Способ получения биопрепарата для обработки растений

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к производству биопрепаратов на основе живых микроорганизмов.

Биологические препараты для растениеводства привлекают к себе все больше внимания со стороны производителей сельскохозяйственной продукции, и их рынок с каждым годом постепенно растет. Низкий рост потребления биотехнологических продуктов такого рода связан не только с определенной «непредсказуемостью» эффекта от использования живых организмов, но и с многими проблемами их промышленного производства и получения товарной формы, удобной для практического применения, особенно при полностью механизированной обработке посевного материала и самих растений в период вегетации на больших площадях сельскохозяйственных угодий.

В настоящее время выделено и описано очень большое число штаммов микроорганизмов, которые могли бы стать основой для биоудобрений, биофунгицидов, биоинсектицидов; многие микробы обладают комплексной биологической активностью по отношению к растениям, но способы получения биопрепаратов для подавляющего большинства из них не разработаны. В этом плане технологии получения биопрепаратов как в жидкой, так и в сухой форме на основе бактерий проработаны лучше, чем аналогичных продуктов на основе мицелиальных грибов. Это объясняется биологией и особенностями жизненного цикла микромицетов, являющихся более высокоорганизованными организмами, по сравнению с бактериями. Поэтому технологические подходы для массового культивирования и наработки биомассы, успешно применяемые для бактерий, не всегда могут быть использованы с той же эффективностью при работе с грибами. При этом отказываться от производства биопрепаратов на основе микроскопических грибов нецелесообразно, так как они в ряде случаев оказываются более эффективными, например, в условиях кислых почв. Давно и с успехом применяются для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов и повышения их продуктивности различные представители рода Trichoderma.

Известен способ производства микробиологических препаратов (Патент РФ №2077204, опубл. 20.04.1997), предусматривающий подготовку посевной культуры микроорганизмов из штамма-продуцента и питательной среды, содержащей водорастворимые углеводы, источник органического азота, соли и воду, внесение посевной культуры в питательную среду, ее культивирование и выделение продукта из культуральной жидкости, отличающийся тем, что питательная среда содержит не менее 2 мас. водорастворимых углеводов и не менее 0,005 мас. аминного азота, при этом общее количество углеводов не превышает 18 мас., а общий азот составляет не более 2,7 мас., при этом возможно использование микроорганизмов видов Trichoderma lignorum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii и смешение культуральной жидкости с созревающим или зрелым биогумусом. Недостатком этого способа является низкий титр получаемых продуктов на основе грибов рода Trichoderma - всего 1-2×10⁷ спор/г, и необходимость введения в культуральную жидкость в процессе или по завершении культивирования дополнительных компонентов, таких как зрелый или созревающий биогумус, стерилизация которого является проблематичной, а отказ от нее приведет к неопределенному микробиологическому составу конечного продукта.

Известен способ защиты растений огурца и томата от фитопатогенов (Патент РФ №2094991, опубл. 10.11.1997) путем обмазки их пастообразным препаратом триходермина на основе гриба Trichoderma harzianum, штамм ВКМ Р-2477Д. Способ получения указанного препарата предполагает выращивание микромицета на увлажненных зернах ячменя или пшеницы в бутылях или банках в течение 5-7 суток, сушку и размол биопрепарата на шаровой мельнице с последующим смешением полученного порошка с водой и карбоксиметилцеллюлозой для получения препарата пастообразной консистенции. Недостатком этого способа является нетехнологичность получения культуры штамма, неизвестный титр препарата, ограниченность применения из-за пастообразной консистенции конечного продукта.

Известен штамм гриба Nectria Pityrodes Montagne, используемый в качестве биофунгицида (варианты), биофунгицид, способ его получения (варианты), способ подавления грибковой инфекции у растений, метод скрининга фунгицидных микроорганизмов (Патент РФ №2154381, опубл. 20.08.2000). Способ получения биопрепарата предполагает по одному из вариантов культивирование гриба в жидкой питательной среде в колбах Эрленмейера 7-12 дней, отделение биомассы и смешение ее с твердым сухим носителем или, по другому варианту, твердофазное культивирование гриба в течение 20 дней. В любом случае после окончания культивирования препарат необходимо высушивать и размалывать до порошкообразного состояния. Недостатком этого способа является низкий титр продукта (10⁷ КОЕ/г), нетехнологичность этапа сушки при комнатной температуре в стерильной атмосфере, требующей при промышленном производстве специально оборудованных больших площадей.

