патологии 95% доверительный интервал для доли сфингобактерий в составе микрофлоры зубодесневой борозды всегда был выше 1-2% при AUROC = 0,842.

Способ иллюстрируется фиг. 1 и 2:

1 - 95% доверительные интервалы и ROC-кривая прогностического значения для доли бактерий семейства Porphyrmonadaceae в составе микробиоты зубодесневой борозды в группах сравнения

2 - 95% доверительные интервалы и ROC-кривая прогностического значения для доли бактерий семейства Sphingobacteriaceae в составе микробиоты зубодесневой борозды в группах сравнения

Способ осуществляется следующим образом.

Взятие материала у больного хроническим пародонтитом проводится из 4-х участков в области зубодесневой борозды (с вестибулярной, лингвальной и двух проксимальных сторон коронки зуба) с помощью стерильных бумажных эндодонтических штифтов (№30), которые помещают в пробирку с 0,2 мл физиологического раствора.

Тотальную ДНК из образцов зубного налета выделяют с использованием QIAamp DNA Investigator Kit (Qiagen) согласно инструкциям производителя. Библиотеку ампликонов для 16S метагеномного секвенирования готовят с использованием праймеров 341F (5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’) и 801R (5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAАТСС-3’) согласно протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Part #15044223 Rev. В). Секвенирование библиотек и анализ полученных данных осуществляют с использованием генетического анализатора, например, MiSeq (Illumina) и MiSeq Reagent Kit v2 согласно инструкциям производителя. Визуализацию результатов проводят с использованием программы MEGAN5 (http://ab.inf.unituebingen.de/ software/megan5/).

При доле в образце бактерий семейства Porphyrmonadaceae более 9% и отсутствии в образце бактерий семейства Sphingobacteriaceae больного хроническим пародонтитом относят к группе риска развития сахарного диабета типа 2 и осуществляют мониторинг по контролю за развитием данного заболевания.

Клинический пример 1.

Больная А., 55 лет, рост 157, вес 95 кг, индекс массы тела 38,6 кг/м². На момент обследования находилась под наблюдением стоматолога с диагнозом: Хронический пародонтит средней степени тяжести в стадии обострения.

Сопутствующий диагноз: Сахарный диабет типа 2 (целевой уровень гликированного гемоглобина HbA1c<7,0%). Диабетическая полинейропатия, дистальная, симметричная. Диабетическая ангиопатия нижних конечностей. Невралгия 2-ой и 3-й ветвей тройничного нерва справа. Ишемическая болезнь сердца. Артериальная гипертония 2 ст., риск сердечно-сосудистых осложнений 4 степени. Ожирение 2 ст., экзогенно-конституциональное. Хронический панкреатит, вне обострения.

Сахарным диабетом типа 2 больная страдает с 2012 года, принимает пероральные сахаропонижающие препараты.

Лабораторные исследования (в скобках указана физиологическая норма). Суточная глюкозурия 7,9 ммоль (<2.7). Эритроцитарный индекс MCV 76 мкм³ (80-100). Лейкоциты крови - 13,9*10⁹/л (4-9). СОЭ - 49 мм/час. (1-15). HbA1c - 8,7% (4-6,2). АЛТ крови - 39,1 ЕД/л (5-34). Триглицериды крови - 2,03 ммоль/л (0,2-1,7). Холестерин крови - 6,57 ммоль/л (1,4-5,2). Глюкоза крови - 9,17 ммоль/л (4,1-6,4).

Стоматологический статус. Гигиенические индексы: O-HIS - 1,1; РНР - 1,1. Пародонтальные индексы: РМА - 54,6%; PI - 3,9; PDI - 3,4.

Результаты ПЦР-диагностики: выявлена маркерная ДНК пародонтопатогенных бактерий: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia.

Результаты метагеномного анализа: доля бактерий семейства Porphyrmonadaceae в составе микрофлоры зубодесневой борозды - 32%, бактерии семейства Sphingobacteriaceae не обнаружены.

