СЕЛЕКТИВНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ МИКОБАКТЕРИЙ

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицинской химии, фармакологии, медицины и касается применения химических соединений ряда (5,6-дигидро-4Н-циклопента[b]тиофен-2-ил)пиперазин-1-карбоксамида в качестве ингибиторов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы микобактерий для подавления роста возбудителя туберкулеза.

Уровень техники

Гликолитический фермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа относится к белкам «домашнего хозяйства» и играет ключевую роль в энергетическом метаболизме всех организмов [Seidler N.W. GAPDH and intermediary metabolism. Adv. Exp. Med. Biol. 2013, 985, c. 37-59], в том числе всех типов бактерий [Ronimus R.S., Morgan H.W. Distribution and phylogenies of enzymes of the Embden-Meyerhof-Parnas pathway from archaea and hyperthermophilic bacteria support a gluconeogenic origin of metabolism, Archaea, 2003, 1(3), с. 199-221]. В последнее время показано особое значение глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа в обеспечении жизнедеятельности микобактерий, поскольку для этих микроорганизмов она необходима не только для осуществления гликолиза, но и для транспорта железа из организма хозяина [Boradia V.M., Malhotra Н., Thakkar J.S., Tillu V.A., Vuppala В., Patil P., Sheokand N., Sharma P., Chauhan A.S., Raje M., Raje C.I. Mycobacterium tuberculosis acquires iron by cell-surface sequestration and internalization of human holo-transferrin. Nat Commun. 2014,5, c. 4730, Z. Fanga, S.L. Sampson, R.M. Warren, N.C. Gey van Pittius, M. Newton-Foot, Tuberculosis, 2015, 95, c. 123-130]. С учетом ключевой роли фермента в метаболизме, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа представляет интерес в качестве потенциальной мишени для лекарственных препаратов против патогенных организмов.

Из научной и патентной литературы известны ингибиторы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ (КФ 1.2.1.12), которые связываются в активном центре ферментов из различных источников и подавляют его активность, при этом основное внимание уделяется глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназам эукариот. Так, например, было изучено ингибирование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из мышц кролика ароматическими тиолами и обнаружены ингибиторы, приводящие к ковалентной модификации критически важного для функционирования фермента аминокислотного остатка цистеина 149 в активном центре, что приводило к потере каталитической активности [Черноризов К.А., Элькина Ю.Л., Семенюк П.И., Швядас В.К., Муронец В.И. "Новые ингибиторы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы: ковалентная модификация NAD-связывающего центра ароматическими тиолами", Биохимия, 2010, 75 №12, с. 1662-1669]. Так как обнаруженные ингибиторы способны подавлять активность гомологичных ферментов животных и человека, они принципиально не пригодны для использования в качестве противотуберкулезных препаратов из-за токсичности для организма хозяина.

Также известно инактивирующее действие винилсульфонов на глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы [Sok D.E., Choi D.S., Kim Y.B., Lee Y.H., Ha S.H. "Selective inactivation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by vinyl sulfones", Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, 195(3), c. 1224-1229]. Показано, что инактивацию фермента предтотвращает присутствие кофермента НАД+ и субстрата глицеральдегид-3-фосфата, т.е. ингибитор связывается в активном центре и, по сути, конкурирует с субстратом и коферментом. Ингибиторы этого класса также не представляют интереса как антибиотики из-за взаимодействия с другими ферментами и последующей модификации как в организме хозяина, так и самими патогенами.

Известны работы по изучению ингибиторных свойств структурных аналогов кофермента [Woenckhaus С, Jeck R, , Dietz G, Jentsch G. "Inactivation of ADH from yeast and GAPDH from rabbit muscle by structural analogues of NAD^+'', FEBS Letters, 1973, 34(2), 175-178; , Branlant G. NAD+ analogue binding to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Eur. J. Biochem. 1983, 137(1-2), c. 67-73; Tritsch D., Eiler-Samama В., Svircevic J., Albrecht A.M., Branlant G., Biellmann J.F. 4-Chloroacetylpyridine adenine dinucleotide. A highly reactive and chromophoric affinity label of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from sturgeon. Eur. J. Biochem. 1989, 181(1), c. 215-222]. Было показано, что структурные аналоги кофермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы способны эффективно подавлять ферментативную активность NAD-зависимых ферментов, однако это ингибирующее действие не является селективным. Трудность создания селективных ингибиторов этого класса обусловлена тем, что такие ингибиторы подавляют активность целого ряда других ферментов, механизм действия которых основан на участии этого же кофермента. NAD-зависимые ферменты представляют собой ключевые ферменты многих процессов, принципиально важных для существования животных и человека: это, например, NAD-зависимые оксидоредуктазы, катализирующие реакции энергетического обеспечения организма [Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология, под ред. А.И. Арчакова, М.П. Кирпичникова, А.Е. Медведева, В.П. Скулачева, Москва, Изд-во МАИК, 2002], ферменты, катализирующие реакции переноса ADP-рибозы при посттрансляционной модификации - ADP-рибозилировании [Diefenbach J., Introduction to poly(ADP-ribose) metabolism, Cellular and molecular life sciences, 2005, 62(7-8), c. 721-730], реакции репарации ДНК [ Poly(ADP-ribose]. The most elaborate metabolite of NAD+. FEBS Journal, 2005, 272(18), c. 4576-4589] и ряд других ферментов [Ziegler М. New functions of a long-known molecule. Emerging roles of NAD in cellular signaling. Eur. J. Biochem., 2000, 267(6), с. 1550-1564]. Такие неспецифические ингибиторы не могут быть использованы для подавления жизнедеятельности патогенов, в том числе не могут селективно подавлять рост возбудителя туберкулеза и выполнять роль противотуберкулезных лекарственных препаратов, поскольку ингибируют активность ключевых ферментов гликолиза, а также других ферментов, жизненно необходимых для существования человека и животных.

