СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ КОМПЛЕКСА ACINETOBACTER CALCOACETICUS - ACINETOBACTER BAUMANNII

Изобретение относится к области биотехнологии. Может быть использовано при бактериологических исследованиях по выделению и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii, включающего виды A.calcoaceticus, A.baumannii, A.pittii, A.nosocomialis, а также в производстве питательных сред для этих исследований.

Известен способ выделения и идентификации бактерий рода Acinetobacter с использованием синтетической этанол-аммонийной среды ЭАС (Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий - возбудителей внутрибольничных инфекций. Методические рекомендации. По состоянию на август 2014 г. Утверждены зам. министра здравоохранения СССР К.И. Акуловым 3.06.1986 г.). Отбор проб патологического материала для качественной оценки результатов производят в 10 мл стерильной жидкой накопительной среды ЭАС-1, используя для смывов эту же среду. Затем посевы на среде ЭАС-1 выдерживают при 30°С в течение 48 ч. При положительном результате на поверхности среды образуется бесцветная пленка. С пленки материал пересевают на 2-4 сектора плотной среды ЭАС-2 и инкубируют при 30°С в течение 24 ч; при отсутствии роста посевы оставляют еще на 24 ч. На среде ЭАС-2 колонии A.calcoaceticus v. anitratus оранжевые, иногда желтые, средних размеров, выпуклые, с ровными краями. Колонии A.lwoffi бледно-зеленые, мелкие, выпуклые, с ровными краями. Для идентификации снимают 2-3 колонии и проводят по тестам в соответствии с идентификацией неферментирующих бактерий. Примечание к способу. Питательные среды для выделения бактерий рода Acinetobacter. Этанол-аммонийная среда жидкая (ЭАС-1). К 100 мл дистиллированной воды добавляют фосфата натрий-аммония 0,15 г; фосфата калия однозамещенного 0,04 г; сульфата калия 0,02; хлорида магния 0,02. После стерилизации при 0,5 атм в течение 15 мин прибавляют 1,2 мл этилового 96-градусного спирта и разливают асептично по 10 мл в пробирки. Этанол-аммонийная среда плотная (ЭАС-2). Основной состав среды тот же, но до стерилизации добавляют 1,5 г агара (порошкового 1,8 г) и 0,5 мл 1,6-процентного щелочного раствора бромтимолового синего. По нашим данным изучения среды ЭАС-2, на ней возможен также рост бактерий Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas luteola, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae; отсутствует рост прочих видов энтеробактерий, неферментирующих бактерий, грамположительных бактерий.

Известен способ выделения и идентификации бактерий рода Acinetobacter с использованием селективно-дифференциальной питательной среды Leeds Acinetobacter Medium (LAM), разработанной в университете г. Лидс, Великобритания (A. Jawad, P.M. Hawkey, J. Heritage, A.M. Snelling. Description of Leeds Acinetobacter Medium, a new selective and differential medium for isolation of clinically important Acinetobacter spp., and comparison with Herella agar and Holton's agar. J. Clin. Microbiol. 1994, Vol. 32, No 10; p. 2353-2358). Состав среды, г/л: гидролизат казеиновой кислоты 15,0; соевый пептон 5,0; хлорид натрия 5,0; фруктоза 5,0; сахароза 5,0; маннитол 5,0; L - фенилаланин 1,0; железо цитрат аммония 0,4; феноловый красный 0,02; агар 12,0; вода дистиллированная 1 л; рН 7,0±0,2. Стерилизуют среду при 121°С 15 мин. После остывания до 55°С добавляют селективные агенты: ванкомицин 10 мг/л, цефсулодин 15 мг/л, цефрадин 50 мг/л. По указанной прописи среду LAM производит фирма Hardy Diagnostics (USA). Согласно инструкции по применению сред (https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/ LeedsAcinetobacterMedium.pdf) исследуемый материал засевают штрихами на поверхность среды, инкубируют аэробно при 35°С в течение 24-48 ч. Результаты интерпретируют по характеристике выросших колоний бактерий. Бактерии Acinetobacter spp. образуют через 24 ч светло-розовые колонии с розово-лиловой зоной окраски среды, круглые, выпуклые, гладкие, с ровными краями, непрозрачные, диаметром 1-2 мм. Бактерии Stenotrophomonas maltophilia имеют светло-розовые колонии с розво-лиловой зоной окружающей среды, плоские, морщинистые, с зубчатыми краями, непрозрачные, диаметром 1-2 мм. Бактерии Burkholderia cepacia образуют светло-розовые колонии с розово-лиловой зоной окружающей среды. Колонии бактерий Providencia alcalifaciens коричневого цвета с коричнево-черной зоной среды. Бактерии Serratia marcescens образуют розовые колонии с желтой зоной окружающей среды. Подавляется рост грамположительных бактерий.

