Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А

Широкое распространение вируса ящура, равно как и сложности, возникающие при диагностике заболевания и подборе вакцинных штаммов во время противоэпизоотических мероприятий, обусловлены высокой мутационной изменчивостью генома и, как следствие, антигенным разнообразием вируса ящура [1,2].

Профилактическая эффективность вакцин, определяемая по эпидемиологическим показателям, устанавливается в группах привитых животных при угрозе возникновения и распространения болезни. Вакцины должны обеспечивать создание массовой невосприимчивости и препятствовать распространению эпизоотических штаммов вируса ящура.

Так, для успешного проведения профилактической групповой иммунизации необходима информация о результатах сравнительного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вакцинных штаммов и эпизоотических изолятов вируса ящура, циркулирующих в зоне профилактической вакцинации. При возникновении вспышек заболевания именно путем сравнительного анализа нуклеотидного и аминокислотного определения антигенного соответствия эпизоотического изолята производственному штамму можно наиболее оперативно подобрать необходимый штамм для производства вакцин, применяемых в угрожаемой зоне [3].

Возбудитель ящура обладает высокой антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях в зависимости от видового состава восприимчивого поголовья, иммунного статуса животных и множества других факторов. Мутационная изменчивость изолятов вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), локализованных на поверхности капсидных белков.

Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого изолята, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью способствуют ослаблению специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном, и, кроме того, вызывают затруднения штаммоспецифической диагностики.

В 2015 году на территории Армении была отмечена вспышка ящура. Выделенный изолят значительно отличался от производственных штаммов вируса ящура. В связи с этим для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя возникла необходимость разработать вакцину на основе эпизоотического штамма вируса ящура серотипа А.

Известна вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма вируса ящура, полученного в чувствительной биологической системе (перевиваемая культура клеток свиной почки IB-RS-2 клон 3), и целевые добавки в виде поддерживающей среды и масляного адъюванта в эффективном соотношении [4].

Известна вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А₂₂ №550 вируса ящура, полученного в чувствительной биологической системе (новорожденные крольчата), и целевые добавки в виде поддерживающей среды и масляного адъюванта в эффективном соотношении [5].

Известна вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А₂₂ №550 вируса ящура, полученного в чувствительной биологической системе (перевиваемая культура клеток ВНК-21), и целевые добавки в виде поддерживающей среды и масляного адъюванта в эффективном соотношении [6].

Известна вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из иммуногенных 146S и 75S компонентов вируса ящура типа А штамма А №1707 «Армения-98», полученного в чувствительной биологической системе (перевиваемая культура клеток ВНК-21), и целевые добавки в виде поддерживающей среды и масляного адъюванта [7].

Известна вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А №2187/Кути/2013.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2187/Кути/2013 [8], был выделен в сентябре 2013 года от больных свиней в селе Кути Приаргунского района Забайкальского края (экспертиза №2187). Производственный штамм получен из данного изолята путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным клеткам из свиной почки (СП), а также к перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30). Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно суспензионную перевиваемую клеточную линию ВНК-21/2-17, а в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без сыворотки крови с добавлением ферментативных гидролизатов мышц сухого (ФГМС), гидролизатов белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков (рН_среды 7,4-7,6).

Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей применяют полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) [9]. С целью инактивации вируса используют аминоэтилэтиленамин (АЭЭИ), который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025-0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [10]. В качестве адъюванта используют масляный адъювант Montanide ISA-70.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из иммуногенного 146S компонента вируса ящура штамма А №2187/Кути/2013 и используется в качестве производственного штамма А №2187/Кути/2013 при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.

Данная вакцина характеризуется следующим качественным и количественным составом, мкг в 1 см³ готового препарата:

Основной недостаток вакцины-прототипа состоит в ее недостаточной иммуногенной активности. Она не обеспечивают надежной защиты восприимчивых животных от эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка вакцины инактивированной эмульсионной против ящура, позволяющей обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин инактивированных эмульсионных против ящура типа А. Указанный технический результат, достигнут созданием вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа А, характеризующейся совокупностью признаков, которые приведены ниже.

Предлагаемая вакцина в 1 см³ препарата содержит следующие компоненты: активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 [11], полученного предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21/2-17, в количестве не менее 3,0 мкг и адъюванты: масляный адъювант Montanide ISA-206 или Montanide ISA-70 в количестве 500000,0-575000,0 и 600000,0-700000,0 мкг, соответственно.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, был выделен в декабре 2015 года от больных свиней в Республике Армения (экспертиза №2269). Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 [11] вируса ящура типа А получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы использовали предпочтительно суспензионную перевиваемую клеточную линию ВНК-21/2-17, а в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6.