Известен препарат для защиты растений от болезней (Патент РФ №2170511, опубл. 20.07.2001), содержащий активное начало на основе штамма гриба Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray 16 ЦКМ F-59M, карбоксиметилцеллюлозу и соли магния. Способ получения предполагает глубинное культивирование штамма в течение 40 часов до максимального накопления биомассы с последующим отделением остатков питательной среды сепарированием, смешением с карбоксиметилцеллюлозой в качестве прилипателя и хлористым магнием в качестве стабилизатора. Недостатком указанного способа является то, что биомасса штамма представлена в основном мицелием гриба, что требует введения в препарат дополнительных компонентов для получения приемлемой препаративной формы, а также ограничивает срок хранения препарата. Кроме того, неизвестен титр и расходные нормы получаемого продукта.

Известен штамм микромицета Trichoderma viride, шт. 23, обладающий фунгицидными свойствами для получения комплексного биопрепарата со свойствами фунгицида и бактериального удобрения, способ получения комплексного биопрепарата, комплексный биопрепарат со свойствами фунгицида и бактериального удобрения. Способ получения такого биопрепарата предполагает совместное культивирование Trichoderma viride, шт. 23 и Azotobacter chroococcum на твердом субстрате - свекловичном жоме с питательными добавками и микроэлементами. Недостатком данного способа является то, что получаемый в результате его осуществления продукт имеет неопределенную препаративную форму, что ограничивает способы его применения разбрасыванием и поливом при разведении водой. Кроме того, неизвестен срок хранения препарата.

Известен биопрепарат для борьбы с фитопатогенными грибами, возбудителями сосудистых болезней и корневых гнилей растений на основе (Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии D 553 (Патент РФ №2327736, опубл. 27.06.2008) и способы глубинного (Патент РФ №2309589) и твердофазного получения препарата (Патент РФ №2309590, опубл. 10.11.2007). Способ глубинного получения биопрепарата включает выращивание гриба Gliocladium catenulatum путем выращивания посевного материала, инокулюма и биомассы гриба с дальнейшим глубинным выращиванием указанной биомассы в ферментерах в течение 72 часов, после чего в культуральную жидкость добавляют наполнители мел и вермикулит, биомассу с наполнителями сепарируют, сушат и размалывают. Способ твердофазного получения препарата отличается от вышеописанного тем, что после наработки биомассы в ферментере следует этап доращивания этой биомассы в течение 5-7 суток на твердом субстрате, в качестве которого выступает смесь вермикулита с отрубями, увлажненная раствором солей. В результате получают препарат с титром 1-5×10⁸ конидий/г в зависимости от способа получения. К недостаткам описанных способов можно отнести то, что получаемый в результате их осуществления продукт имеет ограниченные возможности для применения, в частности не предназначен для опрыскивания вегетирующих растений. Недостатком способа глубинного получения препарата также является исключение из состава препарата среды культивирования на этапе сепарирования, в результате чего продукт оказывается лишен ценных метаболитов гриба с росторегулирующими и фунгицидными свойствами. Недостатком способа твердофазного получения препарата является длительный период культивирования гриба сначала на жидком, а затем на твердом субстрате.

Известен самоконсервирующийся биопрепарат для защиты растений от болезней (варианты) и способ его получения (варианты) (Патент РФ №2380906, опубл. 10.02.2010). Способ получения заключается в том, что культивируют штамм гриба-антагониста родов Trichoderma или Gliocladium в жидкой среде и концентрируют полученную биомассу, отличающийся тем, что культивирование проводят в течение 20-48 часов до получения биомассы гриба в вегетативной форме, к концентрированной биомассе добавляют, по крайней мере, одно вещество, способствующее спорообразованию и обеспечивающее переход вегетативной формы грибов-антагонистов в споровую форму в ходе хранения препарата, которое осуществляют при доступе воздуха, в качестве которого используют органическую или неорганическую кислоту, создающую рН среды от 2,0 до 5,0, и/или ингибитор клеточного метаболизма, и/или сорбент. Недостатком указанного способа является то, что в процессе хранения препарат подвергается слабо контролируемым изменениям, в результате чего потребительские качества конечного продукта оказываются непредсказуемыми. Кроме того, неизвестен срок хранения до применения, требуемый для приобретения препаратом достаточного количества поверхностных конидий. Также не совсем понятна препаративная форма получаемого продукта, расходные нормы и способы применения.

