СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Изобретение относится к области биотехнологии. Может быть использовано при бактериологических исследованиях по выделению и идентификации бактерий Pseudomonas aeruginosa, производстве питательных для этих исследований.

Известен способ выделения и идентификации P. aeruginosa с использованием отечественной питательной среды «Pseudomonas APS» (Сиволодский Е.П. Питательная среда «Pseudomonas APS» для выделения и идентификации бактерий Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas putida. - Лабораторное дело. - 1990. - №8. - С. 65-67). Эта селективная среда была разработана на основе обнаруженного нами нового свойства лекарственного желчегонного препарата «оксафенамид» (осалмид) избирательно подавлять рост всех бактерий, кроме P.aeruginosa и P.putida. Питательная среда была защищена авторским свидетельством на изобретение СССР (Сиволодский Е.П. А.с. СССР №1414871, опубликовано 07.08.1988 г., Бюллетень №20, с. 112, приоритет от 01.04.1986 г.). В 1993 году это авторское свидетельство было переоформлено в патент на изобретение РФ №1414871. В соответствии со статьей (Лабораторное дело. - 1990. - №8. – С. 65-67) выделение и идентификацию P.aeruginosa осуществляют путем посева исследуемого материала на питательную среду «Pseudomonas APS», содержащую сухой питательный агар из рыбного гидролизата (производства Дагестанского НИИ питательных сред) 35,0 г, оксафенамид (п-оксифенилсалициламид) 1,0-1,2 г, растворенный в 10-12 мл диметилсульфоксида, воду дистиллированную до 1 л, рН 7,2±0,2. Приготовление среды: в стерильную колбу вносят 200 мл расплавленного питательного агара (приготовленного на основе 35 г сухого питательного агара из рыбного гидролизата в 1 л дистиллированной воды), добавляют 2,2 мл 10-процентного раствора оксафенамида в диметилсульфоксиде (раствор оксафенамида готовят путем растирания 1 г оксафенамида в ступке с 9 мл диметилсульфоксида),перемешивают, разливают в стерильные чашки Петри; готовая среда прозрачная, светло-серого цвета, пригодна 10 суток при хранении от 4°С до 8°С. Исследуемый материал засевают на поверхность среды петлей или ватным тампоном (можно засевать на % часть чашки), инкубируют аэробно 16-24 ч при 42°С и(или) 35°С, затем учитывают результат. Наличие колоний бактерий, выросших при 42°С, указывает на их принадлежность к виду P. aeruginosa. Бактерии, выросшие при 35°С, принадлежат к P. aeruginosa при наличии нитратредуктазы, определяемой микрообъемным методом в течение 3 ч, или принадлежат к виду Р. putida при отсутствии нитратредуктазы. Среда «Pseudomonas APS» имеет высокую аналитическую чувствительность: минимальное количество КОЕ инокулята, которое обеспечивает выявление колоний через 24 ч инкубации, составило для P. aeruginosa при 35°С 1-8, при 42°С 2-12; для P.putida при 35°С 2-50. Диагностическая чувствительность среды превышала чувствительность традиционного метода с использованием кровяного агара. Бактерии других видов на этой среде не росли.

Известна также отечественная питательная среда «ЦПХ-агар» для выделения синегнойной палочки (www.microgen.ru/products/pitatelnye-sredy/pitatelnaya-sreda-dlya-vydeleniya-sinegnoynoy-palochki-sukhaya-tspkh-agar/). Состав среды (г/л): пептон сухой ферментативный для бактериологических целей 20,0; агар микробиологический 8,0±1,0; калий сернокислый 7,6; магний сернокислый 7-водный 2,4; сода кальцинированная 1,0; фенозан-кислота 0,2; N-цетилпиридиний хлористый 1-водный 0,3. Все ингредиенты вносят в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин до расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, не стерилизуют, разливают в стерильные чашки Петри. Среда непрозрачная, желтого цвета, срок хранения 15 суток от 2°С до 8°С. Посевы исследуемого материала инкубируют при 37°С в течение 24-48 ч. Наряду с колониями синегнойной палочки на среде возможен рост колоний энтерококков, клебсиелл, провиденций. Аналитическая чувствительность среды низкая 10⁴-10⁵ КОЕ. ЦПХ-агар производит ФГУП НПО «Микроген» Минздрава РФ (г.Махачкала).

