Способ получения вещества, обладающего антибактериальной и противогрибковой активностью

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к способу получения фармацевтической субстанции растительного происхождения, обладающей антибактериальной и противогрибковой активностью.

К источникам биологически активных соединений, обладающих антиабактериальной и противогрибковой активностью, можно отнести толокнянку обыкновенную [Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., сем. Вересковые - Ericaceae], которая является фармакопейным растением на протяжении нескольких десятилетий во многих странах мира (Российская Федерация, США, Германия, Эстония, Франция и др.) (1, 2). Листья толокнянки обыкновенной используются в качестве антисептического, противовоспалительного, диуретического средства для лечения инфекционных заболеваний мочевыводящих путей (4). Антибактериальное действие препаратов из листьев толокнянки в отношении многих видов микроорганизмов (Staphylococcus aureus SG 511, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Streptococcus faecalis, Enterobacter aerogenes и др.) подтверждено во многих исследованиях (2).

Несмотря на изученный химический состав, недостаточно данных о фармакологической активности доминирующих индивидуальных соединений толокнянки обыкновенной. Предполагается, что антибактериальным действием обладает входящий в состав листьев арбутин (2, 3). В связи с этим представляется актуальным выделение веществ, обусловливающих антибактериальную активность лекарственных средств растительного происхождения, для получения фармацевтических субстанций с более высокой активностью.

Известен способ получения стандартного образца арбутина из сухого экстракта толокнянки (4) путем двухкратной обработки водного раствора экстракта толокнянки н-бутанолом, сгущения экстракта, смешивания кубового остатка с оксидом алюминия и хроматографирования на оксиде алюминия в соотношении исходного экстракта и сорбента 1:4 при элюировании метанолом. Элюат собирают в десятикратном количестве по объему по сравнению с массой сорбента. Для кристаллизации арбутина используют смесь хлороформ-спирт 1,2:1. Для дополнительной очистки используют активированный уголь марки ОУ-А в количестве 0,1-0,15 от массы технического арбутина к его метанольному раствору, который после добавления угля подвергают кипячению и охлаждению.

Данный способ взят за прототип изобретения.

Недостатками данного способа являются:

1) выход технического арбутина составляет 65,4%;

2) использование опасных растворителей - метанола, обладающего выраженными токсическим свойствами и хранение которого осуществляется в специально оборудованных помещениях.

Целью изобретения является выделение из толокнянки обыкновенной вещества, обладающего антибактериальной и противогрибковой активностью.

Заявляемый способ получения вещества с антибактериальной и противогрибковой активностью реализуется следующим образом: листья толокнянки обыкновенной экстрагируют 70% этиловым спиртом, осуществляя вначале две экстракции при комнатной температуре в течение 24 ч, а затем при нагревании на кипящей водяной бане в течение 30 мин; объединенное извлечение упаривают под вакуумом, смешивают с силикагелем в соотношении исходной массы сырья и сорбента 3:1 и высушивают на воздухе; высушенный порошок наносят на слой силикагеля, сформированный в виде взвеси в хлороформе, и подвергают хроматографическому разделению с использованием смесей хлороформа и этилового спирта в градиентном режиме с последующим выделением из фракций, полученных при элюировании смесью растворителей хлороформ-спирт этиловый 95% (93:7), этилового эфира n-дигалловой кислоты - вещества с антибактериальной и противогрибковой активностью.

Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ-этанол (9:1), хлороформ-этанол-вода (26:16:3), а также н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2). Вещество, выделенное из фракций, полученных при элюировании смесью растворителей хлороформ-спирт этиловый 95% (93:7), было идентифицировано с помощью комплекса физико-химических методов (тонкослойная хроматография, УФ-спектроскопия, ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия) как этиловый эфир n-дигалловой кислоты. Выход этого вещества составил 0,8% от массы воздушно-сухого сырья, или 80% от содержания этилового эфира n-дигалловой кислоты в сырье).

Было проведено исследование антибактериальной и противогрибковой активности in vitro этилового эфира n-дигалловой кислоты в сравнении с арбутином и отваром из листьев толокнянки (Приложение 1). В качестве объектов исследования использовали отвар толокнянки обыкновенной (1:10), водный раствор арбутина (1 мг/мл), спиртовой раствор этилового эфира n-дигалловой кислоты (1 мг/мл) и спирт этиловый 95%. Определение минимальной ингибирующей концентрации проводили методом двойных серийных разведений в бульоне Мюллера-Хинтона в соответствии с МУ 4.2.1890-04 (5). В качестве тестовых культур использовали грамположительные бактерии Bacillus cereus и Staphylococcus aureus, грамотрицательные бактерии Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, дрожжеподобный гриб Candida albicans.