Известен способ получения биологического средства для защиты растений от фитопатогенов и нематод на основе штамма гриба рода Trichoderma и биологическое средство, полученное способом (Патент РФ №2534213, опубл. 27.11.2014). Способ включает приготовление посевного материала штамма гриба рода Trichoderma, приготовление препарата в жидкой либо сыпучей форме на основе посевного материала, а также перемешивание препарата с минеральным, органическим или бактериальным удобрением, в результате чего получают биологическое средство. Получение биопрепарата в жидкой форме осуществляют либо с помощью глубинного культивирования гриба в ферментере, либо посредством смыва водой поверхностных конидий, полученных при твердофазном культивировании гриба. В первом случае недостатком способа является то, что получаемый продукт представляет собой смесь мицелия, покоящихся структур и метаболитов, что из-за присутствия мицелия ограничивает сроки хранения и возможности применения препарата. Получение жидкого препарата путем смыва поверхностных конидий, образуемых грибом при росте на твердом субстрате, нетехнологично. Вариант получения биопрепарата, предполагающий твердофазное получение культуры гриба, также не технологичен, поскольку предполагает наработку биомассы в емкостях типа стеклянных бутылей. Кроме того, получаемые по указанным вариантам способов продукты могут существенно отличаться по титру в зависимости от партии (разброс 10⁶-10⁹ КОЕ/мл), что не может не сказываться на эффективности их применения. Также указано, что для роста культур и эффективной реализации технического результата препарата на основе штаммов гриба рода Trichoderma необходимо использование в составе средства минеральных, органических и бактериальных удобрений, что ставит под сомнение эффективность самого штамма-продуцента.

Прототипом заявленного изобретения можно считать способ получения триходермина (Патент РФ №2035145, опубл. 20.05.1995) в жидкой форме путем глубинного культивирования микроскопических грибов Trichoderma lignorum на питательной среде, содержащей источники углерода, органического азота, фосфаты, сернокислый магний, азотнокислый аммоний и воду, до максимального накопления мицелиальной массы или спорообразования с последующим концентрированием культуральной жидкости до содержания сухих веществ 6-10% и введением в концентрат 4-10 мас. глицерина и 0,1-1,0 мас. полиэтиленоксида или 1-3 мас. поливинилпирролидона. Недостатком способа-прототипа является необходимость этапа концентрирования биомассы, в результате чего теряется часть питательной среды с биологически активными метаболитами гриба, наличие в получаемом продукте мицелия гриба, что существенно снижает срок хранения препарата и ограничивает способы его применения, а также необходимость добавления в препарат дорогостоящего компонента поливинилпирролидона.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения жидкого биопрепарата на основе представителя рода Trichoderma. Достигаемый технический результат - получение эффективного жидкого биопрепарата на основе штамма гриба Trichoderma, в котором практически отсутствует мицелий гриба, а действующим началом являются покоящиеся структуры - конидии, что улучшает потребительские качества и расширяет возможности его применения, так как в этом случае биопрепарат представляет собой мелкодисперсную суспензию, которую возможно применять в том числе для ручного и механизированного опрыскивания вегетирующих растений и пожнивных остатков, не опасаясь закупоривания форсунок опрыскивателей; кроме того, срок хранения биопрепарата увеличивается до 9 месяцев при температуре +4-+10°C.

Данный технический результат достигается тем, что в качестве действующего начала биопрепарата используется штамм Trichoderma asperellum OPF-19 (регистрационный номер ВКПМ: F-1323), культивирование которого осуществляют глубинным способом в ферментере, индуцируя в определенный момент образование конидий посредством усиления аэрации культуральной жидкости, доводят процесс до максимального выхода конидий и автолиза мицелия, после чего разливают препарат по канистрам, используя в качестве фильтра нейлоновую сетку с диаметром отверстий 0,2-0,5 мм.