Наиболее близким аналогом к заявляемому является применение синтезированных производных 1,4,2,5-диоксадиазина в качестве ингибиторов ряда ферментов, в том числе глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из мышц кролика [RU 2212409, 20.09.2003]. Однако авторами не показана активность вновь синтетизированных производных 1,4,2,5-диоксадиазина в качестве ингибиторов бактериальных глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ. Обнаруженная ингибиторная активность в отношении глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из мышц кролика не позволяет применять данные соединения в качестве новых антибиотиков ввиду их способности ингибировать гомологичные ферменты животных и человека.

Таким образом, до настоящего времени селективные ингибиторы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы микобактерий неизвестны. Кроме того, известные на сегодняшний день ингибиторы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ токсичны для человека и животных. В связи с этим поиск селективных и малотоксичных ингибиторов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы микобактерий представляет актуальную задачу.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка новых ингибиторов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы микобактерий для подавления роста возбудителя туберкулеза, которые не влияют на каталитические свойства глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ человека и животных.

Техническим результатом изобретения является способность химических соединений ряда (5,6-дигидро-4Н-циклопента[b]тиофен-2-ил)пиперазин-1-карбоксамида селективно ингибировать глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы микобактерий для подавления роста возбудителя туберкулеза, при этом не оказывая влияния на каталитические свойства глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ человека и животных.

Поставленная задача решается применением химических соединений ряда этил 2-[{(пиперазин-1-ил)карбонил}амино]-5,6-дигидро-4Н-циклопента[b]тиофенил-3-карбоксилатов общей формулы (1):

где R₁ - (2R)-3-этоксипропан-2-ол, или этоксикарбонил, или гидроксиэтил, или (2S)-2-бутан-1-ол, R₂ – Н, или метил в качестве селективных ингибиторов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы микобактерий.

Указанные соединения - производные (5,6-дигидро-4Н-циклопента[b]тиофен-2-ил)пиперазин-1-карбоксамида являются селективными ингибиторами глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы микобактерий, не ингибируют активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека и животных, подавляют рост возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis и могут быть использованы как противотуберкулезные средства.

Осуществление изобретения

Структура соединений известна из базы данных химических соединений ZINC (http://zincl5.docking.org/) под уникальными идентификационными номерами (представлены также соответствующие названия по номенклатуре IUPAC) ZINC611067648 - этил-2-[({4-[(2R)-3-этокси-2-гидроксипропил]пиперазин-l-ил1}карбонил)амино]-5,6-дигидро-4Н-циклопента[b]тиофен-3-карбоксилат, ZINC6757395 - этил 4-{[3-(этоксикарбонил)-5,6-дигидро-4Н-циклопента[b]тиофен-2-ил]карбамоил}пиперазин-1-карбоксилат, ZINC20573457 - этил-2-({[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]карбонил}амино)-5,6-дигидро-4Н-циклопента[b]тиофен-3-карбоксилат, ZINC611066726 - этил-2-[({4-[(2S)-1-гидроксибутан-2-ил]пиперазин-1-ил}карбонил)амино]-5,6-дигидро-4Н-циклопента[b]тиофен-3-карбоксилат, ZINC614690679 этил-2-({[(3S)-4-(2-гидроксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]карбонил}амино)-5,6-дигидро-4Н-циклопента[b]тиофен-3-карбоксилат.

Все используемые реагенты являются коммерчески доступными. Химические соединения для изучения ингибиторных свойств приобретались у компании Vitas-M (каталожные номера STK854863 и STK601560) и компании Enamine-REAL (каталожные номера Z1503993216, Z1503993108, Z1751153291). При этом публикации с описанием свойств указанных соединений отсутствуют. При исследовании свойств указанных соединений была выявлена ингибирующая активность соединений в отношении глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы микобактерий.

