Способ получения вещества, обладающего диуретической активностью

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к способу получения фармацевтической субстанции растительного происхождения, обладающей диуретической активностью.

В настоящее время на фармацевтическом рынке Российской Федерации значительное количество лекарственных препаратов растительного происхождения, обладающих диуретической активностью, получают из листьев толокнянки обыкновенной [Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., сем. Вересковые - Ericaceae] и листьев брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea L., сем. Брусничные - Vacciniaceae) (1). В основном эти лекарственные препараты представлены фасованным измельченным лекарственным растительным сырьем (пачки картонные с внутренним пакетом, фильтр-пакеты и др.).

Представляется актуальным выделение веществ, обусловливающих диуретическую активность лекарственных средств растительного происхождения, для получения фармацевтических субстанций с более высокой активностью.

Считается, что диуретическое действие толокнянки обусловлено содержащимся в ней арбутином (2).

Известен способ получения стандартного образца арбутина из сухого экстракта толокнянки (3) путем двухкратной обработки водного раствора экстракта толокнянки н-бутанолом, сгущения экстракта, смешивания кубового остатка с оксидом алюминия и хроматографирования на оксиде алюминия в соотношении исходного экстракта и сорбента 1:4 при элюировании метанолом. Элюат собирают в десятикратном количестве по объему по сравнению с массой сорбента. Для кристаллизации арбутина используют смесь хлороформ-спирт 1,2:1. Для дополнительной очистки использовали активированный уголь марки ОУ-А в количестве 0,1-0,15 от массы технического арбутина к его метанольному раствору, который после добавления угля подвергают кипячению и охлаждению.

Данный способ взят за прототип изобретения.

Недостатками данного способа являются:

1) выход технического арбутина составляет 65,4%;

2) использование опасных растворителей - метанола, обладающего выраженными токсическим свойствами и хранение которого осуществляется в специально оборудованных помещениях.

В исследования на крысах показано, что арбутин вызывает достоверное увеличение диуреза с четвертого по шестой дни введения при внутрижелудочном введении крысам в дозе 5 мг/кг. При повышении дозы вещества в три раза суточное увеличение мочи увеличивалось уже с первого дня введения (4, 5).

Целью изобретения является выделение из толокнянки обыкновенной вещества, обладающего диуретической активностью.

Заявляемый способ получения вещества с диуретической активностью реализуется следующим образом: листья толокнянки обыкновенной экстрагируют 70% этиловым спиртом, осуществляя вначале две экстракции при комнатной температуре в течение 24 ч, а затем при нагревании на кипящей водяной бане в течение 30 мин; объединенное извлечение упаривают под вакуумом, смешивают с силикагелем в соотношении исходной массы сырья и сорбента 3:1 и высушивают на воздухе; высушенный порошок наносят на слой силикагеля, сформированный в виде взвеси в хлороформе и подвергают хроматографическому разделению с использованием смесей хлороформа и этилового спирта в градиентном режиме с последующим выделением из фракций, полученных при элюировании смесью растворителей хлороформ-спирт этиловый (75:25 и 70:30), 1,3,6-тригаллоилглюкозы - вещества с диуретической активностью.

Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ-этанол (9:1), хлороформ-этанол-вода (26:16:3), а также н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2). Вещество, выделенное из фракций, полученных при элюировании смесью растворителей хлороформ-спирт этиловый 95% (75:25 и 70:30), было идентифицировано с помощью комплекса физико-химических методов (тонкослойная хроматография, УФ-спектроскопия, ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия) как 1,3,6-тригаллоилглюкоза. Выход этого соединения составил 3,5% от массы воздушно-сухого сырья (или 80,0% от содержания 1,3,6-тригаллоилглюкозы в сырье).

Было проведено исследование влияния 1,3,6-тригаллоилглюкозы на выделительную функцию почек у крыс в сравнении с арбутином и отваром из листьев толокнянки (см. табл.1 в Приложении 1). Изучение диуретической активности проводили на белых беспородных крысах обоего пола массой 180-220 г. Животные содержались в виварии на обычном рационе при свободном доступе к воде. За день до опыта крысы получали внутрижелудочно водную нагрузку в объеме 3% от массы тела. В день эксперимента животным контрольной группы вводилась водная нагрузка; опытным группам при помощи внутрижелудочного зонда вводился лекарственный препарат в идентичном объеме. Отвар из листьев толокнянки вводили в дозе 100 мг/кг, водные растворы арбутина и 1,3,6-тригаллоилглюкозы - в дозе 10 мг вещества на 1 кг массы животных. В качестве препарата сравнения использовали гипотиазид (20 мг/кг). В исследовании было 5 групп животных (по 10 крыс в каждой).

Животные помещались в обменные клетки на 24 часа. По истечении 4 и 24 ч собранная моча анализировалась и подвергалась исследованию (6). Определяли экскрецию воды, регистрировали концентрацию натрия и калия, креатинина.

