ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ИНАКТИВАЦИИ БАКТЕРИЙ, В ТОМ ЧИСЛЕ В БИОПЛЕНКАХ

Настоящее изобретение относится к микробиологии, фармацевтике и медицине, а более конкретно к фотосенсибилизаторам (ФС) для фотодинамической инактивации бактерий, в том числе в биопленках. Изобретение может быть использовано для инактивации локальных очагов хронической инфекции.

Борьба с инфекционными заболеваниями, связанная с возрастающей резистентностью вызывающих хронические заболевания патогенных бактерий к антибиотикам широкого спектра действия, стала одной из основных проблем современной медицины. Установлено, что имеющие сложную структуру организованные сообщества патогенных бактерий (так называемые бактериальные биопленки) практически не поддаются терапии с помощью антибиотиков и являются причиной не только хронических инфекционных заболеваний (гнойные раны, трофические язвы), но и возникающих тяжелых осложнений в кардиохирургии, урологии и других областях медицины, при которых в организм пациента вводятся медицинские изделия (катетеры, стенты, искусственные клапаны и суставы). Сложная инфраструктура и иерархия бактерий в бактериальной биопленке, формирование ею специальных средств жизнеобеспечения и защиты в виде матрикса приводят к тому, что для лечения таких инфекционных поражений дозы антибиотиков надо увеличивать в сотни раз, а такие дозы выходят за пределы реальных возможностей организма.

Обнаружено, что для инактивации биопленок может быть использована фотодинамическая терапия, причем у бактерий не формируется резистентность к этому способу лечения. Наиболее целесообразно для повышения эффективности фотодинамической инактивации бактерий и биопленок использовать катионные фотосенсибилизаторы, которые позволяют эффективно воздействовать как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии, поскольку инфекционные очаги в большинстве случаев имеют мультивидовую природу).

Известны катионные фотосенсибилизаторы на основе синтетического бактериохлорина общей формулы 3-Py₄BC(BuR)₄Br_n, где:

R=Br, n=4 [мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорин тетрабромид с зарядом молекулы +4, патент РФ №2479585]

или

R=Py, n=8 [мезо-тетра[1-(4'-пиридиниобутил)-3-пиридил]бактериохлорин октабромид с зарядом молекулы +8, патент РФ №2476218].

Значительный положительный заряд молекул этих фотосенсибилизаторов позволяет им взаимодействовать как с грамположительными, так и с грамотрицательными бактериями, а при облучении излучением с длиной волны в полосе поглощения молекул 760±20 нм оказывать на них фотодинамическое воздействие.

Эти фотосенсибилизаторы выбраны в качестве ближайших аналогов.

Недостаток известных фотосенсибилизаторов связан с недостаточно высокой эффективностью фотодинамической инактивации патогенных бактерий в свободном состоянии и биопленках.

В изобретении решается задача создания фотосенсибилизатора с повышенной эффективностью фотодинамической инактивации патогенных бактерий в свободном состоянии и биопленках.

Для решения поставленной задачи предлагаются синтетические катионные бактериохлорины общей формулы:

где R=CH₂CH₂Br, или С₇Н₁₅, или CH₂CH₂N⁺C₅H₅Br^-,

в качестве фотосенсибилизаторов для фотодинамической инактивации грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе в биопленках,

Предлагаемые тетракатионные бактериохлорины (мезо-тетра[1-(2'-бромэтил)-3-пиридил]бактериохлорина тетрабромида (3-Py₄BC(EtBr)₄Br₄) при R=(CH₂)₂Br и мезо-тетра(1-гептил-3-пиридил)бактериохлорина тетрабромида (3-Py₄BCH_p4Br₄) при R=С₇Н₁₅ синтезированы алкилированием мезо-тетра(3-пиридил)бактериохлорина 1,2-дибром-этаном или бромистым гептилом, соответственно, в нитрометане в инертной атмосфере в течение 2 ч с высокими выходами 83,9% и 88,4%, соответственно. Октакатионный мезо-тетра[1-(2'-пиридиниоэтил)-3-пиридил]бактериохлорина октабромида (3-Py₄BC(EtPy)₄Br₈) (при R=(CH₂)₂NC₅H₅Br₄ ) синтезирован кипячением тетракатионного (3-Py₄BC(EtBr)₄Br₄) с избытком сухого пиридина в метаноле в инертной атмосфере в течение 3 ч с выходом 91,9%.

Настоящее изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Получение мезо-тетра[1-(2'-бромэтил)-3-пиридил]бактериохлорина тетрабромида (3-Py₄BC(EtBr)₄Br₄).