Для инактивации вируса применяли АЭЭИ, который добавляли в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025-0,05% от общего объема. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализовали внесением в суспензию тиосульфата натрия [9]. Полученный антиген очищали от балластных примесей с помощью ПГМГ, который вносили в суспензию до концентрации 0,005-0,007% от общего объема [10].

Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 представлял собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенные компоненты вируса ящура. Качественное и количественное содержание вирусного сырья в полученном материале определяли методом турбидиметрии [12].

Для приготовления эмульсионной вакцины используют вирусный материал, содержащий не менее 0,5 мкг 146S иммуногенных компонентов вируса ящура.

Необходимую концентрацию иммуногенных компонентов в эмульсионной вакцине, составляющую не менее 3 мкг в 1 см³ готового препарата, получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией.

Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата ящурного антигена и масляного адъюванта в соотношении 4:6 и 1:1 по массе соответственно. Для усиления иммунного ответа используют масляный адъювант производства фирмы «Seppic» марок Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206.

Разработанная эмульсионная вакцина представляет собой молокоподобную жидкость, не растворимую в воде.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана.

1. Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А;

2. Активное вещество;

3. Целевые добавки.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве активного вещества готовый препарат содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.

1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21/2-17 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенные компоненты вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21/2-17 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенные компоненты вируса ящура в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант.

4. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-206.

5. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-206 в количестве 500000,0-575000,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

6. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура, полученного предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21/2-17 и масляный адъювант Montanide ISA-206 в количестве, мкг/см³ препарата:

7. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант.

8. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-70.

9. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-70 в количестве 600000,0-700000,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

10. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура, полученного предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21/2-17 и масляный адъювант Montanide ISA-70 в количестве, мкг/см³ препарата:

Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура серотипа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.

Достижение технического результата от использования изобретения достигается тем, что в состав предлагаемой вакцины введен в качестве активного вещества антигенный материал из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура серотипа А, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего получение противоящурной вакцины эмульсионной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипа А, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.

Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А депонирован 01 февраля 2015 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером (ссылкой): штамм ВЯ А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (производственный), (контрольный КРС), (контрольный свиной).

По сравнению с известными штаммами А №2269/ВНИИЗЖ/2015 обладает более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность использования вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов с целью диагностики и специфической профилактики ящура типа А.

Сущность изобретения пояснена на дендрограмме, отражающей филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена VP₁ штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁ штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А.

Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:40.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 значительно отличается от производственных штаммов типа А.

Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 со штаммами вируса ящура серологического типа А составило: А₂₂№550 - 16,12%, А₂₂/Ирак/64 - 15,78%, А/Иран/96 - 15,78%, А/Армения/98 - 15,34%, А/Турция/06 - 18,47%, А/Иран/05 - 18,62%.

Филогенетический анализ показал, что штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 принадлежит к генетической линии G-VII топотипа Азия.

Антигенное родство штамма ВЯ А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 антигенно отличается от производственных штаммов А₂₂ №550, А/Ирак/64, А/Иран/97, А/Турция/06 (А/Иран/05), А №2187/Кути/13, А №2171/Кабардино-Балкарский/13.

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r₁) составило для А₂₂ №550 - 0,01, А/Ирак/64 - 0,01, А/Иран/97 - 0,05, А/Турция/06 - 0,02, А №2187/Кути/13 - 0,01, А №2171/Кабардино-Балкарский/13 - 0,06. При значении r₁≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [13, 14].

Биотехнологические характеристики

Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 репродуцируется в первично-трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2, и в течение 17-24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,75 до 7,25 lg ТЦД₅₀/см³. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 24 часа. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 3 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристика Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А является РНК-сод ержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеиновая оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 3 пассажей (срок наблюдения).

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа А, обладает более высокой протективной и иммуногенной активностью.

Для снижения эпизоотической опасности ящура типа А и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки высокоиммуногенной вакцины.

Получена высокоиммуногенная инактивированная эмульсионная вакцина против ящура типа А из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена также примерами его осуществления и использования, которые не ограничивают объем правовой охраны изобретения.

Пример 1. Получение и исследование биологических свойств штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в декабре 2015 года от подозреваемых в заболевании ящуром свиней из села Аразап, Армавирский марз, Республика Армения (экспертиза №2269/2015). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 25 декабря 2015 года.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [15].

