Эфиры янтарной кислоты 5-гидроксиадамантан-2-она, улучшающие кровоснабжение ишемизированного мозга

Изобретение относится к химии биологически активных веществ, обладающих цереброваскулярной противоишемической активностью, общей формулы:

I а, б, где: I a R=H; I б R=5-адамантан-2-он.

Заявляемые соединения синтезированы впервые.

Среди производных адамантана выявлены блокаторы глутаматных рецепторов, широко используемые в неврологической практике. Так, амантадин применяется при лечении болезни Паркинсона [M.F. Kraus, P.M. Maki, Effect of amantadine hydrochloride on symptoms of frontal lobe dysfunction in brain injury: case studies and review. J. Neuropsychiatry Clin. Neurosci., 1997, 9, 222-230; L.V. Kalia, S.K Kalia, M.W. Salter, NMDA receptors in clinical neurology: excitatory times ahead. Lancet Neurol., 2008, 7, 8, 742-755], a мемантин - при цереброваскулярных расстройствах с целью улучшения когнитивных функций [C.E. Heim, К.Н. Sontag, Memantine prevents progressive functional neurodegeneration in rats. J. Neural. Transm. Suppl., 1995, 46, 117-130; C.G. Parsons, K. Gilling, Memantine as an example of a fast, voltage-dependent, open channel N-methyl-D-aspartate receptor blocker. Methods Mol. Biol., 2007, 403, 15-36]. Разработанное в нашем Институте противопаркинсоническое средство-гимантан находится на стадии клинических исследований [И.С. Морозов, Е.А. Вальдман, Т.А. Воронина и др. Антикаталептическая активность гетероциклических производных 2-аминоадамантана. Химико-фармацевтический журнал, 2000, 34, 4, 27-30; Е.А. Вальдман, Разработка фармакологического средства патогенетической терапии паркинсонизма на основе анализа механизмов действия производных аминоадамантанов: дис. д-ра мед. наук: 14.00.25. М., 2001, 325 с.].

Производное 2-гексаметилениминоадамантана в виде хлористоводородной соли проявляет нейропротекторные свойства [Т.С. Ганьшина, Е.В. Курза, Д.В. Масленников и др. Анализ механизма цереброваскулярного эффекта гимантана, Экспериментальная и клиническая фармакология, 2015, 78, 10, 3-6]. Эти соединения содержат в своей структуре атом азота в отличие от заявляемых соединений, в молекуле которых присутствуют только кислородсодержащие заместители.

Наиболее близкими аналогами заявляемых соединений по структуре является 5-ацетооксиадамантан-2-он (стимантан), обладающий иммуностимулирующим действием [Н.Г. Арцимович, Т.А. Фадеева, Ю.А. Шалыминова, Н.В. Климова и др. 1-Ацетокси-адамантан-4-он, проявляющий иммуностимулирующую активность. Авторское свидетельство СССР №583607, 1977]. Однако экспериментально установлено, что стимантан не проявляет цереброваскулярной активности. Аналогом по фармакологическому действию можно считать 5-гидроксиадамантан-2-он (кемантан), который проявляет иммуномодулирующие свойства и оказывает положительное влияние при лечении заболеваний сосудистой системы конечностей аутоиммунного генеза [Н.Г. Арцимович, Т.А. Фадеева, Т.С. Галушина. Экспериментальное изучение иммунотропной активности нового лекарственного препарата кемантана. Иммунология, 1990, 6, 21-23; И.Е. Ковалев, В.М. Кошкин, Н.В. Шипулина, Е.И. Румянцева, Производное адамантана как принципиально новое средство терапии хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей. Химико-фармацевтический журнал, 2004, 38, 3, 3-5; Н.И. Авдюнина, А.В. Толкачева, Л.Н, Грушевская и др. Разработка технологии синтеза и контроля качества иммунотропного препарата Кемантан. Химико-фармацевтический журнал, 2016, 50, 1, 39-41]. Вместе с тем, 5-гидроксиадамантан-2-он значительно усиливает кровоснабжение мозга животных в условиях глобальной преходящей ишемии, понижая при этом уровень артериального давления [Р.С. Мирзоян, Т.С. Ганыпина, Д.В. Масленников, А.И. Турилова, Н.И., Авдюнина, Б.М. Пятин. Производное адамантана усиливает кровоснабжение ишемизированного мозга. Экспериментальная и клиническая фармакология, 2012, 75, 6, 27-30; R.S. Mirzoyan, T.S. Ganshina, A.V. Gnesdilova, D.V. Maslennikov, Cerebrovascular Pharmacology of combined and separate ischemic pathology of brain and heart. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, Nordic Pharmacological Society Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 2014, 115 (Suppl.1), 12-13]. Наличие гипотензивного эффекта, т.е. понижение церебрального перфузионного давления, является нежелательным компонентом действия такого препарата.

