Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОТБОРА ГЕНЕТИЧЕСКИ ПОЛНОЦЕННЫХ СПЕРМАТОЗОИДОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении для отбора зрелых генетически полноценных сперматозоидов и удалении из эякулята неполноценных форм.

Существует множество способов отбора полноценных сперматозоидов, основанных, в частности, на их подвижности: метод swim-up (всплытия), основанный на способности сперматозоидов всплывать в более верхние слои питательной среды, метод центрифугирования в градиенте плотности, основанный на способности живых сперматозоидов проходить сквозь градиент силиконовых частиц, отбор и отсеивание апоптозных клеток (сортировка на магнитной ячейке и стекловате), сортировка клеток по поверхностному заряду (электрофорез и ψ-потенциал), морфологический отбор с помощью ультрамикроскопии [1].

При экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) в методе ПИКСИ (Physiologic ICSI) селективным фактором для «физиологического отбора» полноценных сперматозоидов человека выступает гиалуроновая кислота. Многочисленные исследования показали, что сперматозоиды, имеющие в клеточной мембране рецепторы, обладающие высоким сродством к гиалуроновой кислоте, обладают целостной ДНК, низким уровнем остаточных гистонов и сниженным уровнем анеуплоидии, что положительно сказывается на качестве полученных эмбрионов и частоте наступления беременности [2-3].

Однако метод ПИКСИ применяется для отбора единичных полноценных сперматозоидов человека, является дорогостоящим, а также не подходит для применения в искусственном оплодотворении у сельскохозяйственных животных.

Технический результат заключается в повышении эффективности оплодотворяющей способности спермы сельскохозяйственных животных, путем отбраковки генетически неполноценных и незрелых сперматозоидов, не связавшихся рецептор-опосредованным образом с гиалуроновой кислотой.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных путем связывания генетически полноценных и зрелых сперматозоидов с высоким оплодотворяющим потенциалом с иммобилизованной 1%-ной высокомолекулярной гиалуроновой кислотой животного происхождения при 37°C в течение 30 мин, с последующим удалением из эякулята не связанных с гиалуроновой кислотой дефектных, ослабленных и генетически неполноценных сперматозоидов.

Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных (хряков) осуществляется следующим образом. Для поддержания физиологического статуса сперматозоидов исследование проводят при температуре 37°C. Первоначально готовят 1%-ную высокомолекулярную гиалуроновую кислоту. Для ее приготовления необходимо взвесить 100 мг гиалуроновой кислоты с молекулярным весом не менее 500 кДа и добавить навеску к 10 мл подогретой до 40°C дистиллированной воды, постоянно перемешивая. После полного растворения гиалуроновой кислоты и образования текучего геля добавляют 2-3 мл геля в опытные емкости, имеющие объем 50 мл, покрывая их дно слоем толщиной 3-4 мм. Оставляют сформированные емкости на 3 час при комнатной температуре для подсушки слоя высокомолекулярной гиалуроновой кислоты.

На следующим этапе эякулят хряков в пакетах объемом 100 мл переливают в 2 пробирки по 50 мл, затем отбирают небольшую аликвоту для контрольной оценки концентрации и подвижности сперматозоидов. Центрифугируют пробирку с эякулятом в течение 10 мин при 1000 об/мин, затем большую часть супернатанта (около 80 мл) сливают. В остаточном объеме, включающим осадок сперматозоидов, общим объемом 20 мл подсчитывают концентрацию сперматозоидов с помощью камеры Горяева. Концентрированный эякулят помещают в опытную емкость с гиалуроновой кислотой и инкубируют в термостате при 37°C в течение 30 мин, периодически помешивая. Затем сливают супернатант с не прикрепившимися к иммобилизованной гиалуроновой кислоте незрелыми и имеющими генетические дефекты сперматозоидами. Добавляют в опытную емкость устройства для отбора генетически полноценных сперматозоидов 20 мл элюирующего раствора (среда для разбавления сперматозоидов), подогретого до 37°C, помещают емкость в шейкер и встряхивают в течение 10 мин для отделения сперматозоидов от иммобилизованной гиалуроновой кислоты.

Подсчитывают в отобранной фракции эякулята, включающего генетически полноценные сперматозоиды с высоким оплодотворяющим потенциалом, концентрацию сперматозоидов и оценивают подвижность. В случае если концентрация сперматозоидов составит 60 и более млн/мл, а общая подвижность сперматозоидов повысилась, переливают эякулят, содержащий генетически полноценные сперматозоиды с высоким оплодотворяющим потенциалом, в стерильную тубу для спермы объемом 100 мл, добавляют среду для разбавления в объеме 50 мл и запаивают тубу.

Оценку генетической полноценности сперматозоидов в отобранной аликвоте проводят с помощью комплекса методик, позволяющих оценить структурно-функциональные изменения ядра и хроматина, одноцепочечные разрывы ДНК, уровень процессов перекисного окисления липидов [4].