Биологические и вирусологические методы включали:

Выделение вируса проводили в культуре первично-трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2 с последующей адаптацией в течение 3 пассажей. Применяемые клеточные линии выращивали с использованием требуемых питательных сред в стационарных условиях в культуральных флаконах с площадью поверхности 25 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После контакта с вирусом при температуре 37°С в течение 0,5 ч во флаконы вносили по 5 см³ поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37°С до появления ЦПД вируса, характеризующегося округлением клеток, дегенерацией и отделением клеток от стекла, повышение оптической плотности суспензии. После развития ЦПД флаконы подвергали процессу замораживания-оттаивания, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 об/мин (1200 g) в течение 0,25 ч. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, применяя коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящихся в музее ФГБУ «ВНИИЗЖ». Возбудитель ящура считали адаптированным к культурам клеток, если в течение 20-24 часов клеточный монослой деструктировал под влиянием вируса на 90-100%.

Вирус, адаптированный к клеткам линий ПСГК-3030, IB-RS-2 и ВНК-21/2-17, использовали с целью получения антигена для РСК. Результаты адаптации вируса к указанным клеточным культурам представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А к использованным линиям клеток.

Пример 2. Сравнительный анализ биологических свойств штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с производственными штамма вируса ящура типа А.

При изучении свойств штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 выявлены значительные преимущества в сравнении с используемыми производственными штаммами.

В таблицах 3 и 4 приведены результаты культивирования штаммов А №2269/ВНИИЗЖ/2015 и А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А, из которых следует:

1) штаммы А №2187/Кути/2013 и А №2269/ВНИИЗЖ/2015 имеют разное время репродукции, 10,30±0,35 и 15,35±0,58 часов, соответственно;

2) процент выхода иммуногенных компонентов при культивировании штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура выше, чем у штамма А №2187/Кути/2013.

Пример 3. Получение инактивированного антигена.

Инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа А производят из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура, выращенного в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21/2-17. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без внесения сыворотки крови с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,005-0,200 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование вируса проводят при температуре 36-37°С. Через 6-7 часов инкубирования определяют количество живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15-20%, то экспозицию продлевают еще 2-3 часа. При доле мертвых клеток, равной 90-95%, культивирование прекращают, и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S компонентов. Количество 146S компонентов для эмульсионной вакцины в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см³. Количество 146S компонентов для эмульсионной вакцины в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см³.

Пример 4. Исследование влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S) компоненты вируса ящура штаммов А №2269/ВНИИЗЖ/2015 и А №2187/Кути/2013.

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20%-ный раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой, корректируя рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,050%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при температуре 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия.

В теплую суспензию добавляют 10%-ный раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией.

В таблице 5 приведены результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S) компоненты вируса ящура штаммов А №2269/ВНИИЗЖ/2015 и А №2187/Кути/2013. Из таблицы 5 следует, что иммуногенные компоненты штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура не уступают в устойчивости к инактивации и очистке в условиях производства штамму А №2187/Кути/2013. Особенно важным является тот факт, что в процессе инактивации и очистки вируса из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 концентрация 146S компонентов, полученных при репродукции вируса, не снижается.

Пример 5. Изготовление эмульсионной вакцины против вируса ящура из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.

Антиген вируса ящура получают так, как описано в примерах 3 и 4. Инактивированный антиген вируса ящура контролируют на содержание вирусспецифического белка, 146S компонента вируса, авирулентность и стерильность.

Необходимое количество иммуногенных компонентов 146S достигают при помощи ультрафильтрации. Конечная концентрация 146S компонентов вируса ящура должна быть, не менее 3,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

Масляный адъювант Montanide ISA-70 стерилизуют в реакторе нагревом. Масляный адъювант Montanide ISA-206 стерилизуют при помощи фильтрации.

Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования при помощи проточного смесителя концентрата ящурного антигена и масляного адъюванта Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 в соотношении 40:60 и 50:50 по весу, соответственно.

Вакцину расфасовывают в стеклянные или пластиковые флаконы и проводят контроль ее стерильности в соответствии с ГОСТ 28085-89.

Пример 6. Оценка авирулентности и безвредности эмульсионной противояшурной вакцины из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.

Авирулентность и безвредность вакцины оценивают на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 см³, а затем подкожно в дозе 10,0 см³. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или на морских свинках.

Для определения авирулентности вакцины на свиньях отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³ в две точки венчика на каждой конечности. В исследовании использовали свиней массой 35-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на свиньях проводили путем внутримышечного введения вакцины в область верхней трети шеи в дозе 6 см³. Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после инокуляции температура тела животного может повышаться до 41°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-3 суток.

По результатам исследований вакцина была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Эмульсионная вакцина представляет собой молокоподобную жидкость, не растворимую в воде.

Оптимальный компонентный состав полученной эмульсионной вакцины против ящура типа А указаны в таблицах 6 и 7.

Пример 7. Сравнительный анализ гуморального иммунитета у подсвинков привитых эмульсионной вакциной против ящура.