Заявляемые соединения Iа и Iб проявляют сопоставимую цереброваскулярную активность с 5-гидроксиадамантан-2-оном в дозе 100 мг/кг при внутривенном введении. Длительность цереброваскулярного эффекта составляет 2 часа. Кроме того, заявляемые соединения не понижают уровень артериального давления. Цереброваскулярный эффект соединения 1а по своей силе и длительности близок к эффекту 5- гидроксиадамантан-2-она. Однако у него отсутствует гипотензивный эффект, характерный для последнего. LD₅₀ соединения Iб при внутривенном введении у крыс составляет 210,0 (165,9÷254,1) мг/кг, а соединения Ia - 740,0 (676,0÷804,0)мг/кг. Отличительной особенностью настоящего изобретения является отсутствие в спектре действия предлагаемых соединений гипотензивной активности. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения цереброваскулярных расстройств.

Результатом применения предлагаемых соединений является проявление ими избирательной цереброваскулярной активности и отсутствие гипотензивного эффекта, характерного для известных препаратов, применяемых при лечении больных с нарушениями мозгового кровообращения - нимодипина, мексидола, пикамилона, циннаризина и кавинтона.

Анализ литературных данных показал, что заявляемые соединения в литературе не описаны и их биологическая активность не изучалась.

Цель изобретения: изыскание новых биологически активных соединений в ряду адамантана, обладающих цереброваскулярной противоишемической активностью и не проявляющих гипотензивного эффекта.

Поставленная цель достигается синтезом эфиров янтарной кислоты 5-гидроксиадамантан-2-она, показавших в эксперименте высокую цереброваскулярную активность.

Способ получения заявляемых соединений заключается во взаимодействии 5-гидроксиадамантан-2-она с ангидридом (соединение Iа) или хлорангидридом янтарной кислоты (соединение Iб) при кипячении в апротонном растворителе, например в толуоле. Контроль за протеканием реакции осуществляется методом ТСХ на пластинках Кизельгель 60 F₂₅₄ (Merck) в системе растворителей гексан-этилацетат-этанол конц. раствор аммиака в соотношении (5:3:1:1) или (5:3:2:1), проявление парами йода.

Заявляемые соединения представляют собой белые или почти белые кристаллические вещества, растворимые в спиртах, мало растворимы (Iа) и нерастворимы (Iб) в воде.

Целевые соединения получаются с высоким выходом и высокой степени чистоты.

Строение и индивидуальность заявляемых соединений доказано ИК- и ЯМР¹Н спектрами и данными элементного анализа. В ИК-спектрах заявляемых соединений, снятых в КВr, имеются характеристические полосы поглощения карбонильной и карбоксильных групп (сложноэфирной, кетонной и кислотной) в области 1729-1715 и 1685 см^-1, валентные колебания атома водорода гидроксильной группы - при 3430 см^-1. Полосы поглощения, характерные адамантановому циклу (С-Н), наблюдаются в области 2930-2840 см^-1. В спектре ЯМР¹Н спектре соединения Iа наблюдается синглетный сигнал (~15 м.д), принадлежащий протону гидроксила кислотной группы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Смесь 4,15 г (0,025 моль) 5-гидроксиадамантан-2-она, 3,03 г (0,030 моль) ангидрида янтарной кислоты и 0,15 мл концентрированной серной кислоты в 40 мл сухого толуола кипятят 10 ч. По окончании реакции охлажденную реакционную массу фильтруют. Осадок промывают 10 мл сухого толуола. К полученному фильтрату добавляют 25 мл гексана и оставляют при периодическом перемешивании при 0+5°С на 10-12 ч. Выпавший осадок Iа отфильтровывают, промывают 2×15 мл гексана, затем высушивают при 80°С в течение 2-3 часов. Белый кристаллический порошок с т. пл. 113-115°С (из этилацетата). Выход моноэфира янтарной кислоты 5-гидроксиадамантан-2-она (Iа)_4,5 г (70%); Rf 0,05.