Тестирование противотуберкулезной активности ингибиторов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы in vitro проводили по стандартным методикам, используемым в ЦНИИ туберкулеза РАН и описанным ранее [V. Sosunov, V. Mischenko, В. Eruslanov, Е. Svetoch, Y. Shakina, N. Stern, K. Majorov, G. Sorokoumova, A. Selishcheva, A. Apt, Antimycobacterial activity of bacteriocins and their complexes with liposomes, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2007, 59, 919-925]. При тестировании противотуберкулезной активности соединений использовали Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv из коллекции ЦНИИ туберкулеза РАН. Приготовление суспензии, содержащей практически исключительно отдельные микобактерии, производили по методике, подробно описанной ранее [I. Lyadova, V. Yeremeev, K. Majorov, В. Nikonenko, S. Khaidukov, Т. Kondratieva, N. Kobets, A. Apt, An Ex Vivo Study of T Lymphocytes Recovered from the Lungs of I/St Mice Infected with and Susceptible to Mycobacterium tuberculosis, Infection and Immunity, 1998, 66 (10), 4981-4988]. Препараты микобактерий в аликвотах хранили при температуре -80°С. Микобактерии ресуспендировали в среде RPMI-1640 без антибиотиков с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки. Суспензии культивировали в лунках 96-луночного планшета (250×10³ микобактерий/лунку). Исследуемые соединения растворяли в DMSO (2 мг/мл) и добавляли в лунки до конечной концентрации через 24 часа после начала культивирования микобактерий.

Методика А. Исследуемые соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО, DMSO) (2 мг/мл) и добавляли в лунки до конечной концентрации через 24 часа после начала культивирования микобактерий. Культуры инкубировали дополнительно 65 ч, при этом последние 18 ч в присутствии [³Н]-урацила (2 μCi/20 μl/лунку). Жизнеспособность микобактерий оценивали по уровню включения радиоактивной метки на сцинтилляционном счетчике.

Методика Б. Для получения бактерий в log-фазе, 50 мкл свежеразмороженной культуры бактерий добавляли к 30 мл бульона Дюбо и инкубировали 14 дней при 37°С в закрытых 300 мл колбах. Перед использованием культуру дважды отмывали в натрий-фосфатном буфере (PBS) с 0,05% Tween80 центрифугированием при +4°С, 20 мин, 3000 g, после чего микобактерии ресуспендировали в среде, применяемой в конкретном эксперименте. Полученную суспензию фильтровали через стерильный фильтр с размером пор 4 мкм для удаления агломератов. Для определения концентрации КОЕ Mycobacterium tuberculosis в фильтрате готовили 5-кратные серийные разведения фильтрата. 20 мкл каждого разведения сеяли на агар Дюбо в виде круглых капель. Капли высушивали и через 3 дня культивирования при 37°С и считали общее количество микроколоний под инвертированным микроскопом. Фильтрованную культуру хранили при +4°С до момента использования в течение 3-4 дней; в течение этих дней не наблюдали уменьшения числа КОЕ в культуре.

Выделение и очистка ферментных препаратов для изучения ингибиторных свойств отобранных соединений. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу микобактерий выделяли из биомассы Mycobacterium smegmatis, полученной из 2 л культуты. Осадок клеток (5,3 г) суспендировали в 25 мл буфера (10 мМ фосфат калия, 2 мМ дитиотреитол, рН 7,0) и разрушали ультразвуком. Разрушенные клетки удаляли центрифугированием. Полученный экстракт бактериальных клеток фракционировали сульфатом аммония, собирая фракции белка, осаждаемые при 0-50, 50-70, 70-80% насыщения. Максимальная дегидрогеназная активность наблюдалась во фракции с насыщением сульфатом аммония 70-80%. Данную фракцию перекристаллизовывали, добавляя к раствору белка сульфат аммония до развития мутности. Активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в полученном препарате составляла 70 мкмоль восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (NADH)/мин мг белка. Анализ полученного препарата методом электрофореза в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия 0,1% выявил наличие основной полосы с молекулярной массой 40 кДа. Матрично-активированная лазерная десорбционно/ионизационная масс-спектрометрия (МАЛДИ-МС) подтвердила, что полоса с молекулярной массой 40 кДа соответствует глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе Mycobacterium smegmatis. Полученную активную фракцию использовали для первичного скрининга ингибиторов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы микобактерий.