Известна отечественная селективная среда с ацетамидом для выделения P. aeruginosa (Приказ Министерства здравоохранения СССР от 22.04.1985 г. №535 «Об унификации микробиологических(бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». Приложение 1. - М. 1985). Среда содержит: натрий хлористый 5,0 г; магний сернокислый 0,2 г; аммоний фосфорнокислый однозамещенный 1,0; калий фосфорнокислый двузамещенный 1,0; ацетамид 20,0; агар 15,0; вода дистиллированная 1 л; рН 6,7-6,8. Все ингредиенты смешивают, кипятят до расплавления агара, стерилизуют при 121°С 20 мин, разливают в чашки Петри. Посевы материала выращивают при 42°С в течение 24-48 ч. Кроме синегнойной палочки возможен рост других видов псевдомонад и провиденций. Аналитическая чувствительность низкая - 10³ КОЕ. Ацетамид - сильный канцероген. Питательная среда с ацетамидом не производится.

Известно, что многие зарубежные фирмы производят питательные среды с цетримидом для селективного выделения P. aeruginosa. Так, среди питательных сред «PRONADISA», производимых компанией Laboratories Conda S.A., Spain, известна селективная среда «Cetrimide agar base european pharmacopoeia, usp» (https://www.condalab.com/1102.pdf). Она содержит: панкреатический перевар желатина 20,0; калий сернокислый 10,0; магний хлористый 1,4; цетримид 0,3; агар 13.6; глицерин 10 мл; вода дистиллированная 1 л. Все ингредиенты растворяют при нагревании и стерилизуют при 121°С 15 мин. Посевы исследуемого материала выращивают аэробно при 30°-35°С в течение 18-72 ч. Идентифицируют бактерии P. aeruginosa по морфологии колоний, наличию пиоцианина, характерному запаху. Питательные среды с цетримидом имеют низкую аналитическую чувствительность, поэтому исследуемый инокулят должен содержать не менее 10³-10^{5 КОЕ/мл. На среде с цетримидом возможен рост некоторых штаммов клебсиелл, серраций, поэтому ряд фирм добавляют в среду налидиксовую кислоту (15 мг/л).}

Известна отечественная коммерческая «селективная питательная среда для выделения псевдомонад, сухая» (патент на изобретение РФ №2530549; авторы Храмов М.В., Шепелин А.П., Полосенко О.В., Марчихина И.И., Шолохова Л.П., Мартовецкий М.Н., опубликовано 10.10.2014, приоритет от 23.05.2013 г.). Питательная среда содержит, г/л: панкреатический гидролизат казеина 10,0±2,0; пептон мясной 10,0±2,0; дрожжевой экстракт 2.0±0,5; натрий хлористый 5,0±1,0; калий фосфорнокислый двузамещенный 1,0±0,1; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,0±0.1; магний сернокислый 1,5±0,1; цетримид (hexadecyltrimethylammonium bromide) 0,3±0,05; агар бактериологический 10,0±3,0; натрий углекислый 0,3±0,1; налидиксовая кислота 0,01±0,002; глицерин 10,0±2,0; дистиллированная вода до 1 л. Аналитическая чувствительность среды 10³-10⁴ КОЕ/мл.

Известна также коммерческая селективная среда с иргазаном для выделения P. aeruginosa «BD Pseudomonas Isolation Agar» производства фирмы Becton Dickinson GmbH, Germany. В соответствии с инструкцией по ее применению (http://www.ВDРsеudоmоnаsIsоlаtiоnАqаrИнструкция) среда содержит: пептон Bacto 20,0 г; магния хлорид 1,4 г; калия сульфат 10,0; иргазан 0,025 г; агар 13,6; глицерин 20,0 мл; рН 7,0±0,2. Исследуемый материал засевают петлей на поверхность среды, инкубируют аэробно при 35°С 18-48 ч. Колонии синегнойной палочки выявляют по продукции пиоцианина. На среде возможен также рост колоний других видов псевдомонад, энтеробактерий, аэромонад, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia. Для идентификации P. aeruginosa требуются дополнительные исследования.