Найдено, %: С 63,17; Н 6,96; С₁₄Н₁₈O₅.

Вычислено,%: С 63,14; Н 6,81.

Спектр ЯМР¹Н (ДМСОd₆, δ, м.д): 1,75-2,02 (4Н, м, H-Ad); 2,17-2,55 (13Н, м, 9H-Ad и 4Н (СН₂)₂); ~ 15(1Н, ОН-кислоты).

Пример 2. Кипятят смесь 10,00 г (0,06 моль) 5-гидроксиадамантан-2-она, 5,20 г (3,7 мл, 0,033 моль) дихлорангидрида янтарной кислоты в 35 мл сухого толуола в течение 10,5 ч. По окончании реакции толуол отгоняют, к остатку прибавляют 30 мл воды. Образовавшийся осадок отфильтровывают, многократно промывают водой. Высушивают Iб до постоянного веса при 80-85°С. Белый кристаллический порошок с т. пл. 154-156°С (из этилацетата). Выход сукцината 5-гидроксиадамантан-2-она (Iб) 11,00 г (90%). Rf 0,45.

Найдено, %: С 69,32; Н 7,07. С₂₄Н₃₀O₆.

Вычислено,%: С 69,54; Н 7,30;

ЯМР¹Н (ДМСО d₆; δ, м.д.): 1,76-2,03 (8Н, м, H-Ad), 2,18-2,37 (14Н, м, 10Н-Ad и 4Н-(СН₂)₂; 2,38-2,54 (8Н,м, H-Ad).

Фармакологическое изучение заявляемых соединений Iа и Iб.

Для оценки фармакологических эффектов заявляемых соединений были использованы базисные сертифицированные методики, рекомендуемые Фармакологическим комитетом МЗ РФ для исследования веществ, обладающих цереброваскулярным и противоишемическим эффектами (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению веществ с фармакологической активностью. М., Гриф и К, 2012, с. 255, с. 485).

Фармакологическая активность заявляемых соединений изучена в сравнении с аналогами по строению (5-гидроксиадамантан-2-оном и янтарной кислотой) и действию - нимодипином. Изучено влияние заявляемых соединений на кровоснабжение мозга крыс в условиях его экспериментального ишемического поражения, которое моделировали с помощью глобальной преходящей ишемии головного мозга.

Опыты выполнены на 90 наркотизированных (хлоралгидрат 350-400 мг/кг, внутрибрюшинно) нелинейных крысах-самцах массой 250-300 г.

Состояние мозгового кровообращения оценивали с помощью методики лазерной допплеровской флоуметрии в теменной области коры головного мозга крыс с использованием флоуметра ALF-21 фирмы "Transonic System Inc." (США). Одновременно регистрировали изменения артериального давления через предварительно введенный в бедренную артерию полиэтиленовый катетер. Запись показателей кровотока и артериального давления производили на полиграфе фирмы «BIOPAK» США, соединенном с персональным компьютером. Глобальную ишемию у крыс вызывали 10-минутной окклюзией обеих общих сонных артерий с одновременным снижением артериального давления до 40-50 мм рт.ст. методом кровопускания и последующей реинфузией. Исследуемые вещества вводили через полиэтиленовый катетер в бедренную вену животных.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistika 8,0 (Statistika Inc., США). Нормальность распределения определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для дальнейшей обработки данных использовали непараметрический двухвыборочный знаково-ранговый критерий Вилкоксона. Средние данные в тексте представлены в виде медианы. Результаты рассматривали как значимые при р≤0,05.

Влияние эфиров янтарной кислоты 5-гидроксиадамантан-2-она и их аналогов на мозговое кровообращение крыс, перенесших глобальную преходящую ишемию.