Результаты повторного осмотра через 1,5 года.

Стоматологический статус. Гигиенические индексы: O-HIS - 1,0; РНР - 1,0. Пародонтальные индексы: РМА - 61,4%; PI - 4,2; PDI - 4,0.

Лабораторные исследования. Суточная глюкозурия 7,9 ммоль (<2.7). Эритроцитарный индекс MCV 74 мкм³ (80-100). Лейкоциты крови - 15,6*10⁹/л (4-9). СОЭ - 36 мм/час.(1-15). HbA1c - 10,1% (4-6,2). АЛТ крови - 28,3 ЕД/л (5-34). Триглицериды крови - 3,21 ммоль/л (0,2-1,7). Холестерин крови - 6,94 ммоль/л (1,4-5,2). Глюкоза крови - 10,2 ммоль/л (4,1-6,4).

Результаты ПЦР-диагностики: выявлена маркерная ДНК пародонтопатогенных бактерий: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia (без изменений).

Результаты метагеномного анализа: доля бактерий семейства Porphyrmonadaceae в составе микрофлоры зубодесневой борозды - 29%, бактерии семейства Sphingobacteriaceae не обнаружены (без существенных изменений.

Заключение. У больной А. отсутствуют существенные изменения со стороны стоматологического статуса, в динамике сопутствующего заболевания, результатах ПЦР-диагностики и метагеномного анализа. Результаты метагеномного анализа характерны для ассоциации хронического пародонтита и сахарного диабета типа 2.

Клинический пример 2.

Больной Г., 60 лет, рост 180, вес 74 кг, индекс массы тела 25,6 кг/м². На момент обследования находился под наблюдением стоматолога с диагнозом: Хронический пародонтит средней степени тяжести в стадии обострения.

Сопутствующий диагноз: Вегетососудистая дистония. Ишемическая болезнь сердца. Артериальная гипертония 2 ст., риск сердечно-сосудистых осложнений 4 степени. Полипоз кишечника.

Лабораторные исследования. Суточная глюкозурия 1,8 ммоль (<2.7). Эритроцитарный индекс MCV 82 мкм³ (80-100). Лейкоциты крови - 11,4*10⁹/л (4-9). СОЭ - 23 мм/час. (1-15). HbA1c - 5,7% (4-6,2). АЛТ крови - 31,5 ЕД/л (5-34). Триглицериды крови - 1,6 ммоль/л (0,2-1,7). Холестерин крови - 7,12 ммоль/л (1,4-5,2). Глюкоза крови - 4,9 ммоль/л (4,1-6,4).

Стоматологический статус. Гигиенические индексы: O-HIS - 0,7; РНР - 0,7. Пародонтальные индексы: РМА - 44,8%; PI - 3,6; PDI - 3,1.

Результаты ПЦР-диагностики: выявлена маркерная ДНК парод онтопатогенных бактерий: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola.

Результаты метагеномного анализа. Доля бактерий семейства Porphyrmonadaceae в составе микрофлоры зубодесневой борозды - 8%, бактерий семейства Sphingobacteriaceae - 12%).

Результаты повторного осмотра через 1,5 года.

Стоматологический статус. Гигиенические индексы: O-HIS - 0,8; РНР - 0,8. Пародонтальные индексы: РМА - 58,3%; PI - 4,0; PDI - 3,6.

Лабораторные исследования. Суточная глюкозурия 2,0 ммоль (<2.7). Эритроцитарный индекс MCV 84 мкм³ (80-100). Лейкоциты крови - 10,2*10⁹/л (4-9). СОЭ - 22 мм/час. (1-15). HbA1c - 4,9% (4-6,2). АЛТ крови - 34 ЕД/л (5-34). Триглицериды крови - 3,41 ммоль/л (0,2-1,7). Холестерин крови - 7,02 ммоль/л (1,4-5,2). Глюкоза крови - 5,3 ммоль/л (4,1-6,4).