Рекомбинантную глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу человека выделяли из культуры клеток-продуцентов, используя фракционирование сульфатом аммония и гель-хроматографию на сефадексе G-100 по методике, описанной в работе [Barinova K.V., Eldarov М.А., Khomyakova E.V., Muronetz V.I., Schmalhausen E.V. Isolation of recombinant human untagged glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from E.coli producer strain, Protein Expr. Purif. (2017)137, 1-6. doi: 10.1016/j.pep.2017.06.009]. Активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в полученном препарате составляла 115 мкмоль NADH/мин мг белка. Полученную активную фракцию использовали для проверки ингибирующего действия отобранных соединений на активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека.

Измерение активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы при добавлении ингибиторов проводили следующим образом. Ингибирующие свойства соединений тестировали в системе, которая содержала 50 мМ глицин, 50 мМ фосфат калия, 1 мМ ЭДТА, рН 9,0, 0,5 мМ NAD и 0,5 мМ 3-фосфоглицериновый альдегид. Тестируемые соединения растворяли в диметилсульфоксиде для получения растворов концентрации 0,2-2 мМ. Растворы ферментов (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу микобактерий или человека в концентрации 0,5-1 мг/мл) перед использованием инкубировали 45 мин в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7.0 в присутствии 5 мМ дитиотреитола при комнатной температуре для восстановления SH-групп. В кюветы (1 мл), содержащие все компоненты для измерения активности, кроме 3-фосфоглицеринового альдегида, добавляли 1-2 мкл тестируемых ингибиторов, а также по 1 мкг ферментов. Кюветы без добавления ингибиторов служили контролем. Реакцию начинали добавлением 3-фосфоглицеринового альдегида до конечной концентрации 0,5 мМ. Скорость реакции регистрировали по увеличению оптической плотности раствора при 340 нм в течение 1 мин при помощи спектрофотометра Shimadzu UV-1601.

Результаты изучения ингибирующей активности указанных соединений по отношению к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе микобактерий и человека, а также тестирования противотуберкулезной активности ингибиторов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы представлены в примерах.

Пример 1. Раствор ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы ZINC20573457 готовили как описано выше и использовали для определения противотуберкулезной активности по методике А. Подавление роста Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv в присутствии ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы в концентрации 0,02 мМ составило 76%.

Пример 2. Раствор ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы ZINC20573457 готовили как описано выше и использовали для определения противотуберкулезной активности по методике Б. Наблюдали полное подавление роста Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv в присутствии ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы в концентрации 0,07 мМ.

Пример 3. Раствор ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы ZINC20573457 готовили как описано выше и использовали для определения противотуберкулезной активности по методике Б. Наблюдали полное подавление роста Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv в присутствии ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы в концентрации 0,2 мМ.

Пример 4. Раствор ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы ZINC6757395 готовили как описано выше и использовали для определения противотуберкулезной активности по методике Б. Наблюдали слабый рост Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv в присутствии ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы в концентрации 0,07 мМ.

Пример 5. Раствор ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы ZINC6757395 готовили как описано выше и использовали для определения противотуберкулезной активности по методике А. Подавление роста Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv в присутствии ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы в концентрации 0,2 мМ составило 94%.

Пример 6. Раствор ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы ZINC611067648 готовили как описано выше и использовали для определения противотуберкулезной активности по методике А. Подавление роста Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv в присутствии ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы в концентрации 0,07 мМ составило 83%.

Пример 7. Раствор ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы ZINC611066726 готовили как описано выше и использовали для определения противотуберкулезной активности по методике А. Подавление роста Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv в присутствии ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы в концентрации 0,07 мМ составило 61%.

Пример 8. Раствор ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы ZINC614690679 готовили как описано выше и использовали для определения противотуберкулезной активности по методике А. Подавление роста Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv в присутствии ингибитора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы в концентрации 0,07 мМ составило 54%.

Результаты тестирования ингибиторных свойств соединений, подтверждающих селективность ингибирования, представлены в таблице 1.

Результаты испытаний ингибиторных свойств соединений, представленных в таблице, показали, что данные соединения в концентрации 0,1 мМ ингибируют глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу микобактерий на 47-59%, при этом не оказывая влияния на глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу человека.

Обнаруженные ингибиторы характеризуются высоким значением LD50 (доза, летальная для 50% тестируемых животных): диапазон предсказанных значений данного параметра, характеризующего острую токсичность, составляет 1200-2100 мг/кг при пероральном введении и 86-130 мг/кг при внутривенном введении мышам. Биодоступность при пероральном введении при дозе 50 мг 87-99%. Полученные результаты свидетельствуют о безопасности разработанных ингибиторов и позволяют планировать предварительные исследования на животных моделях, а также облегчают выбор подходящих доз.

Представленные примеры свидетельствуют о том, что испытанные соединения способны подавлять рост возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv, не ингибируя активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека и животных и могут быть использованы как противотуберкулезные средства.