Соединение Iб в дозе 100 мг/кг при внутривенном введении наркотизированным крысам в условиях глобальной преходящей ишемии мозга вызывает медленно нарастающее увеличение мозгового кровотока. Изменения кровотока после введения соединения наблюдаются с 10 минуты, затем постепенно усиливаются, достигая максимума на 70-й минуте - 47,6%. Уровень артериального давления под влиянием Iб в этих опытах статистически значимо не изменялся. Следует отметить, что Iб оказывает избирательное сосудорасширяющее влияние на тонус сосудов ишемизированного мозга. Изучение острой токсичности Iб, которое проводили на бодрствующих крысах при внутривенном введении, показало, что LD₅₀ этого соединения составляет 210,0 (165,9÷254,1) мг/кг.

Соединение Iа в дозе 100 мг/кг у наркотизированных крыс в условиях глобальной преходящей ишемии мозга через 10 минут после введения вызывает увеличение локального кровотока в коре в среднем на 25%. Сосудорасширяющий эффект этого производного усиливается со временем и к 80 минуте достигает максимума, составляя 59,3%. Уровень артериального давления под влиянием Iа в этих опытах сразу после введения статистически значимо повышается в среднем на 16,5%, через 10 минут - на 10,6% и через 30 минут на 5,3%, затем понижается до исходного уровня и сохраняется до конца эксперимента. Следовательно, длительное и постепенно развивающееся увеличение мозгового кровотока не обусловлено гипертензивной реакцией на введение производного адамантана, т.к. повышение давления наблюдается в начале эксперимента, а цереброваскулярный эффект нарастает к 80 минуте и более, а артериальное давление соответствует контрольному уровню.

Изучение острой токсичности Iа, которое проводили на бодрствующих крысах при внутривенном введении, показало, что LD₅₀ этого соединения составляет 740,0 (676,0÷804,0) мг/кг.

Далее были изучены препараты сравнения 5-гидроксиадамантан-2-он, янтарная кислота и нимодипин.

Опыты показали, что 5-гидроксиадамантан-2-он в дозе 100 мг/кг при внутривенном введении вызывает медленно развивающееся увеличение локального мозгового кровотока, которое к 60 минуте достигает максимального значения (76,5%). Кровоток сохраняется выше исходного уровня до конца эксперимента (90 минут). Здесь следует подчеркнуть, что уровень артериального давления под влиянием этого производного адамантана у крыс в условиях ишемического поражения мозга снижается в среднем на 11%.

Янтарная кислота в дозе 100 мг/кг при внутривенном введении в условиях глобальной преходящей ишемии сразу же после введения вызывает кратковременное увеличение локального мозгового кровотока, которое в течение первых 10 минут составляет в среднем 18%. Далее отмечается восстановление исходного уровня мозгового кровотока, который затем продолжает постепенно снижаться, составляя к 50-60 минутам 15% от исходного уровня. На первых минутах после введения янтарной кислоты имеет место повышение уровня артериального давления в среднем на 11%, к 10 минуте после введения препарата отмечается восстановление артериального давления, которое затем постепенно снижается. Следовательно, наблюдаются параллельные изменения локального мозгового кровотока и артериального давления, что указывает на отсутствие непосредственного влияния янтарной кислоты на тонус сосудов мозга.

Нимодипин (0,03 мг/кг) у животных после глобальной преходящей ишемии головного мозга сразу после введения кратковременно увеличивает локальный мозговой кровоток в среднем на 44,3%. Затем кровоток постепенно понижается, но остается повышенным до конца эксперимента (14%). Препарат у животных в этих условиях вызывает снижение уровня артериального давления в среднем на 39,6%.

Таким образом, соединение Iа существенно и продолжительно усиливает кровоснабжение ишемизированного мозга, не понижая уровень артериального давления, что его выгодно отличает от аналогов и по строению, и по действию. Следует также отметить, что соединение Iа менее токсично, чем соединение Iб.

Изучение механизма цереброваскулярного эффекта соединений Iа и Iб

Далее в работе был проведен анализ цереброваскулярного механизма эфиров янтарной кислоты 5-гидроксиадамантан-2-она. Поскольку ГАМК-ергические механизмы играют важную роль в регуляции тонуса сосудов мозга, можно допустить, что в реализации цереброваскулярной противоишемической активности заявляемых соединений эти механизмы также принимают участие.