Результаты ПЦР-диагностики: выявлена маркерная ДНК пародонтопатогенных бактерий: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola.

Результаты метагеномного анализа. Доля бактерий семейства Porphyrmonadaceae в составе микрофлоры зубодесневой борозды - 11%, бактерии семейства Sphingobacteriaceae - 9%.

Заключение. У больного К. несколько возросла величина пародонтальных индексов, мало изменились результаты лабораторных исследований, не изменились данные ПЦР-диагностики, метагеномного анализа. Метагеномный анализ характерен для хронического пародонтита без угрозы развития сахарного диабета типа 2.

Клинический пример 3.

Больная О., 63 лет, рост 165 см, вес 110 кг, индекс массы тела 40,4 кг/м2. На момент обследования находилась под наблюдением стоматолога с диагнозом: Хронический пародонтит средней степени тяжести в стадии обострения.

Сопутствующий диагноз: Бронхиальная астма средней степени тяжести вне обострения. Хронический панкреатит. Артериальная гипертония 3 ст., риск сердечно-сосудистых осложнений 4. Ожирение 2 ст. экзогенно-конституциональное.

Лабораторные исследования. Суточная глюкозурия 14 ммоль (<2.7). Эритроцитарный индекс MCV 79 мкм³ (80-100). Лейкоциты крови - 9,9*10⁹/л (4-9). СОЭ - 25 мм/час. (1-15). HbA1c - 7,5% (4-6,2). АЛТ крови - 55,2 ЕД/л (5-34). Триглицериды крови - 2,53 ммоль/л (0,2-1,7). Холестерин крови - 6,5 ммоль/л (1,4-5,2). Глюкоза крови - 9,2 ммоль/л (4,1-6,4).

Консультация эндокринолога. Диагноз: сахарный диабет типа 2, диабетическая ретинопатия.

Стоматологический статус. Гигиенические индексы: OHI-S - 1,2; РНР - 1,1. Пародонтальные индексы: РМА - 47,6%; PI - 3,8; PDI - 3,2.

Результаты ПЦР-диагностики: выявлена маркерная ДНК пародонтопатогенных бактерий: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola.

Результаты метагеномного анализа. Доля бактерий семейства Porphyrmonadaceae в составе микрофлоры зубодесневой борозды - 21%, бактерий семейства Sphingobacteriaceae не обнаружены.

Результаты повторного осмотра через 1,5 года.

Стоматологический статус. Гигиенические индексы: O-HIS - 1,2; РНР - 1,2. Пародонтальные индексы: РМА - 59,3%; PI - 3,9; PDI - 3,5.

Лабораторные исследования (в скобках указана физиологическая норма). Суточная глюкозурия 2,0 ммоль (<2.7). Эритроцитарный индекс MCV 84 мкм³ (80-100). Лейкоциты крови - 10,2*10⁹/л (4-9). СОЭ - 22 мм/час. (1-15). HbA1c - 4,9% (4-6,2). АЛТ крови - 34 ЕД/л (5-34). Триглицериды крови - 3,41 ммоль/л (0,2-1,7). Холестерин крови - 7,02 ммоль/л (1,4-5,2). Глюкоза крови - 5,3 ммоль/л (4,1-6,4).

Результаты ПЦР-диагностики: выявлена маркерная ДНК пародонтопатогенных бактерий: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola.

Результаты метагеномного анализа. Доля бактерий семейства Porphyrmonadaceae в составе микрофлоры зубодесневой борозды - 36%), бактерии семейства Sphingobacteriaceae не обнаружены.