Известен способ выделения и идентификации бактерий Acinetobacter с применением хромогенной среды CHROMagar Acinetobacter (производства CHROMagar, Paris, France). По инструкции к применению среды (https://drg-international.com/wp-content/uploads/2016/04/Acinetobacter-ins.pdf) питательная среда содержит пептон, дрожжевой экстракт, агар, соли, хромогенную смесь, суплемент с регулятором роста, суплемент для выявления штаммов с множественной устойчивостью к антибиотикам. Состав хромогенной смеси и суплементов не раскрывается. Исследуемый материал засевают на среду в чашках Петри, инкубируют аэробно при 37°С в течение 18-24 ч. Выявляют бактерии рода Acinetobacter по наличию характерных колоний красного цвета. Некоторые штаммы энтеробактерий вырастают колониями голубого цвета. Подавляется рост грамположительных бактерий. Иногда встречаются колонии красного цвета бактерий P.aeruginosa, S.maltophilia. При этом P.aeruginosa легко отличить тестом на оксидазу. Штаммы S.maltophilia отличают по крошечной величине их колоний. Иногда могут потребоваться дополнительные подтверждающие тесты (биохимические, латекс-агглютинация) непосредственно из колоний. При использовании суплемента с антибиотиками для выявления множественно-устойчивых ацинетобактеров на хромогенной среде вырастают также колонии антибиотикорезистентных штаммов других родов бактерий и подавляется рост антибиотикочувствительных штаммов ацинетобактеров.

Прототипом заявляемого способа нами избран способ с использованием синтетической этанол-аммонийной среды (ЭАС), так как в обоих способах выделение и идентификация ацинетобактеров проводится на синтетических питательных средах.

Недостатком прототипного способа и аналогов является недостаточная чувствительность и специфичность исследования ввиду слабой селективности используемых питательных сред, на которых возможен рост бактерий многих других видов.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности исследования по выделению и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii.

В соответствии с изобретением поставленная цель достигается тем, что исследуемый материал засевают на питательную среду, содержащую в качестве единственного источника азота и углерода аминокислоту L-фенилаланин; ингибитор посторонней микрофлоры триметоприм, растворенный в диметилсульфоксиде; соли - NaCI, Na₂SO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄, MgSO₄; агар микробиологический, дистиллированную воду при следующем содержании ингредиентов: L-фенилаланин 2,0-3,0 г; триметоприм 0,006-0,01 г; диметилсульфоксид 6-10 мл, NaCI 5,0 г; Na₂SO₄ 2,0 г; KH₂PO₄ 1,0 г; K₂HPO₄ 2,5 г; MgSO₄ 0,1 г; агар микробиологический 15,0; вода дистиллированная 1 л; рН 7,2±0,2; при этом все ингредиенты, кроме триметоприма, растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, затем добавляют триметоприм (0,1% раствор на диметилсульфоксиде), разливают среду в стерильные чашки Петри; инкубируют посевы при 35°С в течение 18-24 ч; определяют принадлежность бактерий к комплексу Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii по наличию колоний диаметром 1-2 мм, круглых, выпуклых, с ровными краями, светло-серого цвета, непрозрачных. Примечание: бактериологический контроль качества питательной среды заявляемого способа проводят при изготовлении среды; суточные бульонные культуры контрольных штаммов (клинические штаммы A.baumannii, K.oxytoca и штамм P.aeruginosa АТСС 27853) засевают по одной петле радиальным штрихом на поверхность испытуемой среды в чашке Петри, инкубируют аэробно при 35°С в течение 24 ч; учитывают результат: питательная среда пригодна к использованию, если имеется пышный рост бактерий A.baumannii, рост P.aeruginosa частично угнетен или отсутствует, нет роста K.oxytoca.

Первый отличительный существенный признак способа - использование в питательной среде аминокислоты L-фенилаланина (CAS No 63-91-2) от 2,0 г/л до 3,0 г/л в качестве единственного источника азота и углерода. Отличительный существенный признак не применялся в прототипе и аналогах. В аналоге с использованием селективно-дифференциальной среды LAM L-фенилаланин входит в состав среды исключительно как субстрат диагностического теста на фенилаланиндезаминазу для выявления бактерий рода Providencia; источниками азота в этой среде являются пептон и гидролизат казеина, основным источником углерода - фруктоза, сахароза, маннитол. Известна способность бактерий комплекса A.calcoaceticus - A.baumannii утилизировать L-фенилаланин в качестве единственного источника углерода. Способность этих бактерий использовать L-фенилаланин в качестве единственного источника азота и углерода выявлена нами впервые в данном исследовании. Нами также впервые неожиданно установлен необычно интенсивный и быстрый рост A.baumannii на синтетической питательной среде с L-фенилаланином заявляемого способа - через 18-24 ч наблюдается обильный рост характерных колоний диаметром 1-2 мм. Штаммы бактерий других родов, утилизирующих L-фенилаланин, формируют за этот период только очень мелкие, точечные колонии (диаметром менее 0,1 мм), то есть их рост частично ингибирован. На питательной среде заявляемого способа частично или полностью ингибирован рост штаммов Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae; отсутствует рост K.oxytoca, энтеробактерий родов Citrobacter, Escherichia, Serratia, Providencia, Proteus, неферментирующих бактерий Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Pseudomonas spp. Следовательно, по селективности питательная среда заявляемого способа превосходит питательные среды прототипа и известных аналогов. При этом нами установлено, что селективная синтетическая среда заявляемого способа имеет высокую аналитическую чувствительность для бактерий видов A.baumannii и A.pittii 1-2 КОЕ/мл^-1, равную чувствительности контрольной неселективной среды. Представленные сведения указывают, что данный отличительный существенный признак непосредственно определяет достижение поставленной технической задачи - повышение чувствительности и специфичности исследования.