Было изучено влияние соединения Iа (100 мг/, внутривенно) на локальный мозговой кровоток в коре головного мозга крыс после глобальной преходящей ишемии и на фоне действия блокатора ГАМК_А-рецепторов бикукуллина (50 мкг/кг, внутривенно, фирма «Sigma»). Опыты показали, что в этих условиях соединение Iа вызывает незначительное и непродолжительное (3,7% на 30 минуте) увеличение кровотока в коре. Следует отметить, что в контрольных опытах данное производное адамантана вызывает длительное увеличение кровотока, которое к 90 минуте составляет 53,9% от исходного уровня. Уровень артериального давления в этих экспериментах сразу после введения Iа начинает понижаться и к 60 минуте составляет 10,9% от исходного уровня. В контрольных опытах артериальное давление под влиянием соединения Iа сначала немного (на 5,6%) повышается, а затем снижается до исходного уровня.

Изучение влияния Iб на локальный кровоток в коре головного мозга крыс после глобальной преходящей ишемии и бикукуллина показало, что в этих условиях соединение Iб, в отличие от контрольных опытов, не вызывает увеличения мозгового кровотока, т.е. цереброваскулярный эффект соединения на фоне действия бикукуллина полностью блокируется. Уровень артериального давления в этих экспериментах сразу после введения Iб незначимо понижается и к 60 минуте составляет 9,7% от исходного состояния. Полученные данные указывают на участие ГАМК-ергического механизма в реализации цереброваскулярного эффекта заявляемых соединений.

Далее для уточнения механизма ГАМК-ергического компонента в реализации цереброваскулярного эффекта заявляемых соединений методом радиолигандного анализа in vitro было изучено влияние Iа и Iб и 5-гидроксиадамантан-2-она на взаимодействие с ГАМК_А-рецепторами мембран мозга крыс с использованием специфического связывания лиганда [³H]-SR 95531 (габазина). Радиорецепторный анализ влияния веществ на специфическое связывание проводили по модифицированным методам, опубликованным ранее [Р.С. Мирзоян, Т.С. Ганьшина, А.В. Гнездилова, Г.И. Ковалев, Ю.Ю. Фирстова, В.В. Безуглов, Н.М. Грецкая. ГАМК-ергический компонент в механизме цереброваскулярного противоишемического эффекта докозагексаеновой кислоты. Экспериментальная и клиническая фармакология, 2015, 78, 1, 16-20]. Для приготовления мембранных препаратов, содержащих ГАМК_А-рецепторы фронтальной коры мозга крыс, было использовано 15 нелинейных крыс-самцов. Радиоактивность каждой пробы измеряли на сцинтилляционном счетчике Tri-Carb 2900 TR (PerkinElmer) с эффективностью счета 42-45%. Результаты обрабатывали с помощью программы GraphPad 5.0 Prizm.

Проведенные опыты показали, что соединения Iа и Iб, а также 5-гидроксиадамантан-2-он не вступают во взаимодействие с ГАМК_А-рецепторами коры большого мозга. Однако, не располагая данными об идентичности ГАМК_А-рецепторов, расположенных в нервной ткани и сосудах мозга, мы не можем утверждать, что цереброваскулярный противоишемический эффект исследованных веществ, выявленный в опытах in vivo, не обусловлен непосредственным воздействием на одноименные рецепторы церебральных сосудов. Можно также допустить, что обнаруженный эффект в опытах in vivo опосредуется либо через другие рецепторные системы, либо обусловлен непосредственным влиянием веществ на мембраны клеток. Для решения этого вопроса необходимы дополнительные исследования.

Результаты фармакологического изучения заявляемых соединений позволили установить, что соединение Iа и, в меньшей степени, соединение Iб улучшают кровоснабжение мозга у крыс, подвергнутых глобальной преходящей ишемии. Показано было также, что соединение Iа обладает меньшей токсичностью, чем соединение Iб. В опытах in vivo выявлен ГАМК-ергический механизм цереброваскулярного эффекта этих веществ.

Таким образом, соединение Iа обладает значительной цереброваскулярной противоишемической активностью и в отличие от 5-гидроксиадамантан-2-она и нимодипина не понижает, а даже в течение первых 30 минут немного повышает уровень артериального давления. Следует подчеркнуть, что способность препаратов понижать уровень артериального давления, т.е. ослаблять цереброваскулярное перфузионное давление, является существенным фактором, ограничивающим их назначение для лечения больных в острой фазе ишемического инсульта.