Заключение. У больной О. примерно через 1 год после первичного обследования появились жалобы, заставившие ее обратиться к эндокринологу. Клинические данные, результаты инструментальных и лабораторных исследований позволили поставить ей диагноз сахарного диабета 2-го типа. Результаты первичного метагеномного анализа, выполненного в связи с наличием у пациентки хронического пародонтита, по своему характеру еще год назад указывали на возможность развития сахарного диабета типа 2.

Литература:

1. Барер Г.М., Царев В.Н., Николаева Е.Н., Рамин С. Особенности микробной колонизации десны при сочетанной патологии пародонта и сахарного диабета 1 типа. // Cathedra. Стоматологическое образование. 2004. Т. 4. №11. С. 26-30.

2. Богомолов М.В. Пародонтит как неспецифическое осложнение сахарного диабета. Подходы к профилактике // Российский медицинский журнал. 2011. №13. С. 828-832.

3. Николаева Е.Н., Царев В.Н., Ипполитов Е.В. Пародонтопатогенные бактерии - индикаторы риска возникновения и развития пародонтита (часть 2) // Стоматология для всех. 2011. №4. С. 4-7.

4. Якушева М.Ю., Сарапульцев П.А., Трельская Н.Ю., Казанцев B.C. Способ диагностики предрасположенности к сахарному диабету второго типа / Патентообладатели - Якушева М.Ю., Сарапульцев П.А., Трельская Н.Ю., Казанцев B.C. // Патент РФ 2373835, опубл. 27.11.2009.

5. Янушевич О.О., Царев В.Н., Парунова С.Н. Влияние микрофлоры полости рта на регенерацию тканей пародонта у больных сахарным диабетом. Ортодонтия. 2004. №3. С. 15-19.

6. Chenbo J.I., Xianwei С, Xirong G. et al. Serum or plasma miRNA marker related to diabetes mellitus type 2 and application thereof / Applicants - Nanjing maternity, Child Health Care Hospital // Patent CN 20161644122, publ. 08.08.2016.

7. Hellerstein M.K. Monitoring two dimensions of diabetes pathogenesis separately or concurrently (insulin sensitivity and beta-cell sufficiency): uses in diagnosis, prognosis, assessment of disease risk, and drug development / Applicant - the regents of the Univercity of California // Patent TW 20060120699, publ. 06.09.2006.

8. Iqbal J., Walsh M.T., Hammad S.M., Hussain M.M. Sphingolipids and lipoproteins in health and metabolic disorders // Trends Endocrinol Metab. 2017. Vol. 28, N7. P. 506-518.

9. Lalla E., Papapanou P.N. Diabetes mellitus and periodontitis: a tale of two common interrelated diseases // Nat Rev Endocrinol. 2011. Vol. 7, N 12. P. 738-748.

10. Matsushita K., Hamaguchi M., Hashimoto M., Yamazaki M., Yamazaki Т., Asai K., Yamori M., Bessho K., Toda H., Hasegawa G., Nakamura N, Fukui M. The novel association between red complex of oral microbe and body mass index in healthy Japanese: a population based cross-sectional study // J Clin Biochem Nutr. 2015. Vol. 57, N 2. P. 135-139.

11. Patil V.S., Patil V.P., Gokhale N., Acharva A., Kangokar P. Chronic periodontitis in type 2 diabetes mellitus: oxidative stress as a common factor in periodontal tissue injury // J Clin Diagn Res. 2016. Vol. 10, N 4. P. 12-16.

12. Tilg H., Moschen A.R. Insulin resistance, inflammation, and nonalcoholic fatty liver disease // Trends Endocrinol Metab. 2008. Vol. 19, N 10. P. 371-379.

13. Wang G.P. Defining functional signatures of dysbiosis in periodontitis progression // Genome Med. 2015. Vol. 7, N 1. P. 40-42.

14. Zhou M., Rong R., Munro D., Zhu C, Gao X., Zhang Q., Dong Q. Investigation of the effect of type 2 diabetes mellitus on subgingival plaque microbiota by high-throughput 16S rDNA pyrosequencing // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 4. e61516.