При оценке генетической полноценности сперматозоидов используют методики морфологической оценки структурного состояния ядра и хроматина с помощью флуоресцентного ядерного красителя Hoechst 33258, определяют фрагментацию ДНК методом Гало, анализируя интенсивность перекисного окисления липидов с помощью ТБК-теста [5-7].

Генетически полноценные сперматозоиды не имеют патологических аномалий и дефектов, характеризуются отсутствием или слабой степенью агглютинации, слабой склонностью к апоптозу (не более 10-15%), отсутствием разрывов в ДНК, ярким и выраженным свечением Гало, низким уровнем содержания ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л).

Генетически неполноценные сперматозоиды могут иметь патологические аномалии и дефекты, склонны к индуцированному или спонтанному апоптозу, имеют высокую частоту встречаемости одноцепочечных разрывов в ДНК и менее яркое и выраженное свечение Гало, а также высокий уровень ТБК-реактивных продуктов, чем генетически полноценные сперматозоиды.

Селекция сперматозоидов по признаку рецептор-опосредованного связывания с иммобилизованной гиалуроновой кислотой позволяет получать фракцию сперматозоидов, имеющих минимальное количество генетических и морфологических нарушений, высокоподвижных с высоким оплодотворяющим потенциалом, и использовать ее для искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. Сперматозоиды, способные связываться с гиалуроновой кислотой, характеризуются отсутствием первичных морфологических признаков апоптоза, одноцепочечных разрывов и фрагментации ДНК, низкой интенсивностью процессов перекисного окисления липидов. При выявлении низкого процента апоптотически гибнущих сперматозоидов до 10-15%, достаточно яркого и выраженного свечения Гало, возрастания содержания ТБК-реактивных продуктов не более чем на 30-40% по отношению к контролю, оценивают сперматозоиды как генетически полноценные.

Таким образом, разработка способа массового отбора сперматозоидов сельскохозяйственных животных, основанного на рецептор-опосредованном связывании с иммобилизованной гиалуроновой кислотой является обоснованной и актуальной, поскольку данная биотехнология отбора позволит селектировать генетически полноценные сперматозоиды и тем самым повысить эффективность искусственного оплодотворения у животных и использовать для осеменения только зрелые сперматозоиды, обладающие высоким оплодотворяющим потенциалом.

Способ заключается в имитации природного явления аффинного взаимодействия зрелых и генетически полноценных сперматозоидов, имеющих в клеточной мембране, экспонированные наружу рецепторы с гиалуроновой кислотой, являющейся компонентом клеточной мембраны яйцеклетки. Зрелые и генетически полноценные сперматозоиды имеют на своей мембране рецепторы, связывающиеся с мономерными остатками гиалуроновой кислоты [8-9]. Если мембрана сперматозоида незрелая или в ней имеются структурно-функциональные нарушения, то связывание с гиалуронатом не происходит или сильно затруднено.

По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет повысить эффективность оплодотворяющей способности спермы сельскохозяйственных животных путем отбраковки генетически неполноценных и незрелых сперматозоидов, не связавшихся рецептор-опосредованным образом с гиалуроновой кислотой.

Источники информации

1. Said Т.М., Land J.A. Effects of advanced selection methods on sperm quality and ART outcome: a systematic review // Hum Reprod Update., 2011, 17, pp. 719-733.

2. Huszar G., Ozenci C.C., Cayli S. et al. Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity, viability, and unreacted acrosomal status // Fertil Steril., 2003, 79, pp. 1616-1624.

3. Parmegiani L., Cognigni G.E., Bernardi S. et al. "Physiologic ICSI": hyaluronic acid (HA) favors selection of spermatozoa without DNA fragmentation and with normal nucleus, resulting in improvement of embryo quality // Fertil Steril., 2010, 93, pp. 598-604.

4. RU 2568845, МПК G01N 33/48, опубл. 20.11.2015.

5. Mikhailenko V.M., Philchenkov A.A. Analysis of 1H NMR-detectable mobile lipid domains for assessment of apoptosis induced by inhibitors of DNA synthesis and replication // Cell Biology International, 2005, 29, 33-39.

6. Fernandez J.L. The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of Sperm DNA Fragmentation // Journal of Andrology. Volume 24, Issue 1, January-February, 2003, pages 59-66.

7. Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury // Free Radical Biology and Medicine. Volume 9, Issue 6, 1990, PP. 515-540.

8. Redgrove K.A., Anderson A.L., McLaughlin E.A. et al. Investigation of the mechanisms by which the molecular chaperone HSPA2 regulates the expression of sperm surface receptors involved in human sperm-oocyte recognition // Mol Hum Reprod. 2013, 19, PP. 120-35.

9. Huszar G., Stone K., Dix D. et al. Putative creatine kinase M-isoform in human sperm is identified as the 70-kilodalton heat shock protein HspA2 // Biol Reprod., 2000, 63, pp. 925-932.