Второй отличительный существенный признак - использование в питательной среде триметоприма (CAS No 738-70-5) от 0,006 г/л до 0,01 г/л в качестве ингибитора посторонней микрофлоры. Этот признак не использовался в прототипе и аналогах. Известно, что бактерии рода Acinetobacter имеют природную устойчивость к триметоприму. Однако применение его не очевидно. Нами установлено, что коммерческие препараты триметоприма в сочетании с сульфаметоксазолом (ко-тримоксазол) не пригодны, так как вследствии синергизма компонентов оказывают бактерицидное действие на все штаммы бактерий Acinetobacter. Пригоден только чистый триметоприм, растворенный в диметилсульфоксиде. Оптимальные для данного способа концентрации триметоприма были определены нами экспериментально. Применение этого препарата позволило дополнительно повысить селективность питательной среды: полностью ингибировать рост бактерий В.cepacia и некоторых штаммов K.pneumoniae subsp. pneumoniae.

Третий отличительный существенный признак - использование в питательной среде комплекса солей, г/л: NaCI 5,0; Na₂SO₄ 2,0; KH₂PO₄ 1,0; K₂HPO₄ 2,5; MgSO₄ 0,1. Эти соли не применялись в прототипе и аналогах. Они определяют синтетический состав среды; не содержат минеральных источников азота и углерода и направляют метаболизм бактерий на потребление азота и углерода из единственной аминокислоты L-фенилаланина; создают оптимальный рН питательной среды.

Существенными признаками способа являются: температурный режим - инкубация посевов при 35°С, так как некоторые виды бактерий комплекса A.calcoaceticus - A.baumannii не растут при 41°С и 44°С, но все растут при 35°С; аэробные условия, так как ацинетобактеры аэробы; время инкубации - 18-24 ч, так как в этом интервале наиболее четко проявляются дифференцирующие признаки колоний бактерий.

Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа

Пример 1. Исследуемый материал - отделяемое раны засевают тампоном на питательную среду заявляемого способа в секторе чашки Петри (1/4 часть чашки). На одну чашку со средой засевают материал четырех проб. Посевы инкубируют аэробно при 35°С в течение 18 ч, затем учитывают результат. На секторах трех проб отсутствует рост бактерий. В четвертом секторе имеются колонии бактерий (более 30) диаметром 1-2 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, светло-серого цвета, непрозрачные, что указывает на их принадлежность к бактериям комплекса A.calcoaceticus - A.baumannii. Контрольная проверка экспрессными тестами на оксидазу, микрообъемную ферментацию и окисление глюкозы (1 ч) показала: бактерии оксидазоотрицательные, не ферментируют, но окисляют глюкозу, что характерно для бактерий указанного комплекса. Контрольная видовая идентификация бактерий методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI - TOF масс-спектрометрия) показала их принадлежность к виду A.baumannii.

Примечание к примеру 1. Методика приготовления питательной среды заявляемого способа. В 1 л дистиллированной воды вносят, г/л: L-фенилаланин (CAS No 63-91-2) 2,0; NaCI 5,0; Na₂SO₄ 2,0; KH₂PO₄ 1,0; K₂HPO₄ 2,5; MgSO₄ 0,1; агар микробиологический 15,0; растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, затем добавляют триметоприм (CAS No 738-70-5) 0,006 (6 мл 0,1% раствора на диметилсульфоксиде); проверяют рН 7,2±0,2; разливают в стерильные чашки Петри. Среда бесцветная, прозрачная, пригодна к использованию в течение 30 суток при хранении от 4°С до 8°С. Контроль питательной среды: суточные бульонные культуры контрольных штаммов (клинические штаммы A.baumannii, K.oxytoca и штамм P.aeruginosa АТСС 27853) засевают по одной петле радиальным штрихом на поверхность испытуемой среды в чашке, инкубируют аэробно при 35°С 24 ч; среда пригодна к использованию, если имеется пышный рост бактерий A.baumannii, рост P.aerugiosa частично угнетен или отсутствует, нет роста K.oxytoca.