Проведены испытания антигенной и протективной активности эмульсионной вакцины против вируса ящура типа А на подсвинках, изготовленный так, как описано в примерах 3-5 и содержащей следующие компоненты, мкг/см³ в дозе:

Животных иммунизировали внутримышечно в дозе 2 см³.

Результаты испытаний приведены в таблице 8. По результатам, указанным в таблице видно, что на 28 сутки после иммунизации уровень гуморального иммунитета против гетерологичных штаммов составил от 1,75±0,14 log₂ до 3,95±0,35 log₂, что в 1,22-3,35 раз ниже, чем против штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.

Пример 8. Проведены испытания антигенной и протективной активности эмульсионной вакцины против вируса ящура типа А на КРС, изготовленный так, как описано в примерах 3 и 5 и содержащей следующие компоненты, мкг/см³ в дозе:

Авирулентность и безвредность полученной вакцины оценивали на 5 головах КРС. Препарат вводили каждому животному под слизистую языка в дозе 2,0 см³, а затем подкожно в дозе 10,0 см³. Наблюдение за клиническим состоянием животных вели в течение 10 суток. На протяжении всего срока наблюдения отклонений в клиническом состоянии животных не было выявлено, что подтверждает авирулентность и безвредность введенной вакцины.

По окончании контроля на авирулентность и безвредность вакцину проверили на иммуногенную активность по отношению к КРС. Испытание проводили с использованием 15 голов КРС. Результаты испытания вакцины представлены в таблице 9. Иммунизирующая доза (ИмД₅₀) препарата была составляла 0,19 см³, т.е. в прививной дозе вакцины содержалось 10,5 ПД₅₀.

По рекомендациям OIE (МЭБ), вакцина против ящура должна содержать, не менее 6 PD₅₀ в прививном объеме для КРС [16]. Иными словами, изготовленная инактивированная эмульсионная вакцина из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура имеет высокую иммуногенную активность.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина эмульсионная инактивированная против ящура типа А, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 в соответствии с предлагаемым изобретением обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А»:

1. Domingo, Е. Evolution of FMD virus / E. Domingo, C. Escarmis, E. Baranovski // Virus Res. - 2003. - Vol. 91. - P. 47-63.

2. Узюмов, В.Л. Ультраструктура и физико-химические свойства вируса ящура / В.Л. Узюмов: Фрунзе: Кыргызстан, 1970. - 246 с.

3. Дудников А.И., Борисов В.В., Дудников С.А. Противоящурный иммунитет и практические достижения в области противоящурной защиты // Пробл. та вет. Медицини: зб. наук. прац. - , 2007. -Вип. 15(40). - Ч. 2, - т. 1. - С. 116-120.

4. Патент Франции №2088038; А61К 27/00, С12К 5/00; 07.01.1972 г.

5. Авт. свид. СССР №411131, С12К 5/00, 15.01.1974 г.

6. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам 24.01.1991 г.

7. Патент РФ №2143921, А61К 39/135, С07К 14/09, C12N 7/00, 7/04; 10.01.2000 г. (прототип).

8. Патент РФ №2553219, C12N 7/00, 10.06.2015 г.

9. Патент РФ №594771, А61К 39/12, 07.07.93 г.

10. Патент РФ №2054039, C12N 7/02, А61К 39/135, 10.02.1996 г.

11. Заявка на изобретение №2016127971/10 от 12.07.2016 г.

12. Авт. свид. СССР №784335, C12Q 1/02, 20.03.2000 г.

13. Selection of foot-and-mouth disease vaccine strains a review / D.J. Paton, J.F. Valacher, J. Bergman [et al.] // Rev. Sci. Tech. OIE. - 2005. - Vol. 24(3). - P. 981-983.

14. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 7th Ed.-, Paris, 2012-Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

15. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002,31 с.

16. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals -24th Ed. -, Paris, 2016-Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

Примечание: * ВСБ - вирусспецифический белок

Примечание: * ВСБ - вирусспецифическии белок

Примечание: * ВСБ - вирусспецифическии белок

Примечание: А №2269 - штамм А № 2269/ВНИИЗЖ/2015 культурального вируса ящура,

А Турция - штамм А №2029/Турция/2006 культурального вируса ящура,

А КБР - штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 культурального вируса ящура,

А Кути - штамм А №2187/Кути/2013 культурального вируса ящура,

А₂₂ Ирак - штамм А₂₂ Ирак 24/64 культурального вируса ящура

Примечание: * «-» - отсутствие клинических признаков заболевания,

«+» - наличие клинических признаков ящура,

ИмД₅₀ - иммунизирующая доза,

ПД₅₀ - протективная (защитная) доза вакцины для 50% животных