мезо-Тетра(3-пиридил)бактериохлорин (0,20 г, 0,32 ммоль) [Патент РФ №2549953] растворяют в 10 мл 1,2-дибромэтана и добавляют 10 мл нитрометана и 2 мл метанола. Реакционную массу перемешивают при кипячении в течение 2 ч в инертной атмосфере. После охлаждения до комнатной температуры выпавший осадок отфильтровывают, промывают бензолом и сушат на воздухе в темноте. Далее остаток растворяют в 10 мл метанола, фильтруют через мембранный фильтр (Millipore) с размером пор 0,22 мкм, фильтрат упаривают в вакууме досуха. Получают 0,37 г (83,9 %) 3-Py₄BC(EtBr)₄Br₄. Электронный спектр поглощения, вода, λ_макс, нм (ε): 349 (86590), 372 (78340), 490 (5980), 519 (39570), 701 (4420), 762 (96510) (Фиг. 1). Найдено, %: С, 41.96, 41.74; Н, 3.56, 3.75; N, 7.41, 7.53. C₄₈H₄₆Br₈N₈. Вычислено, %: С, 41.95; Н, 3.37; N, 8.15 %.

Пример 2. Получение мезо-тетра[1-(2'-пиридиниоэтил)-3-пиридил]бактерио-хлорина октабромида (3-Py₄BC(EtPy)₄Br₈).

мезо-Тетра[1-(2'-бромэтил)-3-пиридил]бактериохлорина тетрабромида (3 –Py₄BC(EtBr)₄Br₄) (0,15 г; 0,11 ммоль) растворяют в 7 мл метанола и добавляют 2 мл сухого пиридина. Реакционную массу перемешивают при кипячении в течение 3 ч в инертной атмосфере. После охлаждения до комнатной температуры реакционную массу упаривают в вакууме досуха, остаток промывают бензолом до бесцветного фильтрата. Далее остаток растворяют в 10 мл метанола, фильтруют через мембранный фильтр (Millipore) (0,22 мкм), фильтрат упаривают в вакууме досуха. Получают 0,17 г (91,9 %) 3-Py₄BC(EtPy)₄Br₈. Молекулярный вес 1690,56. Электронный спектр поглощения, вода, λ_макс, нм (ε): 348 (90750), 370 (78840), 485 (5520), 519 (38050), 699 (4160), 764 (95720) (Фиг. 2). Найдено, %: С, 48.21, 48.54; Н, 4.49, 4.58; N, 9.25, 9.25. C₆₈H₆₆Br₈N₁₂. Вычислено, %: С, 48.31; Н, 3.94; N, 9.94.

Пример 3. Получение мезо-тетра(1-гептил-3-пиридил)бактериохлорина тетрабромида (3-Py₄BCH_p4Br₄).

мезо-Тетра(3-пиридил)бактериохлорин (0,10 г, 0,16 ммоль) растворяют в 5 мл хлороформа и добавляют 5 мл нитрометана и 1 мл метанола. Затем к реакционной массе добавляют 2 мл бромистого гептила и перемешивают при кипячении в течение 2 ч в инертной атмосфере. После охлаждения до комнатной температуры реакционную массу разбавляют 10 мл бензола и охлаждают льдом. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают бензолом и сушат на воздухе в темноте. Далее остаток растворяют в 10 мл метанола, фильтруют через мембранный фильтр (Millipore) с размером пор 0,22 мкм, фильтрат упаривают в вакууме досуха. Получают 0,19 г (88,4 %) 3-Py₄BCH_p4Br₄. Электронный спектр поглощения, метанол, λ_макс, нм (ε): 350 (90920), 374 (88400), 488 (11150), 517 (51590), 693 (10120), 760 (101550) (Фиг. 3). Найдено, %: С, 60.62; 60.69; Н, 6.62; 6.70; N, 7.90; 7.89. C₆₈H₉₀Br₄N₈. Вычислено, %: С, 60.99; Н, 6.77; N, 8.37.

Пример 4. Приготовление дисперсии (3-Py₄BCH_p4Br₄) в 4% -ном Kolliphor ELP с концентрацией 1 мМ.

Навеску (3-Py₄BCH_p4Br₄) (13,4 мг) растворяют в 10 мл метанола и смешивают с раствором 0,4 г Kolliphor ELP в 10 мл хлороформа. Перемешивают раствор в круглодонной колбе объемом 1 л с помощью магнитной мешалки, нагревая до 40-50°С. Затем выпаривают растворители на роторном испарителе под вакуумом при температуре водяной бани 40-50°С. Образовавшуюся пленку досушивают под вакуумом до полного исчезновения запаха хлороформа. Затем гидратируют полученную пленку в 10 мл дистиллированной воды до полного растворения Kolliphor ELP с солюбилизированным (3-Py₄BCH_p4Br₄). Раствор фильтруют через мембранный фильтр (Millipore) с размером пор 0,22 мкм.

