Результат интеллектуальной деятельности: Штамм бактерий Bifidobacterium bifidum ICIS-310 - продуцент ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Bifidobacterium bifidum ICIS-310 может быть использован для получения ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении средства для продуцирования ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ.

Указанный технический результат достигнут получением нового штамма бактерий Bifidobacterium bifidum ICIS-310.

Штамм бактерий Bifidobacterium bifidum ICIS-310 выделен из испражнений пациента с эубиозом кишечника при обследовании микробиоценоза дистального отдела толстого кишечника в 2013 году в лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований ФГБУН Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук г. Оренбурга.

Полученный штамм Bifidobacterium bifidum ICIS-310 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» и имеет регистрационный номер 1258.

Штамм Bifidobacterium bifidum ICIS-310 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные палочки, длиной от 0,4 до 5,0 мкм с бифуркацией или утолщением на одном или двух концах, располагающиеся в виде отдельных клеток или скоплений.

В анаэробных условиях на поверхности Schaedler-агара и МРС-5 (38±1°С, 48 часов) образуют круглые мелкие белые колонии.

В полужидких средах (печеночная среда Блаурокка, казеиново-дрожжевой (КД-5), гидролизатно-молочный (ГМ) при 38±1°С, 48 часов бактерии вырастают в виде рыхлой массы, оставляя прозрачной верхнюю часть среды (зона аэробиоза). Отдельные колонии бифидобактерий при росте на печеночной среде Блаурокка имеют форму мелких «гвоздей» белого цвета, образующих при встряхивании крошковатую массу.

Физиолого-биохимические признаки.

Строгий анаэроб.

Температурный диапазон роста 38±1°С, фаза максимального накопления микробных клеток заканчивается к 24-48 ч. Оптимум рН 7,2-7,6.

Не ферментируют индол, мальтозу, уреазу, нитраты, N-ацетил-β-D-глюкозаминидазу, β-глюкозидазу, раффинозу и ксилозу. Ферментируют глюкозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мелезитозу, сукрозу, салицин, трегалозу, маннотол, рамнозу, эскулин, маннозу, целлобиозуарабинозу, сорбитол.

Условия хранения лиофильно высушенной культуры: в герметичной упаковке при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 70%. При соблюдении всех норм, срок хранения 1 год.

Условия и состав сред для размножения:

- плотные среды: МРС-5, Schaedler-агар (48 часов, 38±1°С, анаэробные условия);

- полужидкие среды: печеночная среда Блаурокка, казеиново-дрожжевая (КД-5), гидролизатно-молочная (ГМ) (48 часов, 38±1°С, анаэробные условия);

- Schaedler-бульон (24-48 часов, 38±1°С, анаэробные условия).

При проведении полногеномного секвенирования, включая 16rRNA-типирование штамм Bifidobacterium bifidum ICIS-310 идентифицирован как штамм вида Bifidobacterium bifidum.

Уровень активности продуцируемого Bifidobacterium bifidum ICIS-310 ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ определяли согласно известному способу определения антицитокиновой активности микроорганизмов (Бухарин О.В. и др. Антицитокиновая активность микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2011 - №4, С. 56-61).

Уровень активности ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ, продуцируемого штаммом бактерий Bifidobacterium bifidum ICIS-310 выражают в процентах (%) инактивации цитокинов в опыте по сравнению с контролем.

Примеры осуществления изобретения.

Пример 1

Бульонную культуру Bifidobacterium bifidum ICIS-310 получают выращиванием данного штамма в пробирках в жидкой питательной среде следующего состава: гидролизат казеина - 5,67 г.; протеозопептон - 5,00 г.; папаиновый перевар соевой муки - 1,00 г.; дрожжевой экстракт - 5,00 г.; глюкоза - 5,83 г.; NaCl - 1,67 г.; калия гидрофосфат - 0,83 г.; трис - 3,00 г.; L-цистин - 0,40 г.; гемин - 0,01 г. рН = 7,6±0,2. Температура 38±1°С, время инкубации 24-48 часа в анаэробных условиях. Полученную бульонную культуру Bifidobacterium bifidum ICIS-310 центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 20 минут.

Культуральную жидкость отделяют от бактериальных клеток стеклянной стерильной пипеткой в отдельную емкость. Данная культуральная жидкость представляет собой неочищенный препарат ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ.

Наличие и уровень активности полученного неочищенного препарата ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ определяют следующим образом: супернатант Bifidobacterium bifidum ICIS-310 соинкубируют с раствором рекомбинантного цитокина («Sigma», INF-γ) в соотношении 1:1 (опытные пробы).

В качестве контроля используют раствор цитокинов, внесенный в Schaedler-бульон (BBL, США).

Конечная концентрация цитокинов в опытных и контрольных пробах составляла для INF-γ-20, 80, 160, 240, 320 пг/мл.

Опытные и контрольные пробы инкубируют в течение 2 часов (37°С), реакцию останавливают на холоду, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин (+4°С) и отбирают супернатант.

Определение концентрации цитокинов в опытных и контрольных пробах проводят общепринятым иммуноферментным анализом с использованием реагентов «Цитокин» (СП-б, Россия).

Учет результатов проводят на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм.

О наличии продуцируемого штаммом Bifidobacterium bifidum ICIS-310 ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ судили по способности его супернатанта снижать концентрацию рекомбинантного цитокина в опыте по сравнению с контролем.

Уровень активности продуцируемого Bifidobacterium bifidum ICIS-310 ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ определяли согласно известному способу определения антицитокиновой активности микроорганизмов (Бухарин О.В. и др. Антицитокиновая активность микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2011 - №4, С. 56-61).

Уровень активности ингибитора INF-y, продуцируемого штаммом Bifidobacterium bifidum ICIS-310 составил при концентрации цитокина в среде от 20 до 160 пг/мл - 100%, при 240 пг/мл - 80% и 320 пг/мл - 55%.

Пример 2

Аналогично примеру 1 проводили эксперименты по определению наличия и уровня активности ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ, продуцируемого штаммом Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и клиническими изолятами Bifidobacterium spp.(В. bifidum 1-11), выделенных из кишечного биотопа.

Результаты исследований приведены в таблице.

Как видно из таблицы штамм бактерий Bifidobacterium bifidum ICIS-310 имеет 100% уровень активности ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ при концентрации цитокина в среде от 20 до 160 пг/мл, а у клинических изолятов бифидобактерий (В. bifidum 1-11) уровень активности ингибитора цитокина INF-γ в среднем составлял при концентрации цитокина в среде 20 пг/мл - 66,8±5,6%, при 80 пг/мл - 53±5,6%, при 160 пг/мл - 29,3±5,6%. При создании концентрации цитокина в среде 240 пг/мл среди клинических изолятов бифидобактерий три штамма ингибировали 19,7±2,1% цитокина, при 320 пг/мл активность отсутствовала у всех клинических культур.

Уровень активности ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ у штамма Bifidobacterium bifidum ICIS-310 сохранялся и при более высокой концентрации цитокинов: при 240 пг/мл его активность составляла 80%, а при 320 пг/мл уровень активности был равен 55%, что свидетельствует о большей продуктивности ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ штаммом Bifidobacterium bifidum ICIS-310 по сравнению с клиническими изолятами Bifidobacterium spp.

Таким образом, заявляемый штамм бактерий Bifidobacterium bifidum ICIS-310 может быть использован в качестве продуцента ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ.

В. bifidum 1…11 - клинические изоляты Bifidobacterium spp.,

в (№) указан лабораторный номер.