В результате исследования диуретической и салуретической активности получено, что отвар толокнянки в дозе 100 мкл/кг и арбутин в дозе 10 мг/кг при однократном внутрижелудочном введении за 4 и 24 ч не вызывали достоверных изменений показателей экскреторной функции почек (см. табл.1 в Приложении 1). 1,3,6-тригаллоилглюкоза при однократном внутрижелудочном введении в дозе 10 мг/кг в 4-часовом эксперименте способствовала достоверному росту диуреза (на 34% по сравнению с контрольной группой) и натрийуреза (на 37%) преимущественно за счет канальцевого компонента, за 24 ч она значительно увеличивала почечную экскрецию воды (на 75%), натрия (на 46%), калия (на 36%) и креатинина (на 38%), как за счет увеличения клубочковой фильтрации, так и за счет уменьшения канальцевой реабсорбции (см. табл.1 в Приложении 1). Полученные результаты суточного эксперимента сопоставимы с данными по влиянию на экскреторную функцию почек для гипотиазида.

Заявляемый способ иллюстрируется следующим примером.

100 г воздушно-сухих листьев толокнянки обыкновенной экстрагировали 70% этиловым спиртом, осуществляя вначале две экстракции при комнатной температуре в течение 24 ч, а затем при нагревании на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Объединенное водно-спиртовое извлечение упаривали под вакуумом до объема 50 мл, смешивали с 30 г силикагеля L 40/100 и высушивали. Высушенный порошок (сухой экстракт + силикагель) наносили на слой силикагеля (диаметр - 8 см, высота - 5 см), сформированный в виде взвеси в хлороформе. Хроматографическую колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ-этанол в различных соотношениях (99:1; 98:2; 97:3; 95:5; 93:7; 90:10; 85:15; 80:20; 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70). Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ-этанол (9:1), хлороформ-этанол-вода (26:16:3), а также н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2).

Из фракций (96-99), полученных при элюировании смесью растворителей хлороформ-спирт этиловый 95% (75:25 и 70:30), получали технический целевой продукт: светло-желтое аморфное вещество состава С₂₇Н₂₄О₁₈ с т.пл. 165-167°C (водный спирт). Масс-спектр (ESI-MS, 180°C, m/z): М⁺ 659 [636+Na]⁺. УФ-спектр (λ_max EtOH, нм): 220, 280 нм. ¹Н-ЯМР-спектр (300 МГц, ДМСО-d₆, δ, м.д., J/Гц): 8,80-9.35 (м, 9Н девяти фенольных ОН-групп трех молекул галловой кислоты), 6.99 (с, 2Н галловой кислоты при С-2 и С-6), 6.85 (с, 2Н галловой кислоты при С-2¹ и С-6¹), 6.78 (с, 2Н галловой кислоты при С-2¹¹ и С-6¹¹), 6.13 (д, 7 Гц, Н-1 глюкозы), 3.5-5.9 (м, 6Н глюкозы).

Для изучения строения выделенного вещества были использованы метод тонкослойной хроматографии и спектральные методы, позволяющие установить его структуру как 1,3,6-тригаллоилглюкоза. Структурная формула 1,3,6-тригаллоилглюкозы представлена на чертеже в Приложении 2.

Выход целевого продукта - 1,3,6-тригаллоиглюкозы - составил 3,5 г или 3,50% от массы воздушно-сухого сырья.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получить из листьев толокнянки вещество - 1,3,6-тригаллоилглюкозу, которая обладает более выраженной диуретической активностью по сравнению с арбутином. Однократное внутрижелудочное ее введение крысам в 4-часовом эксперименте вызывало достоверное увеличение диуреза и натрийуреза, в 24-часовом - диуреза, натрийуреза, калийуреза и креатининуреза в отличие от арбутина, влияние которого на экскреторную функцию почек крыс не отличалось от контроля. К преимуществам способа можно отнести отсутствие необходимости в применении метанола, требующего особых правил обращения.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. Электрон. дан. 2017. Режим доступа: http://grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx.

2. Государственная фармакопея СССР. - Одиннадцатое издание (Выпуск 1). - М.: Медицина, 1989. - Т. 2. - 399 с.

3. Нагаслаева Л.А. Разработка технологии производства экстракта толокнянки сухого и создание лекарственной формы на его основе, методы их стандартизации: автореф. дис… канд. фарм. наук: 15.00.01; 15.00.02 / Л.А. Нагаслаева; Научно-исследовательский институт фармации. - М.: Полиграфпредприятие Россельхозакадемии, 1994. - 21 с.

4. Волобой, Н.Л. Особенности мочегонной активности арбутина и гидрохинона / Н.Л. Волобой, И.В. Смирнов, А.А. Бондарев // Сибирский медицинский журнал. - 2012. Т. 27, №3. - С. 131-134.

5. Волобой, Н.Л. Сравнение мочегонной активности арбутина и гидрохинона при различных способах введения в экспериментах на крысах / Н.Л. Волобой, И.В. Смирнов, А.А. Бондарев // Нефрология. - 2012. - Т. 16, №4. - С. 84-87.

6. Зайцева, Е.Н. Способ получения диуреза у лабораторных животных / Е.Н. Зайцева // Патент России на изобретение №2494703. - 2013. - Бюл. №28. - 11 с.