Пример 5. Сравнительные исследования фотодинамической инактивации патогенных бактерий S.aureus 15 и Р.aeruginosa32 при использовании известных фотосенсибилизаторов (3-Py₄BC(BuBr)₄Br₄) и (3-Ру₄ВС(PyBu)₄Br₈) в водных растворах, предлагаемых фотосенсибилизаторов (3-Py₄BC(EtBr)₄Br₄) и (3-Py₄BC(PyEt)₄Br₈) в водных растворах, и (3-Py4BCH_p4Br₄) 4% -ном Kolliphor ELP

В экспериментах in vitro оценена МБК (минимальная бактерицидная концентрация) по отношению к планктонным бактериям антибиотикорезистентных клинических изолятов S.aureus15 и P.aeruginosa32 известных фотосенсибилизаторов (3-Ру₄ВС(BuBr)₄Br₄) и (3-Ру4ВС(PyBu)₄Br₈) в водных растворах, предлагаемых фотосенсибилизаторов (3-Py₄BC(EtBr)₄Br₄) и (3-Py4BC(PyEt)₄Br₈) в водных растворах, и (3-Py₄BCH_p4Br₄) 4% -ном Kolliphor ELP в стандартных условиях: инкубация бактерий с ФС 30 мин, плотность дозы облучения 30 Дж/см². Исходный титр бактерий 1×10⁸ КОЕ/мл (колониеобразующих единиц в мл). Использовали двукратные разведения ФС, начиная с 100 мкМ. После инкубации бактериальную суспензию центрифугировали, ФС удаляли, бактерии ресуспендировали в физиологическом растворе и разливали по 100 мкл из каждой концентрации и контроля без ФС в лунки 96-луночных плоскодонных планшетов для облучения. После облучения 50 мкл из каждой лунки высевали на чашки Петри с LB агаром, инкубировали в темноте при 37°С в течение 20 ч. Отмечали наименьшую концентрацию ФС, высев из которой не давал роста. Эту концентрацию принимали за минимальную бактерицидную концентрацию (МБК).

Результаты сравнительных исследований МБК известных фотосенсибилизаторов (3-Py₄BC(BuBr)₄Br₄) и (3-Py₄BC(PyBu)4Br₈) в водном растворе, и предлагаемых фотосенсибилизаторов (Py₄BC(EtBr)₄Br₄) и (3-Py₄BC(PyEt)₄Br₈) в водном растворе и (3-Py₄BCH_p4Br₄ в 4%-ном Kolliphor ELP на планктонных клетках штамма St.aureus приведены в Таблице 1.

Результаты сравнительных исследований МБК известных фотосенсибилизаторов (3-Py₄BC(BuBr)₄Br₄) и (3-Py₄BC(PyBu)₄Br₈) в водном растворе, и водном растворе и (3-Py₄BCH_p4Br₄) в 4%-ном Kolliphor ELP на планктонных клетках штамма P.aeruginosa32 МБК известного фотосенсибилизатора (3-Py₄BC(BuBr)₄Br₄) в водном растворе (прототип) и предлагаемых фотосенсибилизаторов (3-Py₄BC(EtBr)₄Br₄) в водном растворе и 3-Py₄BCH_p4Br₄) (дисперсия в 4%Kolliphor ELP) приведены в Таблице 2.

Пример 5. Фотоинактивация бактерий в биопленках.

Биопленки бактерий St.aureus выращивали 18 часов на стеклянных пластинках 7×12 мм в чашке Петри, в которую наливали LB бульон с засеянной культурой бактерий. Затем стекла переносили в 24-луночный планшет, промывали дистиллированной водой, заливали растворами ФС различной концентрации, инкубировали 1 час в термостате, ФС удаляли и стекла облучали в физиологическом растворе световой дозой 70 Дж/см². Затем стекла и жидкость из лунки переносили в пробирку Эппендорфа, биопленку снимали зондом-щеточкой и вместе с щеточкой обрабатывали 10 мин на Вортексе. 10-кратные разведения суспензии бактерий высевали на чашки с LB агаром для подсчета колоний и определения титра КОЕ.

При использовании известного фотосенсибилизатора 3-Py₄BC(PyBu)₄Br₈ значения КОЕ/мл снижались на 3 порядка, известного фотосенсибилизатора (3-Ру₄ВС(BuBr)₄Br₄)-на 3,4 порядка.

При использовании предлагаемых фотосенсибилизаторов 3-Ру₄ВС(PyEt)₄Br₈, (3-Ру₄ВС(EtBr)₄Br₄) или (3-Py₄BCH_p4Br₄) значения КОЕ/мл снижались более чем на 6 порядков.

Таким образом, предлагаемые фотосенсибилизаторы по сравнению с известными фотосенсибилизаторами обладают существенно более высокой эффективностью фотодинамической инактивации планктонных бактерий, в том числе в биопленках.

Для фотодинамической инактивации локальных очагов хронической инфекции их сенсибилизируют системным (например, внутривенным) введением водного раствора (3-Py₄BC(EtBr)₄Br₄) или (3-Ру₄ВС(PyEt)₄Br₈), или кремофорной дисперсии (3-Py₄BCH_p4Br₄), либо аппликационно композициями на основе ((3-Py₄BC(EtBr)₄Br₄) или (3-Py₄BC(PyEt)₄Br₈), или кремофорной дисперсии (3-Py₄BCH_p4Br₄), после чего проводят облучение световым излучением в спектральном диапазоне 750-770 нм. Исследования авторов показали, что сенсибилизацию целесообразно проводить в течение 60-180 мин. Оптимально проводить сенсибилизацию под контролем интенсивности флуоресценции фотосенсибилизатора в спектральном диапазоне 760-800 нм, а облучение осуществлять после достижения максимальной интенсивности флуоресценции.