Способ получения биопрепарата заключается в следующем. Первоначально культуру гриба выращивают в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре при 27°C в течение 7 суток. За это время T. asperellum OPF-19 формирует зрелые поверхностные конидии, полностью покрывающие скошенную поверхность среды, благодаря чему культуру можно использовать в качестве посевного материала в течение года при условии ее хранения при +4°C. Далее готовят маточную культуру, для чего в пробирку с посевным материалом наливают 8-10 мл стерильного физиологического раствора или стерильной воды, делают смыв и распределяют его по колбам с полусинтетической питательной средой следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 7, патока, или меласса, или гидрол, или солодовый экстракт - 20, NaNO₃ - 2, K₂HPO₄ - 1, MgSO₄ - 0,5, KCl - 0,5, FeSO₄ - 0,01, pH перед стерилизацией доводят до 7,5. Маточную культуру выращивают при 27°C на качалке с круговым типом перемешивания в течение 18-24 часов. За это время большая часть конидий прорастает, мицелий начинает активно развиваться, но уплотненных мицелиальных агрегатов не образуется. Затем маточной культурой засевают стартовый ферментер в количестве 10% от объема питательной среды, культивируют при 27°C, аэрации 0,6-0,8 л воздуха на 1 л питательной среды в минуту и скорости перемешивания 200 об/мин в 20-24 часов, не достигая максимального накопления биомассы и полного истощения источника углерода. После этого культуру переливают в следующий ферментер, объем которого больше объема предыдущего в 10 раз, в количестве 10% от объема питательной среды и культивируют таким же образом. Аналогичным образом поступают с культурой во всех промежуточных ферментерах в линии, вплоть до финишного ферментера, в котором скорость перемешивания в первые 20-24 часа поддерживается на уровне около 100 об/мин, а после первых 20-24 часов культивирования вначале увеличивают аэрацию до 1-1,2 л воздуха на 1 л питательной среды в минуту, индуцируя и поддерживая таким образом процесс конидиеобразования, а после истощения источника углерода увеличивают скорость перемешивания до 110-150 об/мин, что обеспечивает усиление механической фрагментации мицелия и способствует его автолизу. Более низкие скорости перемешивания в финишном ферментере связаны исключительно с конструкционными особенностями больших ферментеров объемом от 1 м³ и выше, которые определяют возможности их эксплуатации. Культивирование в таких условиях продолжают еще 50-55 часов до максимального накопления конидий и автолиза мицелия. Поскольку полного автолиза мицелия в культуре не происходит, в разливочный шланг помещается магистральный фильтр из нейлоновой сетки с диаметром отверстий 0,2-0,5 мм, которая эффективно задерживает остатки мицелия и позволяет разлить, не закупориваясь, не менее 3 м³ продукта. Поскольку препарат представляет собой суспензию конидий в культуральной жидкости, введение дополнительных компонентов для стабилизации биомассы или увеличения сроков хранения не требуется. При хранении препарата прорастания конидий не происходит, так как в культуральной жидкости не остается легкодоступных растворенных сахаров. Титр получаемого препарата составляет 1-3×10⁸ конидий/мл.

Эффективность получаемого по предлагаемому способу биопрепарата иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Испытания эффективности биопрепарата, полученного по предлагаемому способу, проводили в мелкоделяночном эксперименте на растениях ярового ячменя сорта Раушан в Лаишевском районе республики Татарстан на опытных полях ФГБНУ ТатНИИСХ в 2016 году. Схема обработки растений была следующей:

Оценивали эффективность биопрепарата против корневых гнилей растений на различных этапах вегетации, а также влияние на урожайность растений. Результаты представлены в таблице 1.

Приведенные результаты свидетельствуют об эффективности применения нового биопрепарата, полученного по предлагаемому способу, в качестве средства, сдерживающего развитие корневых гнилей ярового ячменя и повышающего его урожайность.

Пример 2.

Эффективность биопрепарата, полученного по предлагаемому способу, проверяли в мелкоделяночном опыте на кукурузе сорта Краснодарский 377 АМВ (F1) в Краснодарском крае на опытных полях ВНИИБЗР в 2016 году.

Схема обработки растений была следующей:

Оценивали влияние биопрепарата на урожайность и элементы структуры урожая. Результаты представлены в таблице 2.

Согласно приведенным данным биопрепарат на основе T. asperellum OPF-19, получаемый по предлагаемому способу, способствует существенному увеличению массы зерна кукурузы, обусловливая таким образом повышение урожайности данной культуры.