Пример 2. Исследуемый материал - мочу больного в разведении 10^-3 0,1 мл растирают шпателем в чашке Петри на поверхности питательной среды заявляемого способа, содержащей на 1 л дистиллированной воды 0,3 г L-фенилаланина, 0,01 триметоприма и остальные ингредиенты по примечанию к примеру 1; инкубируют посев аэробно при 35°С в течение 24 ч, затем учитывают результат. На питательной среде обильно выросли колонии бактерий диаметром 1-2 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, светло-серые, мутные, что указывает на их принадлежность к комплексу A.calcoaceticus - A.baumannii. Контрольная проверка экспрессными тестами на оксидазу, микрообъемную ферментацию и окисление глюкозы (1 ч) показала: бактерии колоний оксидазоотрицательные, не ферментирует, но окисляют глюкозу, что подтверждает их принадлежность к указанному комплексу. Контрольная видовая идентификация методом MALDI - TOF масс-спектрометрии определила их принадлежность к виду Acinetobacter pittii, входящему в комплекс A.calcoaceticus - A.baumannii.

Пример 3. Исследуемый материал - смыв из бронхов в разведении 10^-3 0,1 мл растирают шпателем на поверхности питательной среды заявляемого способа, содержащей в 1 л дистиллированной воды 2,0 г L-фенилаланина, 0,008 г триметоприма и остальные ингредиенты по примечанию к примеру 1; инкубируют посев аэробно при 35°С в течение 24 ч, затем учитывают результат. На питательной среде выросли колонии двух типов. Четко выражены колонии диаметром 1-2 мм, выпуклые, с ровными краями, светло-серые, мутные, которые указывают на принадлежность бактерий к комплексу A.calcoaceticus - A.baumannii. Колонии второго типа мелкоточечные, окруженные пленочной бесцветной прозрачной зоной, что характерно для бактерий P.aeruginosa. Контрольная проверка экспрессными тестами на оксидазу, микрообъемную ферментацию и окисление глюкозы (1 ч) показала, что бактерии колоний первого типа оксидазоотрицательные, не ферментируют, но окисляют глюкозу, что подтверждает их принадлежность к комплексу A.calcoaceticus - A.baumannii. Бактерии колоний второго вида оксидазопозитивные, что подтверждает их принадлежность к Р.aeruginosa. Контрольная идентификация методом MALDI - TOF масс-спектрометрии показала, что бактерии колоний первого типа - A.baumannii, колоний второго типа - P.aeruginosa.

Таким образом, при всех предельных концентрациях основных ингредиентов питательной среды заявляемого способа получены четкие результаты выделения и идентификации бактерий комплекса A.calcoaceticus - A.baumannii.

Изучали диагностическую чувствительность и специфичность заявляемого способа в сравнении с прототипом и традиционным методом (посев на кровяной агар, среду Эндо, биохимическая идентификация) в клинико-диагностической лаборатории. При изучении 400 проб клинического материала (отделяемое ран, мокрота, моча) были выделены бактерии комплекса A.calcoaceticus - A.baumannii заявляемым способом в 26 пробах (18 проб в монокультуре, 8 - в ассоциациях, из них 7 с P.aeruginosa, 1 с K.pneumoniae); способом прототипа в 21 пробе (8 проб в монокультуре, 13 - в ассоциациях с P.aeruginosa, K.pneumoniae). Традиционным методом были выделены бактерии этого комплекса в 20 пробах (7 проб в монокультуре, 13 - в ассоциациях с P.aeruginosa, K.pneumoniae, E.coli, Citrobacter freundii, Providencia rettgeri, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis). Следовательно, диагностическая чувствительность заявляемого способа превышает прототип на 25% и традиционный метод на 30%. Методом MALDI - TOF масс-спектрометрии установлено, что все 26 штаммов бактерий, выделенных и идентифицированных заявляемым способом, относятся к роду Acinetobacter, видам A.baumannii - 23, A.pittii - 2, A.baylyi - 1 штаммов. Вид A.baylyi не относится к комплексу A.calcoaceticus - А.baumannii. Следовательно, диагностическая специфичность заявляемого способа по выявлению бактерий комплекса A.calcoaceticus - A.baumannii составляет 96,2%.

Селективная синтетическая питательная среда заявляемого способа подавляет рост грамположительных бактерий, в том числе спорообразующих бактерий рода Bacillus, поэтому не требует стерилизации в паровом стерилизаторе. Ввиду стандартности состава, обеспечивающего стабильность оптимального рН, питательная среда не содержит рН-индикаторов, что позволяет более четко выполнять контрольные диагностические тесты.