В ходе исследования выявлено, в условиях эксперимента арбутин был неактивным в отношении практически всех исследуемых штаммов, за исключением Bacillus cereus (рост наблюдался после разведения в 8 раз). Антибактериальная активность спиртового раствора этилового эфира n-дигалловой кислоты в отношении Bacillus cereus сохранялась при разведении в 32 раза (спирт этиловый 95% - в 8 раз), Staphylococcus aureus - в 16 раз (спирт этиловый 95% - в 4 раза), Pseudomonas aeruginosa - в 16 раз (спирт этиловый 95% - в 4 раза), Е. coli - 32 раза (спирт этиловый 95% - в 8 раз), Отвар из листьев толокнянки обыкновенной также показывал высокую активность в отношении грамположительных бактерий Bacillus cereus (максимальная кратность разведения, при которой сохранялось подавление роста, - 1:64) и Staphylococcus aureus (максимальная кратность разведения - 1:128), а также проявлял антибактериальную активность в отношении грамотрицательных микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa (максимальная кратность разведения - 1:32). И этиловый эфир n-дигалловой кислоты Candida albicans, и отвар толокнянки проявляли активность в отношении дрожжеподобных грибов Candida albicans (максимальная кратность разведения раствора этилового эфира n-дигалловой кислоты 1:128 (спирт этиловый 95% сохранял активность при разведении в 8 раз); максимальная кратность разведения отвара толокнянки 1:128). Таким образом, этиловый эфир n-дигалловой кислоты, выделенный из листьев толокнянки обыкновенной, в условиях in vitro, показывал более высокую активность по сравнению с арбутином (Приложение 1) и, следовательно, более вероятно, что именно этиловый эфира n-дигалловой кислоты, а не арбутин, обусловливает антибактериальную и противогрибковую активность отвара листьев толокнянки обыкновенной.

Заявляемый способ иллюстрируется следующим примером.

100 г воздушно-сухих листьев толокнянки обыкновенной экстрагировали 70% этиловым спиртом, осуществляя вначале две экстракции при комнатной температуре в течение 24 ч, а затем при нагревании на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Объединенное водно-спиртовое извлечение упаривали под вакуумом до объема 50 мл, смешивали с 30 г силикагеля L 40/100 и высушивали. Высушенный порошок (сухой экстракт + силикагель) наносили на слой силикагеля (диаметр - 8 см, высота - 5 см), сформированный в виде взвеси в хлороформе. Хроматографическую колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ-этанол в различных соотношениях (99:1; 98:2; 97:3; 95:5; 93:7; 90:10; 85:15; 80:20; 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70). Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ-этанол (9:1), хлороформ-этанол-вода (26:16:3), а также н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2).

Из фракций (24-26), полученных при элюировании смесью растворителей хлороформ-спирт этиловый 95% (93:7), получали технический целевой продукт: кристаллы белого цвета с сероватым оттенком состава C₁₆H₁₄O₉. УФ-спектр (λ_max EtOH, нм): 220, 276 нм. Масс-спектр (ESI-MS, 180°C, m/z): М⁺ 221 [М⁺ этилгаллата + Na]⁺, 199 [М⁺ этилгаллата + Н]⁺, 171 [М⁺ галловой кислоты + Н]⁺. ¹Н-ЯМР-спектр (300 МГц, ДМСО-d₆, δ, м.д., J/Гц): 9.23 (уш. с, 3Н трех фенольных групп галловой кислоты), 8.90 (уш. с, 1Н фенольной группы галловой кислоты), 8.61 (уш. с, 1Н фенольной группы галловой кислоты), 6.94 (с, 2Н, Н-2¹ и Н-6¹), 6.54 (с, 2Н, Н-2 и Н-6), 4.19 (кв., 2Н, 7 Гц, СН₂), 1.25 (т, 3Н, 7 Гц СН₃).

Для изучения строения выделенного вещества были использованы метод тонкослойной хроматографии и спектральные методы, позволяющие установить его структуру как этиловый эфир n-дигалловой кислоты. Структурная формула этилового эфира n-дигалловой кислоты представлена в Приложении 2.

Выход целевого продукта - этилового эфира n-дигалловой кислоты - составил 7,5 г или 7,50% от массы воздушно-сухого сырья.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получить из листьев толокнянки вещество с антибактериальной и противогрибковой активностью - этиловый эфир n-дигалловой кислоты, который обладает более выраженной антибактериальной и противогрибковой активностью по сравнению с арбутином. К преимуществам способа можно отнести отсутствие необходимости в применении метанола, требующего особых правил обращения.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. Электрон. дан. 2017. Режим доступа: http://grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx.

2. ЕМА/НМРС/573462/2009 Rev. 1 Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC), Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., folium s, 2012.

3. Государственная фармакопея СССР. – 11-е изд. (Вып. 1). - М.: Медицина, 1989. - Т. 2. - 399 с.

4. Нагаслаева Л.А. Разработка технологии производства экстракта толокнянки сухого и создание лекарственной формы на его основе, методы их стандартизации: автореф. дис… канд. фарм. наук: 15.00.01; 15.00.02 / Л.А. Нагаслаева; Научно-исследовательский институт фармации. - М.: Полиграфпредприятие Россельхозакадемии, 1994. - 21 с.

5. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания. МУК 4.2.1890-04.

Приложение 1

Способ получения вещества, обладающего антибактериальной и противогрибковой активностью

Приложение 2

Способ получения вещества, обладающего антибактериальной и противогрибковой активностью