Прототипом заявляемого способа нами избран способ с использованием селективной питательной среды «Pseudomonas APS» (Сиволодский Е.П. Лабораторное дело. - 1990. - №8. - С. 65-67), так как в обоих способах выделение и идентификацию P. aeruginosa проводят на питательных средах с одинаковым селективным агентом осалмидом (CAS 526-18-1, оксафенамид), а различия отличительных признаков относятся только к источникам азота, углерода и солевой основе питательных сред.

Недостатком прототипного способа является отсутствие стандартности состава селективной питательной среды в связи с неопределенным составом питательного агара из рыбного гидролизата, используемого в качестве источника азота и углерода.

Недостатками других аналогов также является отсутствие стандартности состава источников азота и углерода питательных сред: в аналоге со средой «ЦПХ-агар» используют пептон ферментативный; в аналоге со средой «Cetrimide agar base european pharmacopoeia, usp» применяют панкреатический перевар желатина; в аналоге по патенту РФ №2530549 в цетримид-агаре используют панкреатический гидролизат казеина, пептон мясной, дрожжевой экстракт; в аналоге «BD Pseudomonas Isolation Agar» в среде с иргазаном применяют пептон Bacto; в аналоге селективной среды с ацетамидом используют минеральный источник азота - аммоний фосфорнокислый однозамещенный, источником углерода является селективный агент ацетамид. Все указанные аналоги имеют также недостаточную селективность.

Целью изобретения является повышение стандартности исследования по выделению и идентификации бактерий P. aeruginosa. Повышение стандартности исследования состоит в достижении полной определенности и постоянства состава селективной питательной среды, используемой для выделения и идентификации бактерий вида P. aeruginosa, при сохранении ее высоких диагностических характеристик.

В соответствии с изобретением решение указанной технической задачи достигается тем, что исследуемый материал засевают на питательную среду, содержащую в качестве источника азота и углерода L-глютамат натрия, L-пролин; маннитол; осалмид (САS 526-18-1), растворенный в диметилсульфоксиде, NaCl, Na₂SO₄, MgSO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄; агар микробиологический, дистиллированную воду при следующем содержании ингредиентов: L-глютамат натрия 5,0-6,0 г; L-пролин 2,0-2,5 г; маннитол 5,0-6,0 г; осалмид (CAS 526-18-1) 1,0-1,2 г; диметилсульфоксид 10,0-12,0 мл; NaCl 5,0 г; Na₂SO₄ 2,0 г; MgSO₄ 0,1 г; KH₂PO₄ 0,5 г; K₂HPO₄ 2,0 г; агар микробиологический 12,0 г; вода дистиллированная 1 л; рН 7,2±0,2; при этом все ингредиенты, кроме суплемента осалмида (10-12 мл 10-процентного раствора осалмида в диметилсульфоксиде), растворяют при нагревании, кипятят 5 мин, добавляют осалмид, разливают в стерильные чашки Петри; посевы инкубируют в аэробных условиях при 42°С 24 ч, затем определяют принадлежность бактерий к виду P. aeruginosa только по наличию выросших колоний или газона бактерий. Примечание: бактериологический контроль качества питательной среды заявляемого способа проводят при изготовлении среды; для положительного контроля используют типовой штамм Pseudomonas aeruginosa АТСС 10145 в посевной дозе 10-10² КОЕ/мл^-1; для отрицательного контроля применяют клинические штаммы Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Staphylococcus aureus в посевной дозе 10⁶ КОЕ/мл^-1; исследование проводят по методике заявляемого способа. Среда пригодна к использованию при наличии роста синегнойной палочки (не менее 30% КОЕ) и отсутствии роста прочих контрольных бактерий. Питательная среда в чашках Петри бесцветная, прозрачная, срок хранения 1 месяц при температуре от 4° до 8°С.

Отличительный существенный признак способа - использование в питательной среде L-глютамата натрия 5,0-6,0 г/л и L-пролина 2,0-2,5 г/л в качестве источника азота и углерода. Этот признак не применялся в прототипе и аналогах. Он не следует явным образом из уровня техники. Для каждого вида бактерий необходимо конкретное экспериментальное обоснование пригодности указанного признака. Так, в состав синтетической питательной среды для идентификации бактерий рода Pseudomonas (патент РФ на изобретение №2373287) входит L-глютамат натрия 1,0-3,0 и L-пролин 1,0-3,0, при этом исследование проводится при 28°С. Это сочетание аминокислот, обеспечивающее рост штаммов всех видов псевдомонад, было получено на основании экспериментального изучения профилей утилизации 20 белковых аминокислот в качестве единственного источника азота и углерода при температуре 28°С.Данных о профилях утилизации аминокислот псевдомонад при 42°С нет. Мы впервые изучили при 42°С профили утилизации 20 белковых аминокислот в качестве единственного источника азота и углерода у бактерий различных видов певдомонад, способных расти при 42°С на питательном агаре из рыбного гидролизата: 80 штаммов P. aeruginosa, по 3 штамма P. stutzeri, P. luteola, P. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes (неопубликованные данные). Установлено, что только сочетание L-глютамата натрия и L-пролина обеспечивало рост всех изученных штаммов псевдомонад, а концентрации их, указанные в заявке, определяют оптимальный пышный рост бактерий. Установлено также, что селективный агент осалмид 1,0-1,2 г/л в синтетической среде с указанными аминокислотами обеспечивал при 42°С пышный рост всех штаммов P. aeruginosa при полном подавлении роста остальных видов псевдомонад. При этом аналитическая чувствительность синтетической среды составляет 2-15 КОЕ/мл^-1 P. aeruginosa. Этот отличительный существенный признак непосредственно определяет решение поставленной технической задачи: повышается стандартность исследования ввиду замены сухого питательного агара из естестственного сырья неопределенного состава (гидролизата рыбы) питательной среды прототипа аминокислотами L-глютаматом натрия и L-пролином известного химического строения в известном количестве, то есть создается и используется синтетическая среда строго определенного состава. При этом синтетическая селективная питательная среда заявляемого способа сохраняет высокую аналитическую чувствительность и селективность питательной среды прототипа.

Второй отличительный существенный признак - использование в составе питательной среды маннитола 5,0-6,0 г/л. Нами неожиданно было установлено, что маннитол является лучшим кристаллопротектором среди изученных веществ (глицерин, глюкоза, арабиноза). Он препятствует появлению кристаллов солей в питательной среде при длительном хранении чашек со средой в холодильнике от 4°С до 8°С. Маннитол также является дополнительным источником углерода для P. aeruginosa, обеспечивая рост более крупных колоний.

Третий отличительный существенный признак - использование в составе питательной среды дополнительного комплекса минеральных солей: Na₂SO₄ 2,0 г; MgSO₄ 0,1 г; KH₂PO₄ 0,5 г; K₂HPO₄ 2,0 г на 1 л дистиллированной воды. Эти соли необходимы для обеспечения утилизации L-глютамата натрия и L-пролина в составе синтетической среды и создания оптимальной рН среды. Количество соли магния, который индуцирует синтез пиоцианина и пиовердина, специально снижено в 15 раз по сравнению с известными средами с цетримидом и иргазаном, так как для идентификации синегнойной палочки на питательной среде заявляемого способа продукция этих пигментов не имеет значения. Однако, при этом существенно повышается аналитическая чувствительность питательной среды заявляемого способа.

Существенными признаками способа являются селективный агент, температурный режим, время исследования. Селективный агент питательной среды заявляемого способа - осалмид (CAS 526-18-1, оксафенамид), лекарственный желчегонный препарат, нерастворим в воде, растворим в диметилсульфоксиде. Он используется для приготовления питательной среды в виде 10-процентного раствора в диметилсульфоксиде. На питательной среде заявляемого способа при 28°С и 35°С осалмид подавлял рост бактерий 42 видов 23 родов, кроме P. aeruginosa и бактерий группы P. putida. При 42°С на питательной среде заявляемого способа наблюдался пышный рост только синегнойной палочки при отсутствии роста всех остальных видов бактерий, способных расти при 42°С на питательном агаре из гидролизата рыбы: Pseudomonas stutzeri, P. luteola, P. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes, Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, Alcaligenes faecalis, Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter xylosoxydans, Shewanella algae, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Klebsiella mobilis, Providencia rettgeri, Enterobacter cloacae, Hafnia alvei, Raoultella planticola, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis. Поэтому целесообразно выращивать посевы исследуемого материала при 42°С, что обеспечивает через 24 ч рост только колоний синегнойной палочки и ее окончательную идентификацию по этому признаку без дополнительных тестов.

Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа

Пример 1. Исследуемый материал - отделяемое раны засевают петлей из пробы №1 на сектор питательной среды заявляемого способа (1/4 часть чашки Петри), на остальные секторы засевают материал из проб №2, 3, 4. Состав и приготовление питательной среды заявляемого способа указаны в примечании к примеру. Посевы инкубируют в аэробных условиях при 42°С в течение 24 ч, затем учитывают результат. На секторах №2, 3, 4 нет роста бактерий. На секторе пробы №1 имеются отдельные колонии бактерий диаметром 2-3 мм и газон бактерий желто-зеленного цвета, что указывает на принадлежность выросших бактерий к виду P. aeruginosa. Контрольная идентификация выделенных бактерий традиционными культуральными и биохимическими тестами показала их принадлежность к P. aeruginosa.

Примечание к примеру 1. Методика приготовления питательной среды заявлямого способа. В 1 л дистиллированной воды вносят, г/л: L-глютамат натрия 5,0; L-пролин 2,0; маннитол 5,0; NaCl 5,0; Na₂SO₄ 2,0; MgSO₄ 0,1; KH₂PO₄ 0,5; K₂HPO₄ 2,0; агар микробиологический 12,0; растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, добавляют осалмид (CAS 526-18-1) 1,0 (10 мл 10-процентного раствора осалмида в диметилсульфоксиде); проверяют рН 7,2±0,2, разливают в стерильные чашки Петри. Среда бесцветная, прозрачная, пригодна 30 суток при хранении от 4°С до 8°С. Контроль питательной среды: наличие при посеве по методике заявляемого способа контрольного штамма P. aeruginosa АТСС 10145 в посевной дозе 10-10² КОЕ/мл^-1 роста колоний P. aeruginosa не менее 30% от посевной дозы; отсутствие роста бактерий контрольных клинических штаммов Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Staphylococcus aureus при при посеве в посевной дозе 10⁶ КОЕ/мл^-1.

Пример 2. Исследуемый материал - мочу больного в разведении 10^-3 0,1 мл засевают шпателем на поверхность питательной среды заявляемого способа, содержащей на 1 л дистиллированной воды, г/л: L-глютамат натрия 6,0; L-пролин 2,5; маннитол 6,0; осалмид 1,2 в 12 мл диметилсульфоксида; остальные ингредиенты по примечанию к примеру 1; посевы инкубируют аэробно при 42°С в течение 24 ч, после чего учитывают результат: на поверхности питательной среды в чашке Петри выросли 48 колоний бактерий диаметром 2-3 мм, плоских, желто-зеленой окраски, что указывает на их принадлежность к виду P. aeruginosa; с учетом разведения мочи количество бактерий P. aeruginosa в моче составляет 4,8×10⁵ КОЕ/мл. Контрольная идентификация выделенных бактерий традиционными культуральными и биохимическими тестами подтвердила их принадлежность к синегнойной палочке.

Таким образом, при всех предельных концентрациях основных ингредиентов питательной среды заявляемого способа (L-глютамат натрия 5,0-6,0 г/л; L-пролин 2,0-2,5 г/л; маннитол 5,0-6,0 г/л; осалмид 1,0-1,2 г/л) получены четкие результаты выявления, одноэтапной окончательной идентификации и количественного учета бактерий вида P. aeruginosa.

Изучение в клинико-диагностической лаборатории диагностической чувствительности и специфичности заявляемого способа и прототипа с использованием питательной среды «Pseudomonas APS» показало их равную диагностическую чувствительноть (из 200 проб клинического материала выделена синегнойная палочка в 16 пробах) и специфичность 100% (не выявлено ложно-положительнных штаммов бактерий P. aeruginosa).

Селективная синтетическая среда заявляемого способа подавляет рост грамположительных бактерий, в том числе аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus, поэтому не требует стерилизации в